10. Kapalinová chromatografie, kapilární elektroforéza Flashcards
Kapalinová adsorpční chromatografie (LSC)
- chromatografie s normálními fázemi
- adsorpce látek z MF na povrch SF
- různá distribuční konstanta = různá rychlost pohybu
- eluce v pořadí stoupající polarity = polární látky více zadržovány
- MF = nepolární/slabě polární rozpouštědla, s rostoucí polaritou roste eluční síla; binární eluenty (hexan+ether)
- SF = silně polární adsorbenty, aktivace ohřevem (uvolnění nasorbované vlhkosti)
Izokratická X gradientová eluce
- izokratická = složení MF se nemění
- gradientová = složení MF se plynule mění
Kapalinová rozdělovací chromatografie (LLC)
- chromatografie s obrácenými fázemi
- distribuce látek mezi kapalnou MF a kapalnou SF nanesenou na povrchu tuhých částic na základě rozdílných rozpustností
- MF a SF musí být dokonale nemísitelné, SF chemicky vázaná, musí být odlišných polarit
- SF = nepolární; modifikovaný silikagel, silikagel+dimethylalkylchlorsilan, oktadecyl, nitrily, dioly, aminy
- MF = polární rozpouštědla, H2O, CH3-CN, C4H8O
- eluce v pořadí klesající polarity, nejvíce zadržované jsou alkany
- pH může ovlivnit změny kapacitních poměrů
Instrumentace LC
- odplynění (filtrace) MF = probublání He
- vysokotlaká čerpadla = regulace konst. průtoku MF
- lineární dávkovač = píst tlačen servomotorem
- kolony = náplňové, rovná trubice z tvrzeného skla
- detektory = optické (diferenciální refraktometrický, spektrofotometrický, fluorimetrický), elektrochemické (voltametrické, vodivostní, amperometický) - vysoká citlivost, rychlost, dynamický rozsah
Tenkovrstvá chromatografie (TLC)
- pracující v tenké vrstvě, nikoliv ve sloupci
- MF vzlíná kapilárními silami, volba jako v LC
- SF = silikagel, alumina, celuloza - tenká vrstva na desce
- umožnění detekce i zadržených složek, rychlejší
- detekce skvrn selektivní (ninhydrin, UV lampa) a neselektivní (H2SO4, I2)
Gelová permeační chromatografie (GPC)
= mechanické dělení molekul podle jejich velikosti
- SF = kulové částice s definovatelnou velikostí pórů; silikagel, polystyren, Sephadex (dextran)
- MF = voda+tlumič (separace částic s nábojem), voda (separace bez náboje), org rozpouštědla (toluen)
- stanovení molekulové hmotnosti, pro skupinové separace, analýzu vazeb ligandů na biopolymer
Iontově výměnná chromatografie (IEC)
= separace iontů na ionexu
- SF = nosič (silikagel) s navázanými iontovými skupinami (anexy, katexy)
- MF = vodné roztoky kyselin, zásad, solí, pufrů
- kolona musí být kondiciována (nasycení SF protiiontem), promytí kolony pufrem, nanesení vzorku, eluce roztokem protiiontu
- retence ovlivněna afinitou iontu k vazebnému místu a koncentrací protiiontu v MF
- detekce: fotometricky
Elektromigrační metody
= separace na základě migrace iontů v elektrickém poli a na základě rozdílů v pohyblivosti částic
- elektroforéza = separace na základě rozdílné rychlosti migrace
- izotachoforéza = separace na základě různých energií nutné pro dosažení dané rychlosti
Gelová elektroforéza
= porovnání délky dráhy analytu s dráhou standardů
- pufr zajišťuje el. vodivost a stabilitu pH
- detekce vybarvením skvrn
- gel: polyakrylamid, agarosa, škrob
Kapilární elektroforéza
- kapilára = polyimidová vrstva plněná pufrem
- detekce jako LC, spektrofotometrická nebo vodivostní
- rychlá separace
- vzorek: biochemický (AK, bílkoviny, NuK), anorg. aniotny a kationty
- pohyb iontů migrací nebo elektroosmotickým tokem (vyvolává hydrodynamické proudění elektrolytu i složek vzorku ke katodě)
Hydrodynamický X elektroosmotický tok
Hydrostatický tok je typický pro klasické proudění kapalin, je poháněn kompresorem/tlakem v kapiláře.
Elektroosmotický tok způsobuje pohyb kapaliny v tenké kapiláře, ve směru od anody ke katodě v důsledku ionizace křemenné stěny kapiláry. Poháněn napětím.
