9. Experimentální přístupy ve vývojové biologii Flashcards
Počátky experimentální vývojové biologie
- zhruba v 2. pol. 19. stol přechod od popisné embryologie sloužící hlavně ke studiu fylogeneze k formulování experimentálně testovatelných hypotéz o embryonálním vývoji jedince
- WILHELM ROUX (1850-1924) - pokusy na žábách - manipulace s blastomerami (horkou jehlou poničil 1 ze 2 blastomer -> 1 mrtvá + 1 embryo)
Požadavky na modelový organismus
a) BIOLOGICKÉ
- dostupnost, možnost chovu v laboratorních podmínkách
- dostatečně rychlý vývoj
- nekomplikovaný životní cyklus
- produkce většího množství potomků
- typický zástupce dané skupiny organismů
b) METODICKÉ
- možnost genetických manipulací (křížení, náhodná a cílená mutageneze, reverzní genetika)
- dostupnost sekvenčních dat
- možnost transgeneze
Modelové organismy
BEZOBRATLÍ - Nezmar - Hydra - Ploštěnky - Háďátko - Octomilka - Ježovky OBRATLOVCI - Drápatka - Xenopus laevis - Danio - Danio rerio - Kur - Gallus gallus - Myš - Mus musculus
Modelové organismy - Nezmar
= Hydra
- pouze 2 zárodečné listy
- vysoká regenerační schopnost - studium REGENERACE a KMENOVÝCH BUNĚK
- studium determinace tělních os - gradienty morfogenů
- jeden z nejprimitivnějších organismů - možnost studia evolučně nejkonzervovanějších vývojových mechanismů
Modelové organismy - Ploštěnky
- 3 zárodečné listy
- vysoká regenerační schopnost - studium REGENERACE
- systém kmenových buněk - vhodný systém pro studium vlastností KMENOVÝCH BUNĚK a buněčné diferenciace
Modelové organismy - Háďátko
= C. elegans
- volně žijící, nepatogenní
- v laboratorních podmínkách pěstovaní na agarových plotnách s bakteriemi
- generační doba 3-4 dny, produkce cca 250 potomků
- hermafrodité a samci - možnost křížení geneticky odlišných jedinců
- konstantní počet buněk
- část buněk během vývoje umírá apoptózou
- průhledné tělo, zmapovaný vývoj všech somatických buněk
Modelové organismy - Octomilka
- v přírodě nejčastěji na hnijícím ovoci
- v laboratoři v epruvetách na agarovém médiu se zdrojem cukru a dalších živin
- životní cyklus trvá v průměru 10-14 dní (závisí na teplotě)
- 2 pohlaví, samice může naklást přes 1 000 vajíček
- embryonální vývoj probíhá mimo rodičovský organismus
- dostupná velká sbírka mutuálních linií (uchovávají se v USA)
Modelové organismy - Drápatka
= Xenopus laevis
- rychlý embryonální vývoj, velká vajíčka vhodná pro manipulace
- možnost indukce plození během roku
- vývoj z oplozeného vajíčka v pulce během několika málo dní
- dosahuje pohlavní zralosti až po 2 letech (špatné pro studium pozdního vývoje)
- tetrapoidní, 18 chromozomů v haploidní sadě
- o dost větší než:
XENOPUS TROPICALIS
- diploidní, 10 chromozomů v haploidní sadě
- rychlejší vývoj - dosažení pohlavní zralosti již v 6 měsících
Modelové organismy - Danio
= Danio rerio
- rychlý embryonální vývoj mimo tělo matky (cca 3 dny od oplození po vylíhnutí), embrya jsou průhledná
- produkce velkého množství potomků
- pohlavní zralost dosaženo po 10-12 týdnech
- malý genom, dostupnost genetických nástrojů
- levnější model myši (alternativa pro studium obratlovců)
Modelové organismy - Kur
- velká vajíčka, embryonální vývoj lze pozorovat ,,okénkem’’ ve skořápce
- možnost manipulací s embryem (transplantační experimenty, značení a sledování buněk)
- embryonální vývoj trvá 20-21 dní
- komplexní genom (39 chromozomů)
- vhodný model např. pro somitogenezi, neurulaci, vývoj končetin, …
- cílená tvorba mutantních linií náročná, nicméně existuje velké množství plemen
Modelové organismy - Myš
- model nejbližší člověku
- březost cca 20 dní, v jednom vrhu v průměru 8 mláďat
- samice může mít několik vrhů do roka
- samice pohlavně dozrávají cca 6 týdnů po narození, samci cca po 8 týdnech
- 20 chromozomů v haploidní sadě
- nevýhodou finanční náročnost, embryonální vývoj v těle matky
Metodické přístupy - 2 typy
- ,,KLASICKÉ’’
- morfologická stránka vývoje, osud buněčných linií - POZOROVÁNÍ
- interakce mezi buňkami a tkáněmi, poziční informace, indukce - TRANSPLANTAČNÍ EXPERIMENTY - ,,MODERNÍ’’
- zaměřené na genetickou podstatu řízení vývoje
a) zajímá mě určitý proces a chci vědět, které geny ho řídí
- postup OD FENOTYPU KE GENOTYPU
- mutageneze, výběr organismů s určitým defektem, zpětné hledání genu zodpovědného za daný fenotyp (genetické mapování/sekvenace)
b) zajímá mě určitý gen a chci vědět jakou úlohu hraje ve vývoji
- postup OD GENOTYPU K FENOTYPU
- Ve které části těla je gen aktivní?
- Co se stane, když gen poškodím?
- Co se stane, když gen zapnu jindy/jinde než je fyziologické?
Metodické přístupy - ,,Moderní’’ - Od fenotypu ke genotypu
- specifikace anterio-posteriorní osy u D. melanogaster
- mutageneze, identifikace 15 genů s poškozením základní organizace A-P osy
- teprve mnohem později byly identifikovány geny zodpovědné za jednotlivé mutace
- tato jediná práce identifikovala většinu genů, které jsou za základní organizaci A-P osy odpovědně
Metodické přístupy - ,,Moderní’’ - Od genotypu k fenotypu - příprava transgenního organismu
- Určení exprese konkrétního genu:
-> in situ hybridizace
-> detekce exprese genu wnt3a u nezmara - exprese v hlavovém organizačním centru
PŘÍPRAVA TRANSGENNÍHO ORGANISMU: - in vitro příprava DNA vektoru, který obsahuje promotor studovaného genu a DNA pro marker, pomocí kterého lze expresi visualizovat (lacZ, barevné fluorescenční proteiny)
- podobný postup, pokud chceme studovaný protein exprimovat v jiné tkáni/jiném čase, než je fyziologické
- integrace vektoru do genomu je obvykle náhodná (poziční efekt)
- ES buňky s vloženým konstruktem vpravený do blastocysty
- blastocysty implantovány zpět do myši
- ES buňky dají náhodně vznik části tkání - vznik chimérních potomků
- výběr chimér, kde došlo k zapojení ES buněk do zárodečné linie
- křížením heterozygotů je získaná homozygotní linie
Metodické přístupy - ,,Moderní’’ - Od genotypu k fenotypu - Porušení exprese genu = knock-out
- vyřazení genu z funkce na úrovní genomové DNA
- využití homologní rekombinace k výměně funkčního genu za poškození
- u myši využití embryonálních kmenových buněk
- u jiných organismů: možnost využití např. transpozomů pro tvorbu cílených delecí
- ES buňky s vloženým konstruktem vpraveny do blastocysty
- blastocysty implantovány zpět do myši
- ES buňky dají náhodně vznik částí tkání - vznik chimérních potonmků
- výběr chimér, kde došlo k zapojení ES buněk do zárodečné linie
- křížením heterozygotů je získána homozygota
NEVÝHODA KO PŘÍSTUPU: - pokud je gen potřeba během časného vývoje
- KO vede k embryonální letalitě - a už není možné studovat funkci genu pozdějším vývoji
ŘEŠENÍ: - kondicionální (podmíněný KO) nebo RNA INTERFERENCI
Metodické přístupy - ,,Moderní’’ - Od genotypu k fenotypu - Porušení exprese genu - RNA INTERFERENCE
- Dvouvláknová RNA je rozpoznána enzymem DICER
- naštěpena na krátké dvouvláknové fragmenty
- fragmenty rozpoznány komplexem RISC
- antisense fragmenty se navážou na komplementární úseky mRNA
- takto navázané úseky dvouvláknové RNA jsou rozpoznány a rozštěpeny
- dojde k degradaci mRNA a tím k zabránění tvorby proteinů
- dvouvláknová nebo antisense RNA komplementární ke zkoumanému genu připravena in vitro
- injekcí vpravena do časného embryonálního stádia
- výsledný fenotyp kopíruje fenotyp vzniklý ,,klasickou’’ mutací
Metodické přístupy - Nové metody modifikace genomu
- editace genomu ,,na míru’’ (designer genome modifications)
- ZFN, TALEN, CRISPR/Cas9 systémy
- cílená mutageneze s vysokou přesností, systémy jsou adaptovatelné pro řadu modelových i nemodelových organismů
- zahajují novou éru vývojové biologie, umožňují testovat dosud netestovatelné hypotézy
Metodické přístupy - Nové metody modifikace genomu - ZFN
= Zinc Finger Nuclease
- principem je rozpoznání specifického trinukleotidu DNA vazebnou doménou označovanou jako zinkové prsty
- doménu je možné modifikovat tak, aby rozpoznávala různé trinukleotidy
- upravené domény je pak možné řetězit, aby rozpoznaly delší specifickou sekvenci (obvykle 9-18 nukleotidů)
- k DNA vazebné doméně je připojena FokI nukleáza, která zajistí štěpení DNA v místě rozpoznané sekvence
- FokI je aktivní jako dimer, jsou proto zapotřebí dvě ZFN, tím se zvyšuje specifita
- NEVÝHODA - navržení funkční ZFN není zcela triviální, jednotlivé ZF domény se mohou navzájem ovlivňovat
Metodické přístupy - Nové metody modifikace genomu - TALENs
= Transcriptional Activator-Like Effector Nucleases
- TALE proteiny: transkripční faktory z bakterie Xanthomonas
- obsahují repetice o délce 33-35 AMK, každá repetice rozpozná jednu bázi DNA
- za rozpoznání jsou zodpovědné 2 AMK v oblasti RVD (Repeat-Variable Di-residue)
- je možné uměle připravit protein s takovou kombinací TAL repetic, aby rozpoznával požadovanou sekvenci
- spojením s FokI nukleázou je možné generovat dvouvláknové zlomy v přesně definovaných pozicích v genomu
Metodické přístupy - Nové metody modifikace genomu - CRISPR/Cas9 - co to je, příprava mutantní myši, úspěšné aplikace
= Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats
- RNA-zavislá endonukleáza Cas9 pochází ze Streptococcus pyrogenes, kde je součástí obranného systému proti fágové infekci
- guide RNA (gRNA-CRISPR) obsahuje sekvenci komplementární k požadovanému místu zásahu do genomu, váže se na Cas9 nukleázu a navede ji k určitému místu). - Cas9 vytvoří v DNA dvouvláknový zlom
- při opravě DNA poškození může dojít ke vzniku mutace a k vyřazení daného genu z funkce
- oprava buď nepřesná -> non-homologous end joining (NHEJ) nebo podle templátu -> homology-directed repair (HDR), homologní rekombinace (HR)
- HR a HDR vyžaduje dodání templátu, umožňuje vnášet do genomu specifické modifikace (STOP kodon, specifická mutace, fluorescenční značka,…)
PŘÍPRAVA MUTANTNÍHO ORGANISMU POMOCÍ CRISPR/Cas9 - myš:
- metodou in vitro transkripce je připravena gRNA s požadovaným úsekem komplementárním k místu, kde chceme vytvořit mutaci
- in vitro připravena Cas9 mRNA, eventualně temtplát pro opravu
- gRNA, Cas9 mRNA a případný templát jsou injikovány do oplozených vajíček získaných buď metodou IVF nebo odebráním samice po spáření
- embrya jsou navrácena do pseudopregnantních samic, narozené potomstvo je pak podrobeno analýze na přítomnost mutace
- pozitivní jedinci jsou dála křížení
ÚSPĚŠNÉ APLIKACE
- KO genu Fgf10 u myši pomocí TALEN a CRISPR/Cas9 technologie (Fgf10 je nezbytný pro vývoj řady orgánů včetně končetin)
- kondicionální KO genu NOTCH v křídle Drosophily (Delta/Notch signalizace se podílí na ustavení a stabilizaci dorzoventrální hranice během vývoje křídla)
