κ3.2 Flashcards
6) Ποιοι άλλοι φορείς κλωνοποίησης υπάρχουν εκτός απ΄τα πλασμίδια ?
- Μεταγωγοί βακτηριοφάγοι (transducing bacteriophages)
- Τεχνητά χρωμοσώματα βακτηρίων (Bacterial Artificial Chromosomes, BAC)
- Τεχνητά χρωμοσώματα ζύμης (Yeast Artificial Chromosomes, YAC
- Κοσμίδια
7) Τι γνωρίζεται για τους μεταγωγούς βακτηριοφάγους
Οι βακτηριοφάγοι μπορούν να μεταφέρουν τμήματα βακτηριακού DNA από ένα κύτταρο σε άλλο μέσω της διαδικασίας της μεταγωγής.
Ενσωμάτωση DNA: Το DNA του φάγου ενσωματώνεται στο γονιδίωμα του βακτηρίου-ξενιστή.
Εκτομή DNA: Εάν η εκτομή του DNA του φάγου από το βακτηριακό γονιδίωμα δεν είναι ακριβής, ο φάγος μπορεί να “πάρει” μαζί του τμήμα του DNA του βακτηρίου.
Μεταφορά γενετικού υλικού: Κατά την επόμενη μόλυνση, ο φάγος μεταφέρει το DNA αυτό σε ένα νέο βακτηριακό κύτταρο.
Η μεταγωγή έχει χρησιμοποιηθεί για τη χαρτογράφηση γονιδίων (βιβλιοθήκες), ενώ οι βακτηριοφάγοι, όπως ο φάγος λ (lambda), επιτρέπουν την κλωνοποίηση μεγαλύτερων τμημάτων DNA σε σχέση με τα πλασμίδια. Ωστόσο, υπάρχει όριο στο μέγεθος του DNA που μπορεί να συσκευαστεί στο πρωτεϊνικό περίβλημα του φάγου.
Τι γνωρίζεται για τον βακτηριοφάγο λ?
Κύρια χαρακτηριστικά του βακτηριοφάγου λ
- Μορφολογία και DNA:
Γραμμικό, δίκλωνο DNA, περίπου 50 kb.
Συμπληρωματικά άκρα με διαμόρφωση cos.
Γίνεται κυκλικό μέσα στο E. coli και αντιγράφεται.
- Δυνατότητες κλωνοποίησης:
Μέγιστο DNA που μπορεί να κλωνοποιηθεί: 25 kb.
Έως το 1/3 του DNA του μπορεί να αντικατασταθεί με ξένο DNA.
Παράλληλα, διατηρεί τις λυτικές του ικανότητες στον λυσογενετικό κύκλο.
- Πακετάρισμα και μόλυνση:
Το DNA πακετάρεται στην κεφαλή του καψιδίου in vitro με μεγάλη επιτυχία.
Οι ανασυνδυασμένοι φάγοι έχουν την ίδια ικανότητα μόλυνσης.
- Ειδικά χαρακτηριστικά:
Διαθέτει συγκεκριμένες θέσεις περιορισμού για αποκοπή και εισαγωγή DNA.
Είναι σταθερός και ευρέως χρησιμοποιούμενος για χαρτογράφηση γονιδίων.
Σε ποιες κατηγορίες χωρίζεται ο βακτηριοφάγος λ και ποια απ΄τις δυο είναι πιο κατάλληλη για τη χρήση γονιδιωματικής βιβλιοθήκης ?
- λ φορείς ένθεσης: Η κλωνοποίηση γίνεται σε ένα σημείο
- λ φορείς αντικατάστασης: Συνήθως έχουν δύο θέσεις αναγνώρισης κάποιου ενζύμου περιορισμού, οπότε αντικαθίσταται κάποιο τμήμα του DNA τους
Με βάση αυτη τη παρουσίαση σελίδα 13 οι πιο ιδανικοί φορείς για γονιδιωματική βιβλιοθήκη είναι οι λ φορείς αντικατάστασης
Τι γνωρίζεται για τη τεχνολογία gateaway?
Η τεχνολογία Gateway είναι μια μέθοδος αναδιάταξης γενετικού υλικού ανάμεσα σε πλασμιδιακούς φορείς, που βασίζεται στον ανασυνδυασμό του βακτηριοφάγου λ.
- Αρχή λειτουργίας:
Τα γονίδια μεταφέρονται από έναν φορέα έκφρασης σε άλλον, διατηρώντας την κατεύθυνση μεταγραφής (5’ → 3’) και το σωστό αναγνωστικό πλαίσιο.
Δεν χρησιμοποιούνται ένζυμα περιορισμού και λιγάση, αλλά ανασυνδυασμός ειδικός σε θέση.
- Θέσεις att:
attB: Στο βακτηριακό χρωμόσωμα.
attP: Στο ιικό DNA.
Ο ανασυνδυασμός attB με attP ενσωματώνει το DNA του φάγου στο χρωμόσωμα, δημιουργώντας τις θέσεις attL και attR.
- Αντιδράσεις:
BP αντίδραση: Δημιουργεί τον αρχικό κλώνο (κλώνος εισόδου).
LR αντίδραση: Δημιουργεί τον τελικό κλώνο (φορέας προορισμού).
- Πλεονεκτήματα:
Διατήρηση κατεύθυνσης και αναγνωστικού πλαισίου χωρίς ανάγκη επιβεβαίωσης αλληλουχίας.
Απλή και ακριβής διαδικασία.
