aula 5 Flashcards
O que é a imunofluorescência?
É uma técnica de imunohistoquímica que utiliza moléculas fluorescentes para visualizar antigénios em tecidos.
Qual o tipo de microscópio necessário na imunofluorescência?
Um microscópio especial com lâmpada que emite radiação UV entre 480-590 nm.
A imunofluorescência é uma forma de quê?
De luminescência, em que a emissão de luz é gerada por uma fonte de energia não térmica
Quem introduziu as técnicas de imunofluorescência e em que ano?
Albert Coons, em 1941.
O que é autofluorescência?
É a fluorescência natural que certos tecidos/orgãos apresentam sem modificação externa.
Exemplo de estrutura com autofluorescência natural?
A lâmina elástica das artérias.
O que é fluorescência secundária?
Fluorescência induzida por fluorocromos ligados a anticorpos contra antigénios tecidulares.
Por que se utiliza frequentemente tecido congelado na imunofluorescência?
porque o processo de fixação com o formaldeído e a parafina podem alterar os tecidos, induzir autofluorescência e bloquear antigénios.
Por que a imunofluorescência é pouco usada em diagnóstico de rotina?
as moléculas fluorescentes perdem atividade com o passar do tempo, não permitindo a conservação das lâminas em arquivo, e a contextualização tecidual e celular é limitada, sendo por isso pouco utilizadas neste contexto.
O que são fluorocromos?
Substâncias que absorvem radiação UV/luz visível e emitem energia na forma de fluorescência ou fosforescência.-libertação gradual de energia que se prolonga mesmo sem a fonte luminosa.
Dois principais fluorocromos usados na imunofluorescência?
Fluoresceína (FITC) e rodamina (TRITC).
O que faz o FITC (fluoresceína)?
A fluoresceína usa-se quase sempre sob a forma de isotiocianato (FITC), que absorve a luz azul e emite fluorescência verde
O que faz o TRITC (rodamina)?
usa-se na forma de isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC), absorvendo luz verde e emitindo fluorescência vermelha ~
Características ideais de um fluorocromo
A. Não deve interferir com a relação antigénio-anticorpo;
B. O seu armazenamento deverá ser estável;
C. Deverá encontrar-se disponível na sua forma purificada;
D. A sua emissão deverá ser máxima no espectro do visível;
E. O comprimento de onda da luz absorvida e da luz emitida devem ser muito diferentes para que possam diferenciar-se facilmente.
: Qual a importância de haver grande diferença entre os comprimentos de onda absorvido e emitido?
Para facilitar a distinção e detecção do sinal fluorescente.
Como se ligam os fluorocromos aos anticorpos?
Ligação covalente, sem alterar a especificidade do anticorpo.
O que permite a marcação múltipla?
Uso de anticorpos marcados com fluorocromos diferentes.
A que grupos se ligam os fluorocromos como FITC e TRITC nos anticorpos?
Ligam-se de forma covalente aos grupos amina e carboxilo dos anticorpos.
Em que condições de pH deve ocorrer a ligação entre fluorocromos e anticorpos?
Em pH alcalino.
Porque se devem usar moléculas purificadas ao conjugar fluorocromos com anticorpos?
Para evitar ligações inespecíficas a outras proteínas e falsas marcações.
Dá exemplos de substâncias promotoras de revelação utilizadas em imunomarcações.
Ouro coloidal (Au 20 nm, Au 5 nm + Ag), enzimas (HRP, AP, glucose oxidase, beta-D-galactosidase), e radioisótopos.
Que tipo de luz deve ter o microscópio de fluorescência?
Luz UV e visível.
Qual a função dos filtros primários e secundários no microscópio de fluorescência?
O filtro primário seleciona a luz de excitação; o secundário filtra a luz emitida pelas substâncias fluorescentes.
a fonte de luz pode ser oq
uma lâmpada de vapor de mercúrio a alta pressão ou uma lâmpada halogénea de quartzo
