Основы Фарм БТ (Прищеп) Flashcards

Question

Строение белков

Answer 1

Длина белковых молекул варьирует от 40 до 1000 аминокислотных остатков; в зависимости от их последовательности и аминокислотного состава молекулы белков принимают разную форму (конфигурацию, конформацию). Многие функционально активные белки состоят из двух и более полипептидных цепей, как идентичных, так и несколько различающихся. Белки, выполняющие ключевые функции, представляют собой сложные белковые комплексы, состоящие из множества разных полипептидных цепей - субъединиц.

Answer 2

С помощью генетического кода полинуклеотидная последовательность определяет последовательность аминокислот в белке; различные триплеты нуклеотидов кодируют специфические аминокислоты. Важное «передаточное звено» при переводе генетической информации с языка нуклеотидов на язык аминокислот - РНК (рибонуклеиновые кислоты), которые синтезируются на определенных участках ДНК, как на матрицах, в соответствии с их нуклеотидной последовательностью. Молекулы РНК несут информацию, они обладают химической индивидуальностью, влияющей на их поведение. Молекула РНК обладает двумя важными свойствами: закодированная в её нуклеотидной последовательности информация передаётся в процессе репликации, а уникальная пространственная структура определяет характер взаимодействия с другими молекулами и реакцию на внешние условия. Оба этих свойства - информационное и функциональное - являются необходимыми предпосылками эволюционного процесса. Нуклеотидная последовательность молекулы РНК аналогична наследственной информации, или генотипу организма. Пространственная укладка аналогична фенотипу - совокупности признаков организма, подверженного действию естественного отбора.

Answer 3

РНК (рис. 5) — линейная полинуклеотидная молекула, отличающаяся от ДНК по двум параметрам: 1. Моносахаридом в РНК является рибоза, содержащая не одну а две гидроксильные группы; 2. Одним из четырех оснований в РНК является урацил, занимающий место тимина. Существование РНК в виде одной нити

Answer 4

отсутствием у всех клеточных организмов фермента для катализа реакции образования РНК на матрице РНК; такой фермент есть лишь у некоторых вирусов, гены которых «записаны» в виде двухнитчатой РНК, остальные организмы могут синтезировать молекулы РНК только на ДНК-матрице; из-за отсутствия метильной группы у урацила связь между аде-нином и урацилом малоустойчива и «удержание» второй (комплементарной) нити для РНК является проблемным. По причине однонитчатости РНК, в отличие от ДНК, не закручивается в спираль, а образует структуры в виде «шпилек», «петель». Спаривание оснований в молекуле РНК происходит таким же образом, как и в ДНК, за исключением того, что вместо пары А-Т, образуется А-U Комплементарные основания, как и в ДНК, соединены между собой водородными связями.

Answer 5

информационная (мРНК); рибосомная (рРНК); транспортная (тРНК).

Answer 6

Правильность транскрипции, т.е. ее начало и завершение в нужных сайтах (специфических участках), обеспечивают специфические нук- -леотидные последовательности в ДНК, а также белковые факторы. Транскрипция на ДНК осуществляется в клеточном ядре. Молекулы мРНК переносят информацию из ядра в цитоплазму, где она используется при трансляции белков, аминокислотные последовательности которых закодированы в последовательностях нуклеотидов мРНК (т.е., в конечном счете, в ДНК). мРНК связана с рибосомами, в которых осуществляется соединение аминокислот с образованием белков.

Answer 7

Рибосомы - нуклеотидные частицы, в состав которых входит высокополимерная РНК и структурный белок. Биохимическая роль рибосом - синтез белка. Именно на рибосомах происходит соединение отдельных аминокислот в полипептиды, завершающееся образованием белков.

Answer 8

У большинства прокариот транскрипция всех РНК осуществляется с участием одной и той же РНК-полимеразы. У эукариот мРНК, рРНК, тРНК транскрибируются разными РНК-полимеразами.

Answer 9

С генетической точки зрения ген представляет собой специфическую нуклеотидную последовательность, траскрибируемую в РНК. Большинство транскрибируемых последовательностей ДНК составляют структурные гены, на которых синтезируется мРНК. Конечным продуктом структурного гена является белок. У прокариот структурный ген представляет собой непрерывный участок молекулы ДНК. У эукариот большинство структурных генов состоит из нескольких дискретных (отдельных) кодирующих областей — экзонов, разделенных некоди-рующими областями - нитронами. По завершении транскрипции эука-риотического структурного гена интроны вырезаются ферментами из первичного продукта транскрипции, экзоны сшиваются друг с другом «торец в торец» (сплайсинг) с образованием мРНК. Обычно длина экзонов составляет от 150 до 200 нуклеотидов, длина интронов варьирует от 40 до 10000 нуклеотидов.

Answer 10

В активно функционирующей клетке примерно 3-5% суммарной РНК приходится на долю мРНК, 90% — на долю рРНК, 4% — на долю тРНК. мРНК может быть представлена десятками различных типов молекул; рРНК - двумя типами, которые объединяются в рибосомы. Помимо тысяч рибосом в клетке, активно синтезирующей белки, содержится до 60 различных видов тРНК.

Answer 11

Более крупная рРНК образует с белками рибонуклеотидный комплекс, называемый большой рибосомной субъединицей. рРНК меньшего размера — комплекс, называемый малой ри-босомальной субъединицей. При синтезе белков субъединицы объединяются с образованием рибосомы. рРНК принадлежит роль главного катализатора в процессе синтеза белка, она составляет более 60% массы рибосомы. В эволюционном аспекте рРНК представляет собой основной компонент рибосомы.

Answer 12

тРНК - это линейная одноце-почечная молекула длиной от 75 до 93 нуклеотидов, имеющая несколько взаимно комплементарных участков, спаривающихся между собой. С помощью специфических ферментов (аминоацил-тРНК-синтетаз) к 3'-концу тРНК присоединяется соответствующая аминокислота. Для каждой из 20-ти аминокислот, из которых состоят все белки, существует, по крайней мере, одна специфическая тРНК. На другом конце молекул тРНК расположена последовательность из трех нуклеотидов, называемая антикодоном, она распознает специфический кадок в мРНК и определяет, какая аминокислота будет присоединена к растущей полипептидной цепи.

Answer 13

Трансляция (синтез белка) осуществляется при участии мРНК, разных тРНК, «нагруженных» соответствующими аминокислотами, рибосом и множества белковых факторов, обеспечивающих инициацию, элонгацию, терминацию синтеза полипептидной цепи. Нуклеотидная последовательность, в которой закодировано более одного белка, называется опероном. Оперон находится под контролем единственного промотора, и при его транскрипции образуется одна длинная молекула мРНК, кодирующая несколько белков. Синтез мРНК и соответственно синтез белка строго регулируется, так как у клетки недостаточно ресурсов для одновременной транскрипции и трансляции всех структурных генов. Про- и эукариоты постоянно синтезируют только те мРНК, которые необходимы для выполнения основных клеточных функций. Экспрессия остальных структурных генов осуществляется под строгим контролем регуляторных систем, запускающих транскрипцию только в случае возникновения потребности в определенных белках. За включение и выключение транскрипции отвечают дополнительные факторы транскрипции, которые связываются с соответствующими участками ДНК.

Answer 14

При синтезе белковых молекул первичной стадией образования полипептидной цепи белка является процесс активации аминокислот с помощью аденозинтрифосфата. Процесс активации идет при участии ферментов, в результате чего образуются аминоациладенилаты. Затем под действием фермента аминоацил-тРНК-синтетазы (для каждой из 20 аминокислот имеется свой особый фермент) «активированная» аминокислота соединяется с тРНК. Далее комплекс аминоацил-тРНК переносится на рибосомы, где происходит синтез полипептида. Пептидная связь образуется между карбоксильной группой одной аминокислоты и аминогруппой другой. Первая аминокислота белковой молекулы имеет свободную аминогруппу (N-конец), последняя - свободную карбоксильную группу (С-конец). Сформировавшиеся белки освобождаются из рибосом, а рибосомы после этого могут присоединять новые комплексы аминоацил-тРНК и синтезировать новые белковые молекулы. Рибосомы связаны с мРНК, которая определяет последовательность чередования аминокислот в полипептидных цепочках. Таким образом, целостность и функциональная активность рибосом в клетках - одно из необходимых условий синтеза белковых молекул.

Answer 15

Технология рекомбинантных ДНК (также молекулярное клонирование, или генная инженерия) - это совокупность экспериментальных процедур, позволяющих осуществлять перенос генетического материала (ДНК) из одного организма в другой. В настоящее время можно вырезать отдельные участки ДНК, получать нуклеотиды на ДНК-синтезаторах (приборах для автоматического химического синтеза ДНК) практически в неограниченном количестве, определять последовательность нуклеотидов (разделяя, секвенируя их) сотнями в сутки, изменять выделенный ген, вводить его вновь в геном культивируемых клеток или эмбриона животного, где этот измененный ген начинает функционировать. Эксперименты с рекомбинантными ДНК используют крупномасштабно в промышленном производстве БАВ.

Answer 16

1. Рестриктазное расщепление из организма-донора нужных генов нативной ДНК (клонируемая ДНК, встраиваемая ДНК, ДНК-мишень, чужеродная ДНК). 2. Быстрая расшифровка всех нуклеотидов в очищенном фрагменте ДНК, позволяющая определить точные границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую геном. 3. Обработка рестрикционными эндонуклеазами вектора для клонирования, который может реплицироваться в клетке-хозяине. 4. Сшивание ДНК-лигазой двух фрагментов ДНК с образованием новой рекомбинантной молекулы - конструкция «клонирующий вектор - встроенная ДНК». 5. Введение этой конструкции в клетку хозяина (реципиента), где она реплицируется и передается потомкам. Этот процесс называется трансформацией. После трансформации бактериальная клетка воспроизводит фрагмент клонируемой ДНК миллионами идентичных клеток. 6. Идентификация и отбор клеток, несущих рекомбинантную ДНК (трансформированные клетки). 7. Получение специфичного белкового продукта, синтезированного клетками-хозяевами (рис. 6).

Answer 17

Конструирование рекомбинантных молекул осуществляется с помощью ряда ферментов — обязательного и незаменимого инструмента практически всех этапов этого сложного процесса, прежде всего ферментов рестрикции (рестрицирующих эндонуклеаз, рестриктаз). Рест-риктазы являются составной частью системы рестрикции — модификации прокариотических клеток. Эта система связана с защитой клеток от проникновения чужеродной ДНК. Система модификации осуществляет метилирование собственной ДНК в сайтах ее узнавания немедленно после репликации; чужеродную ДНК, проникающую в клетку, бактерии гидролизуют с помощью рестриктаз. В настоящее время используется свыше 400 различных рестриктаз. Эти ферменты синтезируют самые разнообразные микроорганизмы. Для их культивирования необходимы оптимальные условия (температура, состав и рН среды, концентрация кислорода и т.д.). С целью повышения продуктивности и стандартизации процесса получения этих ферментов клонируют гены рестрицирующих эндонуклеаз в Е. соli.

Answer 18

Различают три основных класса рестриктаз. Рестриктазы класса I разрывают молекулы ДНК в произвольных точках, рестриктазы I и III классов обладают метилирующей и эндонуклеазной активностью. Ферменты II класса, которые и используются в генной инженерии, состоят из двух отдельных белков: рестрикционной эндонуклеазы и модифицирующей метилазы.

Answer 19

Рестриктазы узнают и расщепляют специфические нуклеотидные последовательности в двухцепочечной молекуле ДНК. При молекулярном клонировании важно, чтобы расщепление донорной и векторной ДНК происходило в строго определенных участках (сайтах). Каждый фермент рестрицирующих эндонуклеаз «опознает» в ДНК специфическую последовательность из 4-6 нуклеотидов. Многие рестрицирующие эндонуклеазы вносят разрывы в две цепи ДНК со смещением на несколько нуклеотидов, располагаясь наискось друг от друга. Б результате образуются одноцепочечные комплементарные концы с «хвостами» из 4-х нуклеотидов в каждом («липкие» концы). Кроме рестриктаз, расщепляющих нуклеотидную цепь с образованием липких концов, существуют рестриктазы, вносящие разрывы в цепи строго друг против друга с образованием ДНК с «тупыми концами». Одних ферментов рестрикции при молекулярном клонировании недостаточно, так как водородные связи между теми четырьмя основаниями, которые образуют липкие концы, не столь прочны, чтобы удержать два объединившихся фрагмента ДНК. Для устранения разрыва в сахарофосфатном остове молекулы служит фермент ДНК-лигаза, катализирующий образование фосфодиэфирных связей между концами по-линуклеотидных цепей, которые удерживаются вместе при спаривании липких концов. ДНК-лигаза сшивает и тупые концы. Таким образом, одна часть рекомбинантной молекулы ДНК несет нужный ген, который предполагается клонировать, другая — содержит информацию, необходимую для репликации в клетке рекомбинантной ДНК. Кроме того, при ДНК-рестрикции образуются разнообразные фрагменты и после их лигирования (соединения фосфодиэфирной связью) с векторной ДНК появляется множество различных комбинаций фрагментов, например, объединяющих между собой фрагменты донорной ДНК и векторные ДНК. Для уменьшения количества последних рестрицированную векторную ДНК обрабатывают щелочной фосфатазой.

Answer 20

Для введения рекомбинантной ДНК применяют два основных вектора: 1) Плазмиды. 2) Бактериофаги. Плазмиды представляют собой внехромосомный генетический элемент в виде кольцевых молекул ДНК, содержащих 1-3% генома бактериальной клетки. Плазмиды есть у всех бактерий. Одни из них содержат информацию, обеспечивающую их собственный перенос из одной клетки в другую (Р-плазмиды), другие - несут гены устойчивости к антибиотикам (R-плазмиды) или специфические наборы генов, ответственных за утилизацию метаболитов (плазмиды деградации). Каждая плазмида содержит сайт начала репликации, без которого репликация плазмиды в клетке-хозяине невозможна. Если две или более плазмиды не могут сосуществовать в одной и той же клетке — они принадлежат к одной группе несовместимости. Плазмиды, относящиеся к разным группам несовместимости, беспрепятственно существуют в одной клетке независимо от числа копий. У некоторых микроорганизмов в одной клетке обнаружено до 10 разных плазмид, каждая из которых выполняла свои функции и относилась к своей группе несовместимости. Репликация плазмид идет независимо от репликации хромосом. Количество копий определяется регуляторной системой клетки. Таким образом, плазмиды обладают свойствами, позволяющими использовать их в качестве вектора для переноса клонируемой ДНК. Бактериальный клон, содержащий такую плазмиду, можно сравнить с фабрикой по производству этого фрагмента.

Answer 21

Плазмидные векторы, как правило, создают методом генной инженерии, так как природные (немодифицированные) плазмиды лишены ряда обязательных для «высококачественного вектора» свойств: • небольшого размера, так как эффективность переноса экзогенной ДНК в Е. соli снижается при длине плазмиды более 15 тысяч пар нуклеотидов; • наличия сайта рестрикции, в который осуществлена вставка; • наличия одного или более селективных генетических маркеров для идентификации реципиентных клеток, несущих рекомби-нантную ДНК. Вводят плазмиды в соматические клетки с помощью химических реагентов, повышающих проницаемость клеточной оболочки. В частности, чтобы обеспечить проникновение в клетки плазмидной ДНК, их обрабатывают ледяным раствором кальция хлорида, затем выдерживают при 42 °С в течение 1,5 мин. Эта обработка приводит к локальному разрушению клеточной стенки. Максимальная частота трансформации - 10 , т.е. на каждую тысячу клеток приходится одна трансформированная. Частота трансформации не бывает 100%-й, затем используют схемы отбора, позволяющие идентифицировать трансформированные клетки. В качестве маркеров плазмида может содержать гены, определяющие устойчивость бактерии к антибиотикам. Вставка чужеродного (до-норного) гена в маркерный ген приводит к инактивации последнего. Это позволяет отличать трансформированные клетки, получившие векторную плазмиду (утратившие устойчивость к антибиотику), от клеток, получивших рекомбинантную молекулу (сохранивших устойчивость к одному, но утративших устойчивость к другому антибиотику). Этот прием называется инактивацией маркера вставки. Для отбора трансформированных клеток, содержащих рекомбинантную ДНК (гибридную плазмиду), проводят тестирование на рези-стентность к определенным антибиотикам. Например, клетки, несущие гибридную плазмиду, устойчивы к ампициллину, но чувствительны к тетрациклину (в маркерный ген которого и внедрена донорная ДНК).

Answer 22

Процесс разделения геномной ДНК на клонируемые элементы и введения этих элементов в клетки-хозяева называется созданием геномной библиотеки (банка клонов, банка генов).

Answer 23

Все системы клонирования должны отвечать двум основным требованиям: 1)Наличию нескольких сайтов для клонирования; 2) Возможности достаточно простой идентификации клеток с ре-комбинантными ДНК.

Answer 24

Для всех рутинных процедур молекулярного клонирования широко используется Е. соli в качестве клетки-хозяина. Клетки, способные поглощать чужеродную ДНК, называются компетентными; компетентность Е.соli повышают, используя специальные условия культивирования. Для получения больших количеств чужеродных белков с помощью рекомбинантных штаммов Е. соli была сконструирована плазмида, содержащая сильный промотор, селективный маркерный ген и короткий участок с несколькими уникальными сайтами для рестрицирующих ферментов - полилинкер.

Answer 25

Эффективными методами трансформации Е. соН плазмидами является электропорация (воздействие на клеточные мембраны электрическим током для увеличения их проницаемости). Для введения клонированных генов в соматические клетки также применяют микроинъекции и микроукалывания или слияние с клеткой нагруженных ДНК мембранных везикул (липосом).

Answer 26

Использование бактериофагов в качестве носителей генетической информации основано на том, что рекомбинантный ген встраивается в геном вируса и в последующем реплицируется с генами вируса при размножении в инфицированной клетке-хозяина. С этой целью применяют бактериофаг ^.-вирус с двухцепочечной ДНК, которая после проникновения в клетку смыкается в кольцо. Бактериофаг М-13 - вирус нитевидной формы с кольцевой замкнутой ДНК, которая в клетке превращается в двухцепочечную и реплицируется в клетках-потомках. В поисках эукариотических систем экспрессии, для получения биологически активных белков, созданы бакмиды - экспрессирующие векторы на основе бакуловирусов для Е. соН и клеток насекомых. Выход рекомбинантных бакуловирусов в такой системе повысился до 99%. Клетки насекомого, инфицированные бакуловирусами, синтезировали гетероло-гичный белок. Векторы на основе фага удобны для создания клонеток (банка генов), но не для тонких манипуляций с фрагментом ДНК. Для детального изучения и преобразования фрагменты ДНК переклонируют в плазмиды. Кроме указанных векторов в генной инженерии применяют косми-ды - плазмиды, несущие соs-участок (комплементарные липкие концы) ДНК фага X. Наличие соs-участка позволяет производить упаковку ДНК в головку фага in vitro, что обеспечивает возможность их введения в клетку путем инфекции, а не трансформации. Фазмиды - гибриды между фагами и плазмидами - способны развиваться как фаг и как плаз-мида. Уступая космидам по клонирующей емкости, фазмиды дают возможность отказаться от переклонирования генов из фаговых в плазмид-ные векторы.

Answer 27

Таким образом, для получения любого белкового продукта необходимо обеспечить правильную транскрипцию кодирующего его гена и трансляцию соответствующей мРНК. Для инициации транскрипции (синтеза РНК) в нужном сайте необходим промотор, для ее остановки -терминирующий кодон. Для синтеза разнообразных белков, кодируемых клонированными генами, интенсивно используют обычные дрожжи S. сегеvisiае; генетика этих одноклеточных организмов хорошо изучена. Рекомбинантные белки, синтезированные в системах экспрессии S. сегеvisiае, применяют в качестве вакцин и лекарственных препаратов Придавать новые свойства существующим белкам, создавать уникальные ферменты возможно, производя специфические изменения с помощью плазмид или ПЦР. Клонированные гены позволяют получать белки, содержащие нужные аминокислоты в заданных сайтах. Внесение специфических изменений в кодирующие последовательности ДНК, приводящие к определенным изменениям в аминокислотных последовательностях, называется направленным мутагенезом.

Answer 28

Основу промышленного производства продуктов биосинтеза составляет единая биотехнологическая система (БТС), которая включает основные компоненты, взаимодействующие между собой в определенном режиме посредством соответствующей аппаратуры. К определяющим факторам биотехнологического процесса относят: вид используемого биотехнологического процесса; субстрат с его биохимическими и биофизическими характеристиками; аппаратурное оформление, включая систему контроля управления; технологический режим; соответствие требованиям gmp. Для получения коммерческих препаратов с помощью рекомбинантных микроорганизмов необходимо сотрудничество специалистов двух областей — молекулярных биологов и биотехнологов. Задача молекулярных биологов - идентификация, изучение свойств, модификация нужных генов, создание эффективных систем их экспрессии в клетках микроорганизмов, используемых для промышленного синтеза соответствующего продукта. Задача биотехнологов - обеспечить условия оптимального роста рекомбинантного микроорганизма с целью получения целевого продукта с наибольшим выходом.

Answer 29

1. Приготовление и стерилизацию питательных сред; 2. Приготовление посевного материала; 3. Культивирование; 4. Обработку культуральной жидкости; 5.Выделение и очистку биопрепарата; 6. Получение готовой продукции.

Answer 30

Состав питательной среды должен быть оптимальным, так как это определяет размножение, рост микроорганизмов и синтез различных БАВ. Питательные среды могут быть сложными, включающими до 50 компонентов и более, и достаточно простыми, содержащими не более 5 компонентов. Назначение питательных сред: поддержание оптимальных для роста клеток физико-химических условий (рН, еН, рО2, рСО2, и т.д.); обеспечение клеток питательными веществами для синтеза биомассы и других продуктов жизнедеятельности. Понятие «среда для культивирования» включает не только определенный качественный и количественный состав компонентов или отдельных элементов, необходимых для конструктивного и энергетического обмена организма (источники азота, углерода, фосфора, ряда микроэлементов, витамины, ростовые вещества), но и физико-химические и физиологические факторы (кислотность, окислительно-восстановительный потенциал, температура, аэрация и др.). Все эти факторы играют существенную роль в развитии микроорганизмов и в проявлении ими отдельных физиологических и биохимических функций. Обычно изменение одного из этих факторов среды влечет изменение других. Значительного повышения выхода нужного продукта, образуемого микроорганизмами, достигают, используя методы математического расчета соотношения компонентов субстрата и их свойства. Питательные среды принято делить на две группы: 1) среды, требующие внесения 5-20% природных сывороток (из крови человека или эмбриональных экстрактов крупного рогатого скота); 2) синтетические химические среды определённого состава.

Answer 31

Основу питательных сред составляют смеси аминокислот, пуринов, пиримидинов, участвующих в синтезе белков и нуклеиновых кислот. Сыворотки (эмбриональная сыворотка крови, лошадиная сыворотка или очищенный экстракт куриных эмбрионов), их высокомолекулярные фракции (а-, Р-глобулины) предохраняют клетки от повреждения и стимулируют синтез ДНК. Синтез последних индуцируют и ростовые факторы (митогены) - вещества пептидной природы. В качестве источника углерода и энергии используется глюкоза или ее комбинации с аспарагиновой или молочной кислотами. Для развития микроорганизмов необходимы витамины жиро- и водорастворимые. Жизнедеятельность микроорганизмов невозможна без наличия в цитоплазме клеток и окружающей среде неорганических соединений, содержащих такие элементы, как фосфор, калий, кальций, магний, сера, железо, марганец, цинк, медь, молибден и др. Микро- и макроэлементы входят в состав ферментов, участвуют в поддержании необходимого осмотического давления и значения рН, буферной ёмкости (фосфатно-бикарбонатные буферы) или регулируют гидрофильность цитоплазмы клетки. Фосфор входит в состав важнейших соединений клетки - нуклеопротеидов, нуклеиновых кислот, полифосфатов, фосфолипидов. Соединения серы участвуют в энергетических процессах клетки, входят в состав многих физиологически активных соединений (белок и простетические группы (-SН) некоторых ферментов и коэнзима А). Без серы невозможен полноценный синтез белка, нарушаются процессы обмена. Обычно источником серы служат неорганические сульфаты, поэтому для включения серы в состав белков или витаминов сульфат должен быть восстановлен с помощью ферментов (сульфитредуктазы, сульфурилазы, пирофосфатазы). Наиболее важным серосодержащим компонентом клетки является аминокислота цистеин. Калий в организме выполняет, прежде всего, каталитическую роль, выступая в качестве активатора некоторых ферментов (амилазы, инвертазы), способствуя увеличению гидратации цитоплазмы клетки. Ионы кальция регулируют активную кислотность (рН среды), выступают в качестве реагента, связывающего остатки фосфорной кислоты. Основная функция магния - активация ферментов, необходимых Для нормального обмена веществ и роста микроорганизмов. Микроэлементы (железо, медь, цинк, марганец, молибден, кобальт и др.) входят в состав ферментов, участвующих в процессах метаболизма и внутриклеточного обмена. Каталитическая активность микроэлементов возрастает во много раз, когда ионы металлов соединяются с молекулами органических веществ и образуют органоминеральные комплексы (хелаты). Железо входит в состав ферментов-активаторов кислорода — системы цитохромов. Медь в сочетании со специфическими белками образует ряд ферментных систем (полифенолксидазы, ас-карбинооксидазы, нитратредуктазы, альдегидоксидазы и др.) Цинк участвует в построении фосфатаз, эналаз, полипептидаз, регулирующих углеводный, азотистый, фосфатный обмены ряда организмов, в окислительно-восстановительных процессах. Составной частью многих ферментных систем (карбоксилаз, протеиназ, фосфорилаз) является марганец, так фосфорилазы участвуют в переносе фосфорной кислоты от аденозинтрифосфата. Определенное влияние на различные стороны метаболизма микроорганизмов и особенно антибиотиков оказывает кобальт. Среда содержит также небольшие концентрации антибиотиков для поддержания асептических условий. Перечисленные компоненты достаточно дороги, поэтому при крупномасштабном производстве прежде всего углеводы заменяют более доступными по стоимости продуктами крахмалопаточного производства (мелассой, гидролом, кукурузным экстрактом, соевой мукой, свекловичным жомом).

Answer 32

Незаменимым элементом питательных сред является вода, которая составляет единую систему с элементами клетки. Вода-растворитель способствует проникновению в клетку необходимых веществ и выводу из нее продуктов обмена. В клетках вода находится и в виде соединений с углеводами, белками и другими веществами, тесно взаимодействуя с макромолекулами клетки. Гидратирование и дегидратирование органических молекул — важнейший этап в превращении химических компонентов цитоплазмы. Вода участвует в реакциях гидролиза и конденсации, поддерживает объёмную структуру клетки при наличии гидростатического давления. Для питательных сред используют специально подготовленную воду. Очистка воды проходит 4 стадии: 1) удаление механических загрязнений на префильтре (пористое стекло, электрокоагуляция); 2) очистка от органических загрязнений (активированный уголь); 3) деионизация с использованием ионообменных смол (катиониты, аниониты); 4) стерилизация на мембранных фильтрах с размером пор от 0,22 до 0,45 мкм.

Answer 33

Для стерилизации питательных сред используют термическую стерилизацию (пар под давлением) и стерилизующую фильтрацию. Цель стерилизации питательных сред - разрушение бактериальных спор. Многие компоненты питательных сред (витамины, гормоны и другие БАВ) крайне чувствительны к длительному температурному воздействию, поэтому установлены специальные режимы периодической и непрерывной термической стерилизации питательных сред. Стерилизующая фильтрация предполагает использование мембранных фильтрующих элементов.

Answer 34

Штаммы микроорганизмов для производства биологических препаратов поступают в ампулах, где они законсервированы в виде чистых культур. Каждая культура имеет паспорт с описанием питательных сред, морфологических, физиологических и других характеристик, условий для их поддержания, выращивания и срока хранения. Режим хранения культур предполагает охлаждение, замораживание или обезвоживание; во всех случаях должен быть резко сокращён или полностью прекращён клеточный обмен веществ. Культуры штаммов хранят: на косом агаре при температуре минус 1-5 °С; замороженными при температуре ниже —20 °С (недопустимо повторное оттаивание и замораживание); лиофилизированными в ампулах, хранящимися в течение нескольких лет. Большинство культур клеток млекопитающих, в том числе и клеток человека, удается сохранить неопределенно долгое время замороженными в специальной среде при температуре - 180 °С. Через определённое время, специфическое для каждого вида микроорганизмов и вида хранения, культуру пересеивают. Перед началом технологического процесса культуру размножают в стерильных условиях при оптимальном составе питательной среды и режиме выращивания, длительность стадии выращивания — 24 ч.

Answer 35

Стадия культивирования микроорганизмов является наиболее сложной и ответственной. Рост и культивирование биомассы требуют следующих условий: •жизнеспособности посевного материала; •наличия источника энергии (тепла); • достаточного количества соответствующей питательной среды; • необходимых физико-химических условий для жизнедеятельности.

Answer 36

С начала 1950-х гг. вирус полиомиелита для производства вакцины выращивали в культуре клеток млекопитающих, в том числе фибробла-стов эмбриона человека. С тех пор фибробласты эмбриона стали незаменимы для выделения и выращивания ряда других вирусов, при производстве высокоспецифичных белков (антител, интерферонов), в исследованиях рака и противовирусной химиотерапии. Культуры, приготовленные непосредственно из тканей организма (эмбриональных или тканей новорожденных), называют первичными культурами. В большинстве случаев клетки первичной культуры переносят из культуральной чашки и используют для получения большого количества вторичных культур, которые можно последовательно перевивать в течение недель или месяцев. Разные типы клеток нуждаются в различных питательных веществах, а также в одном или нескольких белковых факторах роста. Клеточные линии можно использовать для получения клонов, которые происходят из одной клетки-предшественника.

Answer 37

Биотехнология использует методы поверхностного и глубинного культивирования микроорганизмов. При поверхностном культивировании (в монослое) суспензию клеток получают обработкой измельчённой ткани эмбриона трипсином. Клетки в такой суспензии, оседая на плотной поверхности сосуда с культуральной средой, становятся плоскими и делятся, образуя монослой на поверхности сосуда. Обычно при этом способе культивирования пользуются цилиндрическими бутылями, которые медленно вращаются вдоль своей длинной оси. Рост клеток и выход биомассы можно увеличить, добавив к суспензии носитель — микроскопические гранулы из инертного синтетического полимера, на которых клетки закрепляются и пролиферируют. Суспензионные культуры можно получать в сосудах объёмом до 1000 л при перемешивании. Преобладающим является глубинный метод культивирования, предполагающий возможность использования всего объема питательной среды.

Answer 38

На рост и развитие микроорганизмов влияют внутри- и внеклеточные факторы. К внутриклеточным факторам относятся: структура клетки, механизмы метаболизма и генетические характеристики. Внеклеточные (внешние) факторы, т.е. условия внешней среды клетки, являются основными регуляторны.ми факторами биотехнологии.

Answer 39

Промышленное культивирование и очистка целевого продукта -процессы многоступенчатые. Общая схема ферментации представлена на рис. 8. Процесс начинается с приготовления и стерилизации культуральной среды и оборудования. Вначале выращивают исходную культуру (5-10 мл), затем инкубируют ее во. встряхиваемой колбе (200-1000 мл), далее переносят в ферментер для посевного материала (10-100 л) и, наконец, в промышленный ферментер (1000-100000 л). По завершении ферментации выделяемый продукт находится в клетках или в культуральной среде, но не в обеих фракциях одновременно, поэтому дальнейшие манипуляции проводят с одной из этих фракций.

Answer 40

Микроорганизмы можно выращивать: • в ферментере периодического действия; • в ферментере периодического действия с добавлением субстрата; • в непрерывной культуре. В первом случае микроорганизмы выращивают в стерильных условиях без добавления в ходе ферментации свежей культуральной среды. При периодической ферментации состав культуральной среды, концентрация микроорганизмов (биомассы), количество белкового продукта или метаболита зависят от фазы роста, клеточного метаболизма и наличия питательных веществ.

Answer 41

Различают шесть основных фаз роста (рис. 9): лаг-фаза (1); фаза ускорения (2); экспоненциальная или логарифмическая фаза (3); фаза замедления (4); стационарная фаза (5); фаза отмирания (6). Как правило, после инокуляции стерильной культуральной среды мгновенного увеличения числа клеток не наблюдается. В течение определенного периода времени, называемого лаг-фазой, клетки адаптируются к новым условиям (другим рН или концентрации питательных веществ). Продолжительность лаг-фазы зависит от времени, в течение которого клетки посевного материала находились в стационарной фазе, и от того, насколько различалась среда, в которой росла культура, от новой, свежей культуральной среды. Если посевным материалом служит культура, находящаяся в экспоненциальной фазе, выраженная лаг-фаза может отсутствовать и рост клеток начнется немедленно после инокуляции. Между лаг- и экспоненциальной фазами есть короткий период — фаза ускорения, когда скорость роста клеток увеличивается до достижения постоянной величины. В период экспоненциальной фазы клетки претерпевают несколько делений. Когда субстрат присутствует в избытке, достигается максимальная скорость роста культуры в экспоненциальной фазе, из-за большого числа клеток в конце экспоненциальной фазы субстрат расходуется очень быстро, наступает фаза замедления, которая может быть кратковременной. В результате истощения лимитирующего субстрата или накопления продуктов метаболизма, замедляющих рост, увеличение числа клеток постепенно прекращается и культура переходит в стационарную фазу. В это время биомасса остается постоянной, метаболизм претерпевает кардинальные изменения, синтезируются соединения (вторичные метаболиты), представляющие коммерческий интерес, например антибиотики. Продолжительность стационарной фазы зависит от конкретного микроорганизма и условий роста. В фазе отмирания метаболизм прекращается, так как энергетические запасы клеток оказываются исчерпанными. При промышленном синтезе, еще до наступления фазы отмирания, ферментацию останавливают.

Answer 42

Периодическая культура с добавлением субстрата предполагает периодическое внесение в ферментер увеличивающегося количества питательных веществ. При этом культуральную среду не удаляют до окончания процесса. Периодическое добавление субстрата приводит к удлинению экспоненциальной и стационарной фаз, к увеличению биомассы и количества метаболитов, синтезируемых во время стационарной фазы. Для обеспечения непрерывного синтеза рекомбинантного белка и его стабильности необходим тщательный контроль процесса и добавление субстрата (источника углерода, азота, витаминов, микроэлементов и др. БАВ) тотчас, как в этом возникает необходимость. В зависимости от генотипа микроорганизма и природы рекомби-нантного белка периодическая ферментация с добавлением субстрата может повысить выход готового продукта на 25-1000% по сравнению с простой периодической ферментацией. Периодическая ферментация с добавлением субстрата используется также для культивирования клеток млекопитающих и насекомых; эти культуры широко применяют для получения белковых продуктов, имеющих медицинское значение, кроме того, без периодического добавления субстрата, клетки млекопитающих неэффективно синтезируют чужеродные белки. Для периодической ферментации характерны небольшие различия во времени сбора клеток, который проводят, начиная с середины экспоненциальной фазы, и заканчивают ее поздним этапом. Однако в стационарной фазе микроорганизмы часто синтезируют протеолитические ферменты - протеиназы, разрушающие производимые белки; если цель ферментации - получение белковых продуктов, нужно остановить процесс до перехода его в стационарную фазу. Определяя время добавления следующей порции субстрата, используют показатели, коррелирующие с его расходом: количество синтезированных органических кислот, значение рН или количество образовавшегося СО2. Конечный продукт собирают по завершении процесса.

Answer 43

При непрерывной ферментации свежая культуральная среда поступает в ферментер непрерывно, параллельно отводится такой же объем клеточной суспензии. Таким образом, убыль числа клеток (удаление продукта) уравновешивается их увеличением в результате деления. При этом жестко контролируют скорость притока культуральной среды и постоянный объем культуры в биореакторе. Следует заметить, что в промышленных целях непрерывная ферментация применяется реже, хотя стоимость получения определенного количества биомассы в ферментере непрерывного действия существенно ниже, чем в биореакторе, работающем в периодическом режиме. Это удешевление обусловлено следующим: —при непрерывной ферментации нужны не столь громоздкие биореакторы и оборудование для сбора клеток, их разрушения, последующей очистки белкового продукта или метаболита, синтезированного микроорганизмами; —биореактор периодического действия время от времени разгружают, готовя к повторному использованию (ремонт, чистка, стерилизация биореактора - основная причина снижения эффективности процесса); для ферментера, работающего в непрерывном режиме, простой существенно меньше; — при непрерывной ферментации синтез целевого продукта происходит более согласованно, так как физиологический статус большинства клеток одинаков. Непрерывную ферментацию используют для промышленного получения белков одноклеточных микроорганизмов и антибиотиков, однако и этот способ выращивания микроорганизмов связан с определенными затруднениями: • продолжительность ферментации в непрерывном режиме со-ставляет иногда 500-1000 ч, в течение которого некоторые клетки могут потерять рекомбинантные плазмиды (известно, что клетки, не несущие плазмид, расходуют меньше энергии, делятся быстрее, поэтому со временем выход целевого продукта может снижаться из-за уменьшения числа клеток, способных его синтезировать); • в промышленных установках затруднительно в течение длительного времени поддерживать стерильные условия; непре- • рывные процессы требуют наличия стерильного резервного оборудования, что значительно увеличивает основные затраты.

Answer 44

Культуры с высокой плотностью. При максимальной конечной плотности культуры получается и максимальное количество целевого продукта. В ферментерах периодического действия с добавлением субстрата концентрация рекомбинантных клеток Е.соli достигает 50 г сухого вещества на 1 л питательной среды (в некоторых случаях более 100 г/л). Один из способов повышения плотности культуры — оптимизация культуральной среды. Следует иметь в виду, что некоторые питательные вещества (в том числе источники углерода, азота) при высоких концентрациях замедляют рост клеток. Так, глюкоза подавляет рост при концентрации более 50 г/л, аммиак - при концентрации свыше 3 г/л; железо, магний, фосфор, цинк соответственно - более 1,15 г/л, 8,7 г/л, 10 г/л, 0,038 г/л. Таким образом, простое увеличение содержания питательных веществ в культуральной среде при периодической ферментации не дает желаемого результата. Для избежания недостатка кислорода в культурах с высокой плотностью повышают количество поступающего диспергированного воздуха и скорость перемешивания. Возможна подача в культуру чистого кислорода, а не воздуха (содержащего только 20% кислорода) или выращивание клеток под определенным давлением для увеличения растворимости кислорода. Высокой плотности роста культуры удается достичь в периодическом режиме с добавлением субстрата.

Answer 45

Режим подачи питательных веществ может быть: непрерывным, ступенчатым, экспоненциальным. При непрерывном режиме в культуральную среду в течение всей ферментации вносят одинаковые количества питательных веществ. При ступенчатом режиме питательные вещества добавляют во все большем количестве по мере увеличения концентрации клеток. При экспоненциальном режиме питательные вещества добавляют в количестве, обеспечивающем постоянную скорость роста клеток. Периодическую подачу питательных веществ автоматизируют, основываясь на результатах измерения концентрации лимитирующего субстрата культуральной среды (например глюкозы) в процессе ферментации. При крупномасштабной ферментации следует учитывать еще один аспект. Важно не допустить случайного попадания рекомбинантных микроорганизмов в окружающую среду; для этого используют надежные системы, предотвращающие утечку живых рекомбинантных организмов или ограничивающие их распространение при произошедшей утечке. Перед окончательным удалением из установки, все рекомбинантные микроорганизмы должны быть инактивированы в соответствии с определенными инструкциями. Использованную культуральную среду тщательно проверяют на наличие в ней жизнеспособных микроорганизмов, чтобы исключить их попадания в окружающую среду.

Answer 46

Биореакторы Промышленное производство биопрепаратов представляет собой сложный комплекс взаимосвязанных физических, химических, биофизических, биохимических, физико-химических процессов и предполагает использование большого количества разнотипного оборудования, которое связано между собой материальными, энергетическими потоками, образующими технологические линии. Основным аппаратурным элементом биотехнологического процесса является биореактор - ферментер (рис. 10). Биореакторы предназначены для культивирования микроорганизмов, накопления биомассы, син-теза целевого продукта. Биореакторы изготавливают из высоколигиро-ванных марок стали, иногда из титана. Внутренняя поверхность биореактора должна быть отполирована. Типовые ферментеры представляют собой вертикальные ёмкости различной вместимости (малые - от 1 до 10 л, многотоннажные - более 1000 л) с минимальным числом штуцеров и передающих устройств. В биореакторах должны быть обеспечены оптимальные гидродинамические и массообменные условия. Ферментеры снабжены паровой рубашкой, мешалками, барботера-ми, стерилизующими воздушными фильтрами, отбойниками, обеспечивающими необходимые температурный, газовый режим, гидродинамическую обстановку в биореакторе (т.е. процессы массо- и теплообмена). В биореакторах имеются пробоотборцики для отбора проб культураль-ной жидкости в процессе биосинтеза. Могут быть и другие конструктивные особенности, учитывающие специфику биотехнологического процесса. Работа отдельных узлов контролируется измерительными приборами, фиксирующими как параметры технологического процесса, так и отдельные физико-химические показатели культивирования (температуру стерилизации и культивирования, скорость вращения мешалки, давление, расход воздуха или газов на аэрацию, пенообразование, рН, еН, рО2, рСО2 среды). Тип биореактора, чистота обработки внутренних стенок аппарата и отдельных его узлов, ёмкость, коэффициент заполнения, поверхность теплоотдачи, способ отвода тепла, тип перемешивающих, аэрирующих устройств, арматура и запорные приспособления, способ пеногашения, — далеко не полный перечень отдельных элементов, которые, в отдельности и во взаимосвязи, влияют на процесс культивирования микроорганизмов и клеток.

Answer 47

Биореакторы подразделяют на три основные группы (рис. 11): 1) реакторы с механическим перемешиванием; 2) барботажные колонны, через которые для перемешивания содержимого пропускают воздух; 3) эрлифтныереакторы с внутренней или внешней циркуляцией; перемешивание и циркуляция культуральной среды в них обеспечивается потоком воздуха, за счет которого между верхним и нижним слоями культуральной среды возникает градиент плотности. Биореакторы первого типа используют чаще всего, так как они позволяют легко изменять технологические условия и эффективно доставлять к растущим клеткам воздух, определяющий характер развития микроорганизмов и их биосинтетическую активность. В таких реакторах воздух подают в культуральную среду под давлением через разбрызгиватель - кольцо с множеством маленьких отверстий. При этом Биореакторы первого типа используют чаще всего, так как они позволяют легко изменять технологические условия и эффективно доставлять к растущим клеткам воздух, определяющий характер развития микроорганизмов и их биосинтетическую активность. В таких реакторах воздух подают в культуральную среду под давлением через разбрызгиватель - кольцо с множеством маленьких отверстий. При этом цели используют мешалки - одну или несколько. Мешалки, разбивая крупные пузырьки воздуха, разносят их по всему реактору и увеличивают время пребывания в культуральной среде. Эффективность распределения воздуха зависит от типа мешалки, числа оборотов, физико-химических свойств среды. При интенсивном перемешивании культуральной среды происходит ее вспенивание, поэтому рабочий объем биореактора не превышает 70% общего объема. Свободное пространство над поверхностью раствора используется как буферное, где накапливается пена, и таким образом предотвращается потеря культуральной жидкости. В пенящейся жидкости условия аэрации лучше, чем в плотных растворах (при условии непрерывного перемешивания и циркуляции слоя пены, т.е. при исключении нахождения микроорганизмов вне культуральной жидкости). Вместе с тем вспенивание может привести к переувлажнению фильтров в отверстиях, через которые воздух выходит из биореактора, уменьшению потока воздуха и к попаданию в ферментер посторонних микроорганизмов. Конструктивные особенности барботажных колонн и эрлифтных биореакторов дают этим типам ферментеров некоторые преимущества перед реакторами с механическим перемешиванием. Барботажные колонны более экономичны, так как перемешивание в них происходит восходящими потоками воздуха равномерно по всему объему. Отсутствие механической мешалки исключает один из путей проникновения в биореактор посторонних микроорганизмов. В барботажных биореакторах не возникает сильных гидродинамических возмущений (сдвигов слоев жидкости культуральной среды относительно друг друга). Уменьшение сдвиговых факторов важно по следующим причинам: клетки рекомбинантных микроорганизмов менее прочны, чем нетрансформированные; клетка отвечает на внешние воздействие уменьшением количества синтезируемых белков, в том числе рекомбинантных; под влиянием сдвиговых эффектов могут изменяться физические и химические свойства клеток, что затрудняет дальнейшую работу с ними (ухудшаются условия выделения, очистка рекомбинантных белков). В барботажных колоннах воздух подают под высоким давлением в нижнюю часть биореактора; по мере подъема мелкие пузырьки воздуха объединяются, что влечет неравномерное его распределение. Кроме того, подача воздуха под высоким давлением приводит к сильному пе-нообразованию. В эрлифтных биореакторах воздух подают в нижнюю часть вертикального канала. Поднимаясь, воздух увлекает за собой жидкость к верхней части канала, где расположен газожидкостный сепаратор (здесь частично выходит воздух). Более плотная деаэрированная жидкость опускается по другому вертикальному каналу ко дну реактора и процесс повторяется. Таким образом, в эрлифтном биореакторе культуральная среда вместе с клетками непрерывно циркулирует в биореакторе. Эрлифтные биореакторы выпускаются в двух конструктивных вариантах. В первом - реактор представляет емкость с центральной трубой, которая обеспечивает циркуляцию жидкости (реакторы с внутренней циркуляцией). У эрлифтного биореактора второго типа культуральная среда проходит через отдельные независимые каналы (реактор с внешней системой циркуляции). Эрлифтные биореакторы более эффективны, чем барботажные колонны, особенно в суспензиях микроорганизмов с большей плотностью или вязкостью. Перемешивание в эрлифтных ферментерах более интенсивно и вероятность слипания пузырьков минимальна.

Answer 48

Для стерилизации биореактора применяют пар под давлением. Внутри биореактора не должно быть «мертвых зон», недоступных для пара во время стерилизации. Стерилизации подлежат все клапаны, датчики, входные и выходные отверстия. Стерильность обеспечивается и герметизацией биотехнологического оборудования, работающего в асептических условиях. Стерильная передача жидкости осуществляется через штуцеры парового затвора. Технологическая обвязка биореактора исключает контаминацию куль-туральной жидкости посторонней микрофлорой и возможности попадания продуктов биосинтеза в окружающую среду. Основные агенты, контаминирующие клеточные культуры — бактерии, дрожжи, грибы, простейшие, микоплазмы, вирусы. Источники контаминации - воздух, пыль, питательные среды, рабочие растворы, оборудование, рабочий персонал. Очистка воздуха от микроорганизмов и аэрозольных частиц осуществляется через фильтры предварительной очистки (комбинированные глубинные фильтры - бумага, картон, тканевые материалы), которые устанавливают на всасывающей линии перед компрессором (воздух очищается от частиц размером более 5 мкм) и фильтры тонкой очистки (ткань ФП, удаляющая частицы размером до 0,3 мкм, металлокерамиче-ские и мембранные фильтры). Металлокерамические фильтры изготовлены из калиброванных металлических порошков (бронзы, никеля, нержавеющей стали, титана) способами спекания, прессования, прокатки; размер пор варьирует от 2 до 100 мкм. Металлокерамические фильтры стерилизуют при температуре 150 °С 50 мин. Они стойки к действию сильных кислот, щелочей, окислителей, спиртов, могут использоваться при температуре от -250 °С до +200 °С. Преимущество металлокерамических фильтрующих элементов -простота регенерации, большой срок работы (5-10 лет). В отличие от волокнистых, нетканных и фторопластовых фильтров, зернистые металлокерамические материалы имеют неизменную структуру, химически инертны, поддаются любым методам стерилизации, отличаются высокой механической прочностью, просты в изготовлении. Мембранные фильтры патронного и кассетного типа несмотря на менее значительный срок службы (1 год) обладают высокой эффективностью, быстрой съёмностью, надёжны в работе. Отмечена способность рядом фильтрующих материалов, заряженных отрицательно, задерживать живые клетки, бактерии, вирусы, эритроциты, лимфоциты и тромбоциты. Частицы, размер которых меньше величины пор фильтрующего материала, остаются на фильтре, если дзета-потенциал (электрический потенциал) частиц и стенок пор фильтра имеет противоположные заряды. Это явление- наблюдается при использовании в качестве фильтрующих элементов мембран с соответствующими электростатическими свойствами. Выбор фильтрующего материала зависит от объекта фильтрации и дзета-потенциала суспендированных частиц. Отработанный воздух, отводимый из лабораторных и производственных помещений, контролируется на чистоту (отсутствие микроорганизмов). Для обслуживания установок глубинного культивирования применяют автоматизированную модульную систему, включающую: —очистку и стерилизацию воздуха и пара с использованием металлокерамических и титановых фильтрующих элементов; —модули технологической обвязки, содержащие автономную систему термостатирования, запорную и регулирующую арматуру, индивидуальные входные и выходные фильтры, электропнев-мообразователи и другие регулирующие устройства; —блок автоматического контроля и управления, содержащий программное устройство, преобразователи сигналов от измерительных электродов, газоанализаторы для измерения О2, СО2, еН, температуры, рСО2, рО2; —системы цифровой и диаграммной индикации текущих параметров культивирования. Установки глубинного культивирования снабжены блоками дистанционного измерения давления в биореакторе и его рубашке, блоками дистанционного контроля интенсивности аэрации воздухом или газовой смесью (кислорода и азота, кислорода и углекислого газа, воздуха и углекислого газа, азота и углекислого газа). Блок автоматического управления позволяет контролировать и поддерживать на заданном уровне программную стерилизацию биореактора и арматуры, скорость вращения мешалки и дистанционный контроль открытия или закрытия вентилей и регулирующих клапанов. Ряд стран специализируется на выпуске широкого ассортимента оборудования для культивирования различного назначения (фирма NBS - США; Полиферм, Биотек - Швеция; Марубиши - Япония; LН - Фер-ментейшн — Великобритания; Браун - Германия; БИОР-0,1, БИОР-0,2 — Россия, институт биологического приборостроения с опытным заводом АН РФ).

Answer 49

Независимо от типа биореактора процесс ферментации строго контролируют по: —концентрации растворенного кислорода; — рН; —температуре; —интенсивности перемешивания биомассы. Существенные изменения любого из этих параметров резко снижают скорость роста клеток и стабильность белкового продукта. Для оптимального роста Е. соli и других микроорганизмов, используемых при экспрессии рекомбинантных белков, нужна хорошо аэрируемая культуральная среда. Кислород плохо растворим в воде (0,0084 г/л при 25 °С), поэтому он должен подаваться в среду непрерывно. В процессе ферментации специальный датчик контролирует содержание растворенного кислорода в среде, равномерность его распределения по всему объему, тщательность перемешивания культуры, что, вместе взятое, обеспечи- вает эффективность диспергирования пузырьков. Пространство, где взаимодействуют микроорганизмы и питательная среда, принято называть микросредой. Если микросреда данной культуры одинакова в каждой точке, такую культуру считают гомогенной. Гомогенность достигается эффективным перемешиванием всех компонентов среды и микроорганизмов по всему рабочему объему. Гомогенность невозможна без аэрации, которая осуществляется барботерами различных конструкций, например, в виде кольцевого желоба с отверстиями, перфорированной трубы или форсунки. Оптимальный рост большинства микроорганизмов идет при рН от 5,5 до 8,5; однако клеточные метаболиты, выделяющиеся в культураль-ную среду, могут изменять рН. Изменение рН среды заметно сказывается на активности ферментов микроорганизмов, состоянии промежуточных продуктов, их диссоциации, растворимости и т.п., что значительно влияет на выход конечного продукта. Тщательно контролируя рН, при необходимости в ферментер добавляют кислоту или основание, хорошо перемешанные с питательной средой и равномерно распределенные по всему объему. Успех ферментации зависит от температуры. Если она ниже оптимальной (37 °С), рост микроорганизмов замедлен, интенсивность их метаболизма снижена. При повышении температуры до 38 °С, возможна преждевременная индукция синтеза белка или индукция белков теплового шока, что активирует клеточные протеиназы и снижает выход белкового продукта. Для отвода тепла используют охлаждающую рубашку. Тщательное перемешивание культуральной среды - один из наиболее распространенных процессов в БТ. Перемешивание необходимо для: —равномерной доставки питательных веществ к клеткам; — предотвращения накопления токсических побочных продуктов метаболизма в каком-нибудь небольшом участке биореактора. Механическое перемешивание и аэрация снабжают растущую культуру кислородом, азотом, отводят продукты газообмена и физиологическое тепло, выделяемое микроорганизмами в процессе биосинтеза, способствуют гомогенизации суспензии, увеличивают скорость процессов масса- и теплообмена. Конструкция мешалки играет важную роль в работе биореактора. Мешалки делят на быстро- и тихоходные. Быстроходные аппараты с большой и средней циркуляционной производительностью используют в препаратах с отражательными перегородками (отбойниками). Отсутствие перегородок приводит к завихрению жидкости, снижению скорости у стенки аппарата и образованию воронки. Мешалки быстроходные - турбинные, пропеллерные, лопастные, дисковые. Тихоходные - якорные, рамные, ленточные, вибрационные, скребковые; последние для перемешивания средне- и высоковязких сред. Для глубинного культивирования чаще всего используют турбинную мешалку с прямыми лопастями, расположенными радиально. Перемешивание культуральной среды влияет на другие параметры: —скорость переноса кислорода из пузырьков газа в жидкую среду,из среды - в клетки; —эффективность теплопередачи; —точность измерения концентрации метаболитов культуральной жидкости; —эффективность диспергирования добавляемых реагентов (кислот, оснований, питательных сред и т.д.). Следует соблюдать баланс между необходимостью тщательного перемешивания среды и целостностью клеток, так как при чрезмерном перемешивании в среде могут возникнуть гидромеханические эффекты, губительные для бактериальных клеток. Непрерывный мониторинг всех параметров, дает возможность изменять условия в ходе ферментации; Как правило, оптимальные условия изменяются при каждом десятикратном увеличении объема биореактора.

Answer 50

Под определением биомасса подразумевается общая концентрация микроорганизмов или клеток на твёрдой или жидкой питательной среде при культивировании. Наиболее чувствительный метод контроля биомассы - подсчёт клеток с определением линейных размеров или числа жизнеспособных клеток (метод окрашивания) при помощи микроскопа. Количество клеток в биомассе можно контролировать и по объёму осаждения в центрифужных стаканчиках. Также используют косвенные методы определения биомассы по интенсивности дыхания (изменению концентрации СО2 инфракрасным газоанализатором) или содержанию белка (самый чувствительный метод - бромсульфалеиновая проба, основанная на связывании бромсульфалеина основными группами белка). Количество микроорганизмов и клеток можно определять физикохимическими методами: кондуктометрически (по удельной электропроводимости), спектрофотометрически, колориметрически, нефелометри-чески. Гибель клеток ведёт к выделению клеточных фрагментов, загрязняющих фильтры и пробы, высвобождению внутриклеточных ферментов. Гибель клеток идёт по двум механизмам: апоптоз и некроз. Погибать могут, казалось бы, вполне жизнеспособные клетки, т.е. те, которые еще не успели исчерпать свои жизненные ресурсы. Зачастую активную роль в своей гибели играет сама клетка — с помощью содержащихся в ней механизмов, которые лишь запускаются теми или иными факторами внеклеточной или внутриклеточной среды; в результате возникло представление об апоптозе или программированной клеточной гибели. Апоптоз определяют, как программируемую клеточную смерть, понимая под этим такую гибель клетки, в развитии которой активную роль играют специальные и генетически запрограммированные внутриклеточные механизмы. Исходный смысл слова «апоптоз» весьма поэтичен, по-гречески он означает опадание листьев. Круг обстоятельств, когда в клетке включается программа апоптоза, весьма широк, их можно представить двумя группами: —«неудовлетворительное» состояние самой клетки, что вызывает апоптоз изнутри; —«негативная» сигнализация снаружи, передающаяся через специальные рецепторы клетки («апоптоз по команде»). О «неудовлетворительном» состоянии самой клетки может свидетельствовать серьезное повреждение хромосом и внутриклеточных мембран. В этом смысле апоптоз выполняет функцию уничтожения дефектных клеток. Важнейший инструмент апоптоза - цитоплазматиче-ские протеазы, ядерные эндонуклеазы, последние разрушают ДНК не до нуклеотидов, а лишь до более или менее крупных фрагментов. К прочим «орудиям» апоптоза относится совокупность сильных окислителей - избыточное накопление не только оксида азота, но и других реакци-онноактивных веществ — супероксидного и гидроксидного радикалов, пероксинитрита, нитритов, нитратов и т.д. Известно, что в нормальной клетке существуют механизмы защиты от радикалов и окислителей. Это ферменты антиоксидантной системы: супероксиддисмутаза (превращает супероксид в перекись водорода), каталаза и пероксидаза, элиминирующие из среды пероксид водорода. Повреждения клеток могут быть вызваны изменением температуры, нарушением питания. Если же повреждения клетки чрезмерны, процесс ее гибели становится неуправляемым - это уже некроз. Таким образом, в зависимости от интенсивности и характера повреждающих воздействий гибель клетки может пойти либо по апопти-ческому, либо по некротическому пути.

Answer 51

Общая схема этой стадии технологического процесса представлена на рис. 12. Если продукт локализован внутри клеток, их разрушают, удаляют клеточные осколки и выделяют продукты из осветленной среды; секретируемый продукт выделяют непосредственно из среды. Для отделения биомассы клеток или культуралъной жидкости используют сепараторы, осадительные центрифуги, фильтр-прессы, фильтр-прессы, вакуум-барабанные фильтры, ротационно-вакуумные фильтры, отстойники. Выбор оборудования зависит от масштаба культивирования, типа клеток, свойств культуральной жидкости. Для выделения клеток из больших объемов культуральной среды (в промышленных масштабах) используют высокоскоростное центрифугирование с помощью соответствующих центрифуг полунепрерывного действия. Суспензию клеток непрерывно подают в барабан центрифуги, клетки концентрируются в нем, осветленная жидкость удаляется. Когда барабан заполняется осажденными клетками, центрифугу останавливают и клетки собирают. Неудобство этого способа - необходимость остановки процесса, вероятность утечки микроорганизмов в окружающую среду, невозможность полного удаления клеток из среды. Альтернативный метод выделения клеток из культуральной среды — фильтрация через мембрану. Но процесс фильтрации быстро замедляется за счет накопления клеток на поверхности фильтра. Увеличение давления фильтруемой среды дает временный эффект, так как клетки забивают поры, образуя менее проницаемый слой. Разрушение (дезинтеграция) клеток. Для этой цели применяют разнообразные химические, биологические, физические методы. Все процедуры должны быть одновременно достаточно жесткими, чтобы разрушить клеточную стенку, и достаточно мягкими для исключения денатурации белка (изменения структуры конечного продукта). Клеточные стенки микроорганизмов состоят из разных полимеров, поэтому универсального метода их разрушения не существует. У грамположителъных микроорганизмов клеточная стенка состоит из толстого пептидогликанового слоя N-ацетилглюкозамина и остатков N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных пептидными мостиками. У грамотрицателъных бактерий клеточная стенка тоньше и покрыта снаружи слоем липидов. Стенка дрожжевых клеток состоит из плотного слоя частично фосфорилированных маннатов и Р-глюканов. Низшие грибы имеют многослойные клеточные стенки, состоящие из а- и Р-глюканов, гликопротеидов и хитина. Состав и прочность клеточной стенки зависят от условий культивирования, скорости роста клеток, фазы, на которой они собираются, условий хранения сконцентрированных клеток и от того, экспрессировал ли выделенный микроорганизм клонированный ген. Химический метод разрушения клеточных стенок - обработка щелочью. Если белковый продукт не разрушается при рН от 10,5 до 12,5, то можно без труда лизировать большие количества бактериальных клеток. Например, рекомбинантный гормон роста человека очень просто выделить из клеток Е. соli обработкой натрия гидрокарбонатом при рН 11. После обработки щелочью не остается практически ни одной жизнеспособной клетки, что автоматически решает проблему утечки рекомбинантных микроорганизмов. Основной биохимический метод разрушения клеток микроорганизмов - лизис с помощью ферментов. Так, лизоцим яичного белка легко гидролизует клеточные стенки грамположительных бактерий. Для разрушения клеток грамотрицательных бактерий используют лизоцим и ЭДТА. Клеточные стенки дрожжей и плесневых грибов гидролизуют одним или несколькими ферментами: фосфоманназой, [B-1,3- и B-1,6-глюканазой, хитиназой - или комплексным дрожжелитическим препаратом. Ферментативная обработка высокоспецифична, а лизис происходит в мягких условиях. Клетки можно разрушать физическими методами: немеханическими (осмотическим шоком или быстрым многократным замораживанием-оттаиванием), механическими (обработкой УЗ, соударением, гомогенизацией под давлением). Механическое разрушение высокоэффективно, особенно УЗ-излучателями, генерирующими высокочастотные звуковые волны. УЗ-дезинтеграторы состоят из транзисторного генератора УЗ-волн, пьезоэлектрического или магнитострикционного преобразователя, набора рабочих камер (аппарат на основе УЗ-диспергатора УЗДН-1, Россия). При большом количестве клеток используют баллистическую дезинтеграцию, ее проводят в высокоскоростных шаровых мельницах, куда помещают концентрированную суспензию клеток. Камера мельницы заполнена инертным абразивным материалом (стеклянными, полимерными шариками диаметром 1 мм). Содержимое быстро перемешивают лопасти, насаженные на ось. Большинство клеток разрушаются под действием сдвиговых напряжений, возникающих в результате быстрого движения шариков относительно друг друга, поверхности лопастей и камеры. Условия оптимального разрушения клеток подбирают, варьируя числом и формой лопастей, скоростью перемешивания, числом и размером шариков, геометрией камеры, температурой, концентрацией клеток (аппараты фирмы «Willi A.. Васhhоtеm», Швейцария,( Gifford Wood Со», США). Соударение - клеточную суспензию большой вязкости направляют под давлением на неподвижную поверхность, в месте соприкосновения выделяется большое количество энергии, разрушающей клетки. Активность клеточных белков при разрушении клеток методом соударения уменьшается незначительно. Экструзионные методы (продавливание суспензии клеток через капиллярные отверстия) предназначены для обработки жидких или замороженных суспензий клеток. Диаметр отверстий рабочих матриц составляет от нескольких миллиметров до десятых его долей. В гидроэкс-трудерах давление достигает 2000-4000 кг/см2, в твердофазовых экс-трудерах - 10000-50000 кг/см2. После экструзии давление резко сбрасывают, что вызывает лизис клеток. Экструзионные дезинтеграторы производят фирмы «Маnton Gaulin» (США), LКВ (Швеция). Дальнейшая обработка. После разрушения клеток их осколки удаляют низкоскоростным центрифугированием или микрофильтрацией через мембрану. Белковый продукт выделяют из лизата методом высаливания — осаждением высококонцентрированными растворами нейтральных солей, чаще всего натрия- или аммония сульфатом. Седиментация белка может быть достигнута органическими растворителями (этанолом, ацетоном).

Answer 52

Получение готовой продукции связано с сушкой и консервированием биопрепаратов. Объект сушки - живые микроорганизмы, клетки, ферменты, гормоны и др. БАВ. Биопрепараты кроме биологически активной составляющей содержат органические соединения и значительное количество воды. Вода в продуктах биосинтеза может быть в свободном или связанном состояниях; значительная часть воды удерживается в субстрате физико-механическими и адсорбционными связями (вандерваальсовы силы). Физико-механически связанная вода находится в порах и капиллярах материала. Для высушивания биопрепаратов применяют методы, не приводящие к потере биологической активности, где доминирует сублимационная сушка (установки типа «Иней» Института биологического приборостроения, г. Пущино (Россия), «Юзефруа» (Франция), «Неto - Неlton» (Дания). Использование распылительных сушилок ограничено по причине сравнительно жестких условий сушки. Термолабильные и неустойчивые по ряду показателей биопрепараты при высушивании в суспензиях (не содержащих защитных сред) подвержены существенным структурным и морфологическим изменениям. Это может сопровождаться утратой жизнеспособности и разрушением клеточных структур. Среды высушивания (защитные среды) - криопротекторы. Денатурирующее влияние замораживания сдерживается инактивацией (изменением свойств) защитных агентов: высокомолекулярных компонентов (ПВП м.м. от 2600 до 6400 - декстран, желатин, пептон); низкомолекулярных и буферных компонентов (глютамат, трис- буфер). Защитная среда предохраняет биопрепараты от необратимых изменений в процессе замораживания, высушивания и при последующем хранении. Защитные среды, как правило, состоят из нескольких компонентов. Так, для консервирования клеточных культур используют крио-защитные свойства глицерина и DMSО, их добавляют к питательной среде в концентрации 5-10%. При температуре минус 180-196 °С жизнеспособность законсервированной культуры может сохраняться неограниченно долго. Розлив, укупорку, этикетировку, упаковку готовой продукции проводят в отдельных аппаратах (при малотоннажном производстве); это компактные установки для ампул, ёмкостей для инфузий; машины для укладки, упаковки. Технологические линии (крупномасштабное промышленное производство) включают: •УЗ-моечные машины; •стерилизационные сушильные туннели (с ламинарными потоками горячего воздуха); •машины для наполнения и запайки ампул; •машины наполнения и запайки ёмкостей для растворов внутривенного введения (электронно-турбинный розлив в соответствии с GМР); • машины для наполнения и запайки порошкообразных препаратов; •машины для наполнения и укупорки флаконов с навинчивающимся колпачком и специальной насадкой; •наполнительные и укупорочные машины для инъекций; •машины для нанесения кода (маркировка цветным кольцом); •машины для контроля на герметичность; •этикетировочные машины; •машины для капсулирования порошков; •машины для сборки, наполнения, запайки шприц-тюбиков. Отдельные установки и технологические линии выпускают фирмы Америки, Швейцарии, Франции, Германии, Финляндии; установки этих фирм отвечают требованиям СМР.

Answer 53

В настоящее время с помощью рекомбинантных ДНК клонировано более 400 генов (в основном в виде кДНК) различных белков человека, которые являются или могут стать ЛС. По подсчетам специалистов ВОЗ, ежегодный объем мирового рынка ЛП на основе белков человека составляет около 150 млрд долларов и постоянно растет. Развитие технологии рекомбинантных ДНК, разработка способов получения моноклональных антител, установление структуры и функции иммуноглобулинов привело к использованию специфических антител для лечения различных заболеваний. Работа с генами антител облегчается тем, что отдельные молекулы антитела выполняют разные функции. Привлекательность применения в качестве терапевтических средств специфических антител объясняется тем, что их можно использовать для нейтрализации токсинов, борьбы с бактериями, вирусами, для лечения онкологических заболеваний. Антитело можно уподобить самонаводящейся ракете, которая или нейтрализует «нарушителя» -чужеродного агента, или, если она оснащена «боеголовкой», разрушает специфическую клетку-мишень.

Answer 54

Молекула антитела (иммуноглобулина) состоит из двух «легких» (L) и двух «тяжелых» (Н) белковых цепей, которые соединены водородными связями и дисульфидными мостиками, расположенными в строго определенных местах. N-концевые участки L и Н-цепей образуют антигенсвязывающий сайт, отдельные области (домены) молекулы антитела выполняют разные функции. Антигенсвязывающие сайты состоят из трех участков, определяющих комплементарность антител к антигену (СDR.) и образующих вариабельные области (Vн и V1) на N-концах Н- и L-цепей. Кроме вариабельных (Vн и V1) каждая L-цепь содержит одну константную область или домен (СО, каждая Н-цепь -три константных области или домена (СН1 СН2, СН3)- При обработке антитела протеолитическим ферментом - папаином —образуются три фрагмента: два идентичных (Fab), каждый из которых содержит интактную L-цепь, связанную дисульфидным мостиком с Vн и Сн1 - до-менами Н-цепи, и один Fc, состоящий из двух соединенной дисульфид-ной связью с Сн2 и Снз - доменов Н-цепи. Fab-фрагмент, точнее его N-концевая часть, называемая Fv-фраг-ментом, обладает антигенсвязывающей активностью, присущей ин- . тактной молекуле антитела. После связывания антигена с интактным антителом запускаются реакции иммунного ответа: 1.Активируется система комплемента; компоненты этой системы разрушают клеточные мембраны, активируют фагоциты и генерируют сигналы, мобилизующие другие компоненты системы иммунного ответа. 2.В результате связывания Fc-участка антитела с Fс-рецептором эффекторной клетки, запускается реакция опосредованной антителами клеточной цитотоксичности. Активированная эффек-торная клетка высвобождает вещества, лизирующие чужеродную клетку, с которой связан РаЬ-участок молекулы антитела. 3.После связывания РаЬ-участка с растворимым антигеном, Рс-участок антитела может присоединиться к рецепторам фагоцитов, которые захватывают и разрушают комплекс антиген - антитело. Для облегчения доставки лекарственного вещества (ЛВ) к месту его действия используют несколько приемов: • Заключают в липосомы, липидная оболочка которых имеет высокое сродство к клеткам нужных органов. •Встраивают гены специфических токсинов в инфильтрующие опухоль лимфоциты, которые высвобождают эти токсины непосредственно в опухоли. • Присоединяют молекулы ЛВ к моноклональным антителам или их Fv-фрагментам, специфичным по отношению к белкам, находящимся на поверхности строго определенных клеток, например опухолевых (рис. 13, A). • Используют ЛВ в неактивной форме, переводя их в активное состояние при помощи ферментов. Чтобы такое превращение происходило только вблизи клетки-мишени, фермент присоединяют к моноклональному антителу, специфичному к поверхностному антигену этой клетки (рис. 13, Б). В обоих случаях моноклональное антитело связывается с одним специфическим белком на поверхности клетки-мишени.

Answer 55

Система свертывания крови состоит из тромбоцитов и содержащихся в них пластиночных факторов (аденозиндифосфата), тканевого тром-бопластина, серотонина, антиплазмина, фибронектина, тромбоспондина и др.), плазменных белков, синтезирующихся в клетках печени (протромбина, проконвертина, антигемофильных глобулинов, тромботро-пина, фибриногена и др.). Антисвертывающая система представлена плазмином (фибриноли-зином) - протеолитическим ферментом, находящимся в крови в неактивном состоянии (плазминоген), белками плазмы крови (протеинами С, 8, антитромбином III, тормозящими процесс образования фибрина, а также веществами, продуцируемыми (простациклин, тромбомодулин и др.) или фиксированными на эндотелиальных клетках (гепарин). При нарушении равновесия между этими двумя системами может возникать или повышенная кровоточивость, или тромбообразование, или сочетание того и другого. Наиболее частой причиной смерти являются тромбоэмболия мозговых или сердечных артерий. Известно, что тромб состоит из молекул фибрина, фактора свертывающей системы крови, образующего сеть в ответ на повреждение сосудистой стенки. В норме молекулы фибрина в образовавшемся тромбе расщепляются ферментом, способствующим растворению фибрина in vivo, - сериновой протеиназы плазмина, который образуется из плазминогена под действием активатора (рис. 14). Нередко эта биологическая система работает недостаточно эффективно, что приводит к закупорке артерий. В таких ситуациях для повышения уровня плазмина в крови было предложено использовать активатор плазминогена (АПг) в качестве терапевтического средства. Однако плазмин способен разрушать и предшественник фибрина - фибриноген (рис. 15), и если уровень фибриногена в результате терапии с использо- ванием АПг значительно снизится, могут произойти обширные внутренние кровотечения. К моноклональному антителу, специфичному к фибрину, присоединен АПг. Этот комплекс связывается с фибрином, находящимся в тромбе, АПг вызывает накопление плазмина вблизи тромба, и плазмин лизи-рует тромб. Тромболитическая терапия, осуществляемая активаторами плаз-миногена тканевого типа (ТАПг), широко используется при лечении острого инфаркта миокарда, закупорки мозговых и коронарных артерий, эмболии легких. Плазминоген человека представляет собой одноцепочечный глико-протеин м.м. 90000; его содержание в плазме составляет примерно 2 мкмоля/л. Плазминоген обладает способностью превращаться в плазмин с помощью природных активаторов плазминогена, находящихся в небольшом количестве в органах и тканях, либо с помощью бактериальной стрептокиназы. Одно из основных свойств АПг - способность участвовать в процессе фибринолиза. Эти ферменты, представляющие собой естественные тромболитические агенты, имеют огромное значение в борьбе с коронарными и церебральными тромбозами и тромбозами сосудов легких. Активирование плазминогена стептокиназой заключается в образовании на начальной стадии комплекса плазминоген - стрептокиназа, обладающего способностью активировать молекулу плазминогена; этот комплекс затем с помощью ферментативного механизма обеспечивает превращение плазминогена в плазмин. Плазмин (фибринолизин) является эндопептидазой широкого спектра действия. Как плазминоген, так и плазмин содержат по пять ди-сульфидных мостиков, за счет которых формируются специфические домены. Препарат является протеолитическим ферментом, образующимся при активации трипсином содержащегося в крови человека плазминогена. Он вызывает только наружный лизис тромба (преимущественно в венах), так как быстро нейтрализуется антиплазмином, в избытке циркулирующим в крови. Плазмин обладает свойствами активатора, переводящего эндогенный плазминоген в плазмин. Продукты деградации фибрина, образующиеся при его разрушении, препятствуют полимеризации мономеров фибрина и образованию тромбопластина. Однако плазмин может вызвать активацию свертывающей системы крови и повысить антифибринолитические свойства крови. Поэтому его вводят с гепарином. Генерируемый активатором плазминогена плазмин кроме растворения тромбов способен стимулировать • деление клеток, видоизменять клеточные поверхности, активировать специфические протеазы, превращать проинсулин и проадренокортикотропин в инсулин и АКТГ соответственно. С учетом м.м., энзиматических и серологических свойств, способности связывать фибрин плазмы крови АПг принято делить на активаторы тканевого и урокиназного типов.

Answer 56

Активаторы плазминогена тканевого типа. Содержание ТАПг широко варьирует в различных органах тканей: препарат, полученный из ткани матки человека, характеризуется м.м. 690.00 и состоит из двух полипептидных цепей с м.м. 31000 и 38000; фермент, экстрагированный из клеток сосудов трупа человека, имеет м.м. 60000 и состоит из двух близких по размеру полипептидов. Природный ТАПг может существовать как в виде протеолитически деградируемой двухцепочечной, так и одноцепочечной формы. Получают природный ТАПг методом культивирования клеток. Основной источник получения препарата - линия клеток меланомы человека; такой фермент - мТАПг характеризуется м.м. 72000 и, в зависимости от условий культивирования и очистки, может быть получен в одно- и двухцепочечной форме. Для очистки ТАПг, полученного из культуры клеток меланомы, применяют аффинную хроматографию с использованием пяти аффинных сорбентов: конканавалина А, п-аминобензамидина, имидинодиуксусной кислоты, борной кислоты, лизина - все марки 5PW. Метод получения рекомбинантного ТАПг (рТАПг) разработан в 80-х гг. XX в. Ген ТАПг расположен у человека в хромосоме 8. Технологи клонирования и экспрессии рТАПг в клетках Е. coli, S. cerevisiae и клетках животных позволили получать ТАПг в промышленных масштабах, провести широкое клиническое изучение и выйти на мировой рынок тромболитиков. Сравнительное изучение мТАПг и рТАПг в отношении тромболизи-са при инфаркте миокарда и других типов тромбозов показало полную идентичность их биологических тромболитических свойств. Лидерами в области разработки рТАПг (альтеплазы) являются фирмы «Genentech» и «Boehringer Ingelheim», выпускающие альтеплазу под торговыми названиями activase и actilyse. Активаторы плазминогена урокиназного типа. Урокиназа — активатор плазминогена, содержащийся в моче человека, состоит из двух полипептидных цепей (А и В), соединенных между собой дисульфид-ным мостиком, встречается в высоко- и низкомолекулярной формах (м.м. соответственно 55000 и 34000). Препарат получают из культуры клеток эмбриона почки человека. Урокиназа активирует плазминоген, превращая его в плазмин. Фибри-нолитический эффект наступает быстрее, чем от стрептокиназы. Препарат способен активировать фибринолиз внутри тромба (эндотромболиз) и на его поверхности (экзотромболизис). По клинико-фармакологичес-кой характеристике урокиназа близка к стрептокиназе. Урокиназа не обладает выраженными антигенными свойствами, поэтому при ее использовании меньшая опасность возникновения аллергических реакций и ее назначают повторно. Одноцепочечная форма урокиназы получила название проурокина-зы. Проурокиназа является проферментом урокиназы, содержится в различных органах и тканях, включая плазму крови. Проурокиназа — одноцепочечный гликопротеин, состоящий из 411 аминокислот. Гидролиз одной из пептидных связей плазмином способствует ее трансформации в урокиназу. Большое значение имеет получение активаторов плазминогена урокиназного типа методом генной инженерии. Ген урокиназы/проуро-киназы локализуется у человека в хромосоме 10; продукт экспрессии гена урокиназы, клонированного в Е. coli, содержит одну или две цепи в зависимости от присутствия ингибиторов протеаз в процессе очистки фермента. Оценка биологических и фибринолитических свойств реком-бинантной урокиназы (р-урокиназы), рекомбинантной проурокиназы (р-проурокиназы) и природной урокиназы, выделенной из мочи, показала, что рекомбинантные урокиназа и проурокиназа обладают лучшей тромбоселективностью и вызывают меньшее число побочных явлений, чем урокиназа. Стрептокиназа - тромболитик прямого действия, является активатором плазминогена, относится к тромболитикам 1 поколения. В очищенном виде стрептокиназа представляет собой пористую массу белого цвета без запаха, легко растворимую в воде, м.м. 40000—50000. Препарат получают из р-гемолитического стрептококка группы С. Это непрямой фибринолитик. Стрептокиназа стимулирует перевод циркупирующего в крови проактиватора в активатор, трансформирующий плазминоген в плазмин. Препарат способен проникать внутрь тромба и активировать в нем фибринолиз, чем выгодно отличается от плазмина. Продукты распада тромба, циркулирующие в крови, вызывают гипокоагуляцию, блокируют агрегацию эритроцитов и тромбоцитов, снижают вязкость крови. Среди тромболитических препаратов стрептокиназа занимает прочную позицию, что обусловлено доступностью получения ее из микробного сырья и относительно невысокой реактогенностью (антитела к стрептокиназе исчезают в течение 6 месяцев; иммунологическая реактогенность этого белка обычно проявляется лишь у лиц с отягощенным анамнезом, например, перенесших стрептококковую инфекцию). На мировом рынке медикаментов лидируют препараты стрептоки-назы из микробного сырья: кабиказа (фирма «Kabi Vitrum»), стрептаза (фирма «Hoechst»), стрептокиназа (фирма «Smith Kline»). Фирма «Phillips Petrolium» (США) запатентовала метод экспрессии стрептокиназы в S. cerevisiae. Экспрессируемый в дрожжах белок по м.м. и активности идентичен стрептокиназе, полученной из Streptococcus equisimilis. Метод рекомбинантных ДНК позволил получить высокий выход искомого продукта - 1г/1л среды. Методом рекомбинантных ДНК получен вектор, несущий ген стрептокиназы, адаптированный для трансформации в бактериальный геном (патент США). Запатентован метод (Германия) ферментационного получения стрептокиназы; генноинженерным способом получена плазмида, содержащая ген стрептокиназы. Экспрессия стрептокиназы получена трансформацией этой плазмиды в клетки Streptococcus. После ферментации таких клеток из культуральной жидкости выделена и очищена стрептокиназа м.м. 42000. Стрептодеказа — пролонгированный препарат стрептокиназы, относящийся к группе иммобилизованных ферментов, нанесенных на водорастворимую матрицу полисахаридной природы. Однократное введение средней терапевтической дозы обеспечивает повышение фибрино-литической активности крови в течение 48—72 ч. Рекомбинантный тканевой активатор плазминогена (актилизе) является гликопротеином (полным аналогом эндогенного вещества, вырабатываемого эндотелием), который после системного введения находится в плазме в неактивной форме до момента связывания с фибрином. После активации препарата он способствует переходу плазминогена в плазмин и ведет к растворению фибринового сгустка, повышая фибри-нолиз только в ткани тромба. Ацилированный комплекс стрептокиназы и плазминогена (торговое название эминаза) - тромболитик 2-го поколения, разработан и запатентован английской фирмой «Beecham». Ацильная группа, входящая в состав комплекса, защищает тромболитик от инактивации природным ингибитором L2-антиплазмином. По мере поступления eminase в кровяное русло начинается быстрое гидролитическое отщепление ацильной группы, высвобождение активированного комплекса происходит с постоянной скоростью. Комплекс действует почти исключительно на фибрин кровяного сгустка, не затрагивая фибриноген. Наиболее грозное побочное действие тромболитиков — возникновение внезапных кровотечений - проявляется при применении eminase весьма редко. Успех международных клинических испытаний eminase обеспечил признание этого тромболитического средства на мировом рынке. В качестве тромболитиков предложены химерные (гибридные) молекулы, содержащие домены ТАПг и урокиназы; эти гибридные молекулы характеризуются таким же сродством к фибрину и способностью к лизису тромбов, как и рТАПг. Химерные молекулы получают методом слияния концевой кДНК, кодирующей концевой аминосодержащий фрагмент ТАПг, ответственный за специфичность в отношении фибрина, с кДНК, кодирующей концевой карбоксисодержащий фрагмент проурониказы, ответственный за ферментативные свойства молекулы. Это соединение обладает специфичностью к фибрину, характерной для обеих молекул; лечебная доза этого препарата может быть в 4 раза меньшей, чем доза ТАПг и урокиназы, вводимых отдельно; прямым следствием снижения дозы является уменьшение вероятности возникновения побочного действия. Сконструированы химерные молекулы, содержащие фрагменты ТАПг, урокиназы и проурокиназы, клонированные в животных клетках (фирма «Ciba-Geigy», Швейцария). Разработаны генно-инженерные системы доставки тромболитиков (США). Описано строение моноклонального антитела, способного доставить тромболитический белок к месту образования тромба. Гены, ответственные за образование Р-цепи ТАПг, были внедрены в гибридомы, продуцирующие антитела, которые экспрессировали белок, способный избирательно доставляться к месту скопления фибрина, кроме того, такой активированный белок способен активировать плазминоген (фирма «Genentech»). Антикоагулянты. Гепарин и его производные принадлежат к числу наиболее безопасных препаратов. Гепарин относится к гуморальным факторам регуляции жидкого состояния крови и обладает высокой связующей способностью практически ко всем факторам системы коагуляции. Гепарин нейтрализует действие сериновых протеиназ и фибрино-вых систем за счет образования комплекса антитромбин Ш-гепарин (АТ-Ш-гепарин). Препараты гепарина гетерогенны и содержат фракции с высоким и низким средством связывания с АТ-Ш (АТ-Ш является ингибитором активаторов плазминогена). В медицинской практике используются препараты низкомолекулярного или фракционного гепарина — логипарин, фраксипарин, далтепа-рин, кливарин. Их относят к гепаринам II поколения. Получают низкомолекулярные гепарины методом ферментативной деполимеризации высокомолекулярного гепарина с помощью бактериальной гепариназы. Гепарин повышает активность фибринолитической системы за счет образования комплекса с антиплазмином. Гепарин накапливается на поверхности эндотелиальных клеток и клеток крови, создавая на их мембранах концентрацию в 100 раз большую, чем в плазме крови. Этим он придает поверхности эндотелия и тромбоцитов отрицательный заряд, препятствуя их адгезии и агрегации, а также высвобождению из них агрегирующих факторов. Низкомолекулярные гепарины не влияют на коагуляцию, т.е. они не изменяют время свертывания крови, но их терапевтический эффект больше, чем у высокомолекулярных форм. Это свидетельство того, что основное в действии гепарина — ограничение агрегации и адгезии тромбоцитов. Подтверждением данного механизма является и отсутствие корреляции между клинической эффективностью гепарина и увеличением времени свертывания крови. Антикоагулянт фрагмин (фирма «Kabi Vitrum», Швеция) получают из стандартного гепарина, извлекая из него составную часть, обладающую наибольшей антикоагулянтной активностью. Fragmin имеет достаточно длительный период полураспада, что позволяет применять его в виде однократной подкожной инъекции. Кроме антикоагулянтного и тромболитического действий отмечено его благоприятное влияние на снижение уровня триглицеридов в крови. ВОЗ рекомендовала использовать фрагмин в качестве международного стандарта при оценке лечебного эффекта и безопасности антикоагулянтов нового поколения. Методом органического синтеза (фирмы «Organon», Нидерланды и «Choy», Франция) получен гепариноид - аналог гепарина; активное начало этого препарата оставляют сульфатированные олигосахариды. Гирудин - антикоагулянт прямого быстрого действия, это белок, вырабатываемый слюнными железами медицинской пиявки (Hirudo medicinalis), которая в течение ряда лет использовалась для предотвращения тромбоэмболии мелких сосудов. Гирудин является сильным и специфичным ингибитором тромбина и относится к группе противо-свертывающих препаратов прямого быстрого действия, препятствующих образованию и отложению нитей фибрина. Он инактивирует связанный с фибрином тромбин в тромбах. Существует несколько близкородственных вариантов гирудина (HV1,HV2, HV3). Наиболее изучен HV], представляющий белок с м.м. около 7000, состоящий из 65 аминокислотных остатков. Гирудин ингибирует только тромбин и неактивен в отношении трипсина и плазмина. Введение гирудина не влияет на работу сердца, органов дыхания, иммунной системы. В настоящее время гирудин получают с использованием технологии рекомбинантных ДНК. Ген герудина экспрессирован в S. cerevisiae (фирмы «Francgene», «Sanofi», Франция); для очистки препарата использована ВЭЖХ. Фирмой «Ciba Geigy» разработан метод экспрессии частично де-сульфатированного варианта гирудина (десульфатогирудина) в S. cerevisiae. Рекомбинантный гирудин с одной отсутствующей сульфо-группой по антикоагулянтной активности превосходит гепарин. Белки С и S являются важными факторами антикоагулянтной системы. Белок С был впервые описан в 1960 г. как аутопротромбин П-а и лишь в 1976 г. выделен в чистом виде. Белок С-гликопротеин м.м. 62000 состоит из двух субъединиц, связанных дисульфидным мостиком, содержит около 10 аминокислотных остатков у-карбоксиглюта-миновой кислоты. Белок С является витамин-К-зависимым ингибитором свертывающей системы. Имеются данные, что снижение уровня белка С в крови связано с риском возникновения тромбозов, причем дефицит этого белка бывает наследственным и приобретенным; так, при недостатке белка С может развиться тромбофлебит. Дефицит белка С наблюдается при заболеваниях печени (возможно, синтез белка С происходит в этом органе). Белок S является кофактором белка С и образует с последним активированный комплекс на поверхности фосфолипидных мембран тромбоцитов, эндотелиальных и других клеток; в результате каталитическая способность белка С возрастает. Белок S также является витамин-К-зависимым и имеет высокое средство к отрицательно заряженным фосфолипидам. Белок S - гликопротеид с м.м. 69000. Разработана технология получения рекомбинантного белка С (фирма «Eli Lilly») в культуре клеток почек, трансформированной аденовирусом. Очищенный белок на 90% представлен двухпептидным компонентом и на 10% однопептидным, по активности не уступает белку С, находящемуся в плазме крови человека. Генноинженерный препарат белка С предложен для лечения последствий ортопедической и абдоминальный хирургии, легочной эмболии. Два рекомбинантных гибрида белка С (антикоагулянтной и фибри-нолитической активности) (фирма «Hoechst Japan»), не уступающие белку С из крови человека, предупреждают острый инфаркт миокарда и послеоперационные тромбозы. В 1982 г. выделен и охарактеризован еще один кофактор активации белка С - тромбомодулин, локализованный в мембране эндотелиальных клеток и являющийся кальций-зависимым ингибитором коагуляции и агглютинации тромбоцитов. Тромбомодулин — неразветвленный глико-протеин с м.м. 68000—77000, содержит 117 аминокислотных остатков. Выделен структурный ген тромбомодулина, ген клонирован с последующей экспрессией в клетках почек обезьяны (фирма «Asahi Chemical», Япония).

Answer 57

Аминокислоты широко применяют в медицине для терапии послеоперационных больных, при лечении заболеваний ЦНС, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, печени (серотонин, аспа-рагин, валин, гистидин, глицин, глутамин и глутаминовая кислота, изо-лейцин, лейцин, метионин, пролин, тирозин, триптофан, фенилаланин, цистеин); в пищевой промышленности в качестве усилителей вкуса и аромата, антиоксидантов и пищевых добавок (аланин, аспарагиновая кислота, глицин, глутаминовая кислота, лизин, цистеин); в сельском хозяйстве - в качестве кормовых добавок (лизин, треонин); в химической промышленности - как исходные вещества при синтезе полимеров и производстве косметических средств. Ежегодно в мире производится более 800000 т аминокислот стоимостью более 5 млрд долларов; при этом больше половины общего объема производства приходится на долю L-глутаминовой кислоты, которую используют для получения широко известного усилителя вкуса и аромата - натрия глутамата. В промышленном масштабе аминокислоты получают, в основном, экстракцией из белковых гидролизатов или очисткой продуктов метаболизма двух неспорулирующих грамположительных почвенных бактерий - Corynebacterium или Brevi bacterium spp. Обычно для повышения продуктивности этих микроорганизмов используют мутагенез с последующим отбором штаммов - сверхпродуцентов определенных аминокислот, но такой способ получения штаммов требует много времени и эффективность его невелика. Альтернативные подходы — выделение и изменение специфических генов, кодирующих ключевые ферменты определенных биохимических реакций. Например, генноинженерный способ получения аминокислоты триптофана, синтезируемой С. glutami-cum, одного из видов Corynebacterium. Для этого в клетки С. glutamicum дикого типа введена копия гена, кодирующего антранилатсинтазу, фермента, лимитирующего синтез триптофана. Высокий уровень биосинтеза триптофана достигают введением в клетки С. glutamicum модифицированных генов трех ключевых ферментов : 3 -дезокси-Д-арабиногептулозонат-7-фосфатсинтазы, антрани-латсинтазы и антранилатфосфорибозилтрансферазы. В качестве альтернативы для синтеза аминокислот можно использовать Е. coli. Известно, что важным регулятором функций клеток, тканей и органов, осуществляемых через жидкие среды организма, является а2-макроглобупин (МГ). Этот белок способен ингибировать активность протеолитических ферментов, транспортировать цитокины, регулировать процессы эндоцитоза, кооперации различных клеток крови, пре-зентировать микроорганизмы и гены. Из плазмы крови человека очисткой (a2-МГ, сочетающей дробное осаждение полиэтиленгликолем, анио-нообменной и металхелатной аффинной хроматографией, получен на-тивный белок а2-МГ, имеющий уникальные регуляторные свойства, -высокую ингибирующую активность в отношении протеиназ; препарат (НПО «Вектор», Новокузнецкий ГИУВ) показан при воспалительных процессах, передозировках протеиназ, септических состояниях, вызванных микроорганизмами. На основе нативного а2-МГ получены стабильные, имеющие полную биологическую совместимость комплексы с плазмином и интерфероном а-ИФ2. Доставка комплекса а2-МГ-ИФ2 непосредственно в опухоль весьма перспективна в онкологии. Природные пептиды любого происхождения универсальны, они оказывают защитное действие на организм млекопитающих, стимулируя работу одной из главных систем — иммунной. Ценным сырьем для получения полипептидов являются гидробионты. Первым препаратом гидробионтов был ганглин, полученный в 1981 г. в НПО «Биомед» из ганглиев тихоокеанских кальмаров методом ультрафильтрационной очистки и выделения пептидов. Ганглин содержит 45 пептидных фракций. Иммуномодулирующие свойства ганглина определили его применение для устранения любых вторичных иммунодефицитов. Препарат оказывает регулирующее влияние на реакции клеточного и гуморального звеньев иммунитета и неспецифическую резистентность организма, усиливает функциональную активность ПМЯЛ и макрофагов, стимулирует образование, дифференцировку и функциональную активность Т-лимфоцитов, синтез специфических антител в сыворотке крови, уменьшает развитие аутоиммунных процессов, обладает антигистамин-ными, антисеротониновыми, противовоспалительными свойствами. Ганглин зарегистрирован в качестве пищевой добавки для ветеринарии, корригирующей иммунодефициты и оказывающей положительное влияние на гомопоэз. Препарат гидробионтов - молокин - получен из молок лососевых рыб; наряду с иммунорегулирующей активностью обладает гонадо-тропными свойствами. Препарат вермин (НПО «Биомед») представляет собой очищенную, стерильную, лиофильно высушенную смесь белков и пептидов, экстрагированных из гомогената червей Eisenia foetida; препарат нетоксичен, не проявляет мутагенной активности; обладает ферментативной активностью оксидоредуктаз, трансфераз и гидролаз, оказывает иммуномо-дулирующее действие. Мазь на основе вермина предложена для лечения длительно незаживающих гнойных ран.

Answer 58

В настоящее время для крупномасштабного производства L-аскорбиновой кислоты (витамина С) используют преимущественно трудоемкий процесс, включающий одну микробиологическую стадию и несколько химических. Исходным субстратом для него является D-глюкоза (рис. 16). На последнем этапе этого процесса 2-кето-L-гулоновая кислота (2-I KLG) превращается в кислых условиях в L-аскорбиновую кислоту. Биохимические исследования метеболизма различных микроорганизмов показали, что 2-KLG можно получить, включая совместное культивирование микроорганизмов Corynebacterium и Erwinica herbicola для превращения глюкозы в 2-KLG. Однако условия культивирования, оптимальные для одного организма, неприемлемы для другого, что влечет спонтанное «вымывание» из среды одного из них. В подобных случаях можно культивировать микроорганизмы последовательно, но такой процесс трудно сделать непрерывным, так как для роста микроорганизмов необходимы существенно разные среды (рис. 17). Наиболее простой способ - создание одного микроорганизма, способного превращать D-глюкозу в 2-KLG, состоит в выделении гена 2,5-DКG-редуктазы Corynebacterium и введении его в Erwinica herbicola (рис. 18). Трансформированные клетки Erwinica herbicola активно превращают D-глюкозу непосредственно в 2-KLG. При этом собственные ферменты Erwinica herbicola, локализованные во внутренней мембране бактериальной клетки, преобразуют глюкозу в 2,5-DKG (2,5-дикетоглюкановая кислота), а 2,5-DКG-редуктаза, локализованная в цитоплазме, катализирует процесс превращения 2,5-DKG в 2-KLG. Следовательно, с помощью генетических манипуляций удалось в одном организме осуществить метаболические реакции, протекающие в столь разных микроорганизмах. Этот гибрид приобрел способность синтезировать конечный продукт комбинированного метаболического пути. Такой организм используется как фабрика для производства 2-KLG, заменяющая три стадии в том процессе получения L-аскор-биновой кислоты, который доминирует и в настоящее время.

Answer 59

Инсулин Сомототропный гормон (СТГ) или гормон роста человека

Answer 60

Инсулин синтезируется (3-клетками островков Лангерганса поджелудочной железы; 70% мРНК, выделенных из этих клеток, кодируют именно этот белок. Человеческий инсулин — полипептид с м.м. 5808, состоящий из 51-й аминокислоты, которые образуют две соединенные дисульфидными мостиками полипептидные цепи (одна цепь состоит из 21 аминокислоты, так называемая цепь А; другая - из 30 аминокислотных остатков, так называемая цепь В). Аминокислотный состав цепей видоспецифи-чен. Предшественник инсулина продуцируется внутри Р-клеток посредством ДНК- и РНК-управляемого синтеза. Длинная цепь проинсулина в аппарате гольджи упаковывается в гранулы, где в результате гидролиза удаляются четыре аминокислоты (обозначенные пунктом на рис. 19) с образованием инсулина и связывающего пигмента, называемого С-пептидом. Инсулин и С-пептид в эквивалентных концентрациях секре-тируются в ответ на все стимуляторы секреции инсулина (глюкозу, маннозу и некоторые аминокислоты — лейцин, аргинин). Выделяется также небольшое количество нативного или частично гидролизованного проинсулина, который оказывает некоторое гипогликемическое действие. В гранулах р-клеток инсулин депонируется в виде кристаллов, состоящих из двух атомов цинка и шести молекул инсулина. В целом, человеческая поджелудочная железа содержит до 8 мг инсулина, что составляет приблизительно 200 биологических «единиц» (количество единиц определяют по массе препарата; существующий инсулиновый стандарт, используемый в аналитических целях, составляет 28 ЕД/мг). Инсулин обладает мощным действием, охватывающим биосинтез нуклеиновых кислот, белков, обмен углеводов, липидов, продукцию высокоэнергетических соединений. Инсулин регулирует углеводный обмен, усиливает усвоение тканями глюкозы и способствует превращению ее в гликоген, облегчает проникновение глюкозы в клетки тканей. Будучи специфическим средством терапии сахарного диабета, инсулин снижает гепергликемию и глюкозурию, пополняет депо гликогена в мышцах и печени, уменьшает образование глюкозы, снимает диабетическую липемию, улучшает общее состояние больного. Единственное отличие больного человека от здорового в том, что здоровые получают этот гормон благодаря собственной поджелудочной железе, больные — из рук государства. Сахарным диабетом I типа - инсулинзависимым диабетом (ИЗСД) -официально больны свыше 3 млн российских граждан, «неофициально» - до 10 млн. Известно, что ИЗСД (тяжелая форма, при отсутствии лечения приводящая к кетозу), наряду с сердечно-сосудистыми и онкологическими заболеваниями занимает одно из ведущих мест по медико-социальной значимости и является причиной ранней инвалидности и высокой смертности. Диабет II типа - инсулиннезависимый (ИНЗСД) включает более легкие формы диабета. Диабетом этого типа чаще болеют тучные люди. История открытия инсулина связана с именем русского врача И.М. Соболева (вторая половина 19 в.), доказавшего, что уровень сахара в крови человека регулируется специальным гормоном поджелудочной железы. В 1922 г. инсулин, выделенный из поджелудочной железы животного, был впервые введён 10-летнему мальчику (Торонто), больному диабетом. Результат превзошёл все ожидания, и уже через год американская фирма «Eli Lilly» выпустила первый препарат животного инсулина. Поджелудочная железа крупного рогатого скота (КРС) и свиней поставляется бойнями, где опытный персонал по разработанной методике извлекает железы из туш, их быстро замораживают (оптимальная температура - 70 °С) и в вагонах-рефрежераторах направляют на фармацевтические предприятия, где экстрагируют гормон. Масса поджелудочной железы КРС составляет в среднем 200-250 г, для получения 100 г кристаллического инсулина требуется 1000-1200 кг исходного сырья. Бычий (говяжий) гормон, в отличие от свиного, обладает несколько большей антигенностью для человека. После получения первой промышленной партии инсулина в последующие несколько лет пройден огромный путь его выделения и очистки, в результате гормон стал доступен для лечения больных сахарным диабетом 1 типа. Для адекватного контроля уровня глюкозы в крови инсулин нужно было вводить подкожно 4 раза в сутки. В 1935 г. датский исследователь Хагедорн оптимизировал действие инсулина в организме, предложив пролонгированный препарат - про-тамин-цинк-инсулин (вводили один раз в сутки). Первые кристаллы инсулина были получены в 1952 г.; развитие методов очистки гормона (иммуноэлектрофорез, ВЭЖХ) от других гормональных веществ (глюкагона - антагониста инсулина и соматостатина, последний подавляет выделение инсулина и глюкагона) и продуктов деградации инсулина позволили получить гомогенный инсулин, называемый однокомпонентным. В 1954 г. английский биохимик Г. Сенджер получил Нобелевскую премию за расшифровку структуры инсулина. Синтез обеих цепей инсулина и соединение их дисульфидными связями был проведён в 1963-1965 гг. В начале 70-х гг. советскими учёными А. Юдаевым и С. Швачкиным был предложен химический синтез инсулина. Осуществить в промышленном масштабе столь дорогостоящий и сложный синтез полипептидного гормона, состоящего из десятков аминокислотных остатков, нерентабельно, в том числе и по причине малого выхода. В 70-е гг. 20 в. шло прогрессирующее улучшение степени очистки инсулинов, что уменьшило проблемы, обусловленные инсулиновой аллергией, нарушениями работы почек, расстройством зрения и иммунной резистентностью к инсулину. Со времени открытия и до начала 80-х гг. использовали инсулин, получаемый из поджелудочной железы КРС и свиней. Инсулин КРС отличается тремя аминокислотами, свиной — одной аминокислотой от инсулина человека. Наиболее эффективный гормон для заместительной терапии при сахарном диабете - гомологичный инсулин, т.е. инсулин человека. В 1980 г. датская фармацевтическая компания «Novo» разработала метод превращения инсулина свиньи в инсулин человека ферментативным замещением аланина, последний является 30-й аминокислотой в цепи В, на остаток треонина с последующей хроматографической очисткой продукта, в результате был получен однокомпонентный инсулин человека 99% чистоты. Достижения молекулярной биологии позволили установить, что биосинтез инсулина в р-клетках островковой ткани происходит по следующим основным этапам: —закодированная информация о структуре гормона содержится в инсулиновом гене (участок ДНК) 11-й хромосомы; — в результате стимулирующего действия, прежде всего глюкозы и некоторых других веществ, эта информация списывается РНК-полимеразой с инсулинового гена в виде мРНК на рибосомах, в которых осуществляется соединение аминокислот с образованием белков. На рибосомах происходит сборка полипептидной цепи из 109 аминокислот с образованием препроинсу- лина под влиянием рестриктаз, в результате образуются фрагменты от нескольких сотен до нескольких тысяч нуклеотидов; —при синтезе препроинсулина в р-клетках поджелудочной железы первые 23 аминокислоты «проводят» молекулу через мембрану клетки. Эти аминокислоты отщепляются рестриктазами и образуется пептид проинсулин, состоящий из 86 аминокислот. Молекула проинсулина сворачивается таким образом, что начальный и конечный её сегменты сближаются, а центральная часть молекулы удаляется под влиянием ферментов рестрикции; роль центральной части сводится к правильному взаимному расположению двух цепей инсулина. В Великобритании с помощью Е. coli синтезированы обе цепи человеческого инсулина, которые затем были соединены в молекулу биологически активного гормона. Чтобы одноклеточный организм мог синтезировать на своих рибосомах молекулы инсулина, необходимо снабдить его нужной программой, т.е. ввести ему ген гормона. Химическим способом (операцию проводят специалисты биохимики) получают ген, программирующий биосинтез предшественника инсулина или два гена, программирующие в отдельности биосинтез цепей А и В инсулина. Следующий этап - включение гена предшественника инсулина (или гены цепей инсулина порознь) в геном Е. coli - особого штамма кишечной палочки, выращенного в лабораторных условиях; эту задачу выполняет генная инженерия. Из Е. coli вычленяют плазмиду соответствующей рестриктазой. Синтетический ген встраивается в плазмиду (клонированием с функционально активной С-концевой частью (B-галактозидазы Е. coli). В результате Е. coli приобретает способность синтезировать белковую цепь, состоящую из галактозидазы и инсулина. Синтезированные полипептиды отщепляют от фермента химическим путём, затем проводят их очистку. В бактериях синтезируется около 100000 молекул инсулина на бактериальную клетку. Природа гормонального вещества, продуцируемого Е. coli, обусловлена тем, какой ген встраивается в геном одноклеточного организма. Если клонирован ген предшественника инсулина, бактерия синтезирует предшественник инсулина, который подвергается затем обработке рестриктазами для отщепления препептида с вычленением С-пептида, вследствие чего получается биологически активный инсулин. Для получения очищенного инсулина человека выделенный из биомассы гибридный белок подвергают химико-ферментативной трансформации и соответствующей хроматографической очистке (фронтальной, гель-проникающей, анионообменной). В Институте биоорганической химии РАН получен рекомбинант-ный инсулин с использованием генно-инженерных штаммов Е. coli. Из ■ выращенной биомассы выделяется предшественник, гибридный белок, экспрессируемый в количестве 40% от всего клеточного белка, содержащий препроинсулин. Превращение его в инсулин in vitro осуществляется в той же последовательности, что и in vivo — отщепляется лидирующий полипептид, препроинсулин превращается в инсулин через стадии окислительного сульфитолиза с последующим восстановительным замыканием трёх дисульфидных связей и ферментативным вычленением связывающего С-пептида. После ряда хроматографических очисток, включающих ионообменные, гелевые и ВЭЖХ, получают человеческий инсулин высокой чистоты и природной активности. Использование аффинной хроматографии значительно снизило содержание в препарате загрязняющих белков с более высокой м.м., чем у инсулина. К таким белкам относятся проинсулин и частично расщепленные проинсулины, которые способны индуцировать выработку ан-тиинсулиновых антител. Стандартизация инсулина по загрязнению классифицирует препараты на обычные, содержащие проинсулина более 1%, монопиковые - менее 0,3% п, улучшенные монопиковые - менее 0,005% и монокомпонентные, содержащие менее 0,001% проинсулина. Использование человеческого инсулина с самого начала терапии сводит к минимуму возникновение аллергических реакций. Наиболее частые осложнения инсулиновой терапии - гипогликемические состояния, основными признаками избытка инсулина являются нарушения функции ЦНС (спутанность сознания, странное поведение, кома). Компания «Eli Lilly» в массовом производстве человеческого инсулина использует технологию рекомбинантных ДНК, помещая кДНК гена человеческого проинсулина в Е. coli или S. serevisae и гидролизуя наработанный проинсулин до молекулы инсулина. Человеческие инсу-лины этой фирмы носят название «Хумулин». В медицинской практике используют рекомбинатные человеческие инсулины из серии Хумулин («Eli Lilly») — регулярный, НПХ, ленте, ультраленте и их комбинированные составы. Человеческий инсулин быстрее абсорбируется и независимо от формы препарата имеет более короткую длительность действия, чем животные инсулины. Человеческие инсулины менее иммуно-генны, чем свиные, особенно смешанные бычьи и свиные инсулины. В молекуле инсулина обнаружены области, играющие повышенную роль в его физико-химических и биологических свойствах. При внесении мутационных изменений в аминокислотную последовательность этих областей, существенным образом изменяются свойства молекулы з целом. Удалось получить аналоги с модификацией В-цепи, что привело к значительному увеличению гормональной активности по сравнению с природным инсулином. Контроль качества генноинженерного инсулина предполагает контроль дополнительных показателей, характеризующих стабильность рекомбинантного штамма и плазмиды, отсутствие постороннего генетического материала в препарате, идентичность экспрессируемого гена и др. (всего 22 показателя). В настоящее время в медицинской практике используют инсулины трех типов: короткодействующие с быстрым началом эффекта; средней продолжительности действия; длительного действия с медленным проявлением эффекта. Инсулин короткого действия — регулярный инсулин — представляет собой короткодействующий растворимый при нейтральном значении рН кристаллический цинк-инсулин, эффект которого развивается в течение 15 мин после подкожного введения и продолжается 5-7 ч. С целью увеличения длительности действия все другие препараты инсулина модифицированы и при растворении в нейтральной среде образуют суспензию. Они содержат протамин в фосфатном буфере — про-тамин-цинк-инсулин и НПХ (нейтральный протамин Хагедорна) — НПХ-инсулин или различные концентрации цинка в ацетатном буфере —инсулины ультраленте, ленте, семиленте. Препараты инсулина средней длительности действия содержат протамин, представляющий белок средней м.м. 4400, богатый аргинином и получаемый из молок радужной форели. Для образования комплекса требуется соотношение протамина и инсулина 1:10. После подкожного введения протеолитические ферменты разрушают протамин, позволяя инсулину всасываться. НПХ-инсулин не изменяет фармакокинетический профиль смешиваемого с ним регулярного инсулина. НПХ-инсулин предпочтительнее инсулина ленте в качестве компонента средней длительности действия в терапевтических смесях, содержащих регулярный инсулин. В фосфатном буфере все инсулины (свиной, бычий, человеческий) легко образуют кристаллы с цинком, но только кристаллы бычьего инсулина обладают достаточной гидрофобностью, чтобы обеспечить замедленное и стабильное высвобождение инсулина, характерного для ультраленте. Цинковые кристаллы свиного инсулина растворяются быстрее, эффект наступает раньше, длительность действия короче. Поэтому не существует препарата ультраленте, содержащего только свиной инсулин. Монокомпонентный свиной инсулин выпускают под названием инсулин-суспензия, инсулан-нейтрал, инсулин-изофан, инсулин-аминохинурид. Инсулин ленте - это смесь 30% инсулина семиленте (аморфный преципитат инсулина с ионами цинка в ацетатном буфере, эффект которого развеивается относительно быстро) с 70% инсулина ультраленте (плохо растворимый кристаллический цинк-инсулин, имеющий замедленное начало и пролонгированное действие). Эти два компонента обеспечивают комбинацию с относительно быстрой абсорбцией и стабильным длительным действием, делая инсулин-ленте удобным терапевтическим средством. При введении инсулина в виде аэрозоля на слизистую оболочку носа эффективный уровень препарата в плазме достигается быстро, однако, длительное интраназальное введение инсулина оказывает токсическое действие на слизистую оболочку.

Answer 61

СТГ - пептидный гормон, состоящий из 191 аминокислоты, секре-тируется передней долей гипофиза. Впервые гормон был выделен и очищен в 1963 г. из гипофиза, полученного из трупного материала. Дефицит этого гормона приводит к гипофизарной карликовости, частота встречаемости которой оценивается от 7 до 10 случаев на миллион человек (среди детей западных стран она составляет 1 на 5000 человек). Гормон видоспецифичен и является единственным средством лечения детей, страдающих от его недостатка; внутримышечное введение СТГ 10 мг/кг в течение года по три инъекции в неделю, увеличивает рост в течение первого года лечения более чем на 6 см. Для достижения более ощутимых результатов введение гормона необходимо продолжать от возраста 4-5 лет до половой зрелости и даже далее. Из одного трупа удаётся получить 4-6 мг соматотропина в пересчете на конечный фармацевтический препарат. Общего количества фармацевтического препарата, выпускаемого компаниями крупных производителей СТГ, хватало для лечения лишь одной трети случаев гипофизарной карликовости в развитых странах; недостаток соматотропина оказался ещё более острым с учетом других случаев его применения (незаживающие переломы, ожоги, язвы, нару1 шение гемопоэза). К тому же возникли проблемы, связанные с гетерогенностью гормона, выделяемого из трупного материала. Несмотря на совершенствование выделения и очистки гормона, у 5% больных, получавших препарат, вырабатывались антитела, которые сводили на нет его биологическую активность. Кроме того, гипофизарный материал заражён нейро-токсическим вирусом с необычайно длительным инкубационным периодом, поэтому дети, получавшие СТГ, нуждались в многолетнем медицинском наблюдении. Вирус, содержавшийся в препаратах СТГ, нередко приводил к летальному исходу. С 1985 г. ВОЗ запрещено применение гормона, выделяемого из человеческих гипофизов. Рекомбинантный соматотропин, получивший название соматрем, стал вторым (после человеческого инсулина) биосинтетическим фармацевтическим препаратом. СТГ, биологически чистый и свободный от вирусных загрязнений, впервые был получен в 1980 г. фирмой «Genen-tech». Гормон, синтезированный в генетически сконструированных клетках кишечной палочки, отличается от гормона, выделенного из гипофиза, дополнительным остатком метионина на NН2-конце молекулы (гормон обладает биологической активностью нативного гормона и даже большим эффектом, чем гормон роста из гипофиза, по-видимому, по причине большей чистоты). У детей, страдающих гипофизарной карликовостью, зарегистрирован прирост 8-18 см в год, что несколько больше эффекта гормона, полученного из гипофиза. На первом этапе клонировали двунитевую ДНК-копию мРНК и расщеплением рестрикцион-ными эндонуклеазами получили последовательность, которая кодирует всю аминокислотную последовательность гормона, за исключением первых 23 аминокислот. Затем клонировали синтетический полипептид, соответствующий аминокислотам от 1-й до 23-й. Далее два фрагмента объединяли, затем «подстроили» к паре промоторов (промотор — специфическая последовательность в ДНК, необходимая для инициации транскрипции РНК-полимеразы) и участку связывания рибосом. Конечный выход гормона составил 2,4 мкг на 1 мл культуры Е. coli (100000 молекул гормона на клетку). СТГ, синтезированный в бактериях, обладал нужной м.м. и не связан с каким-либо бактериальным белком, от которого его необходимо было бы отщеплять. Изменяя аминокислотную последовательность СТГ, т.е. его первичную структуру, посредством модификации кодирующего его гена, в бактериальных клетках можно синтезировать аналоги гормона, очень важные для изучения активных участков молекулы (например, участков, которые стимулируют рост или оказывают действие на неоглюко-генез) и этиологии карликовости на молекулярном уровне. Используя методы рекомбинантных ДНК, можно синтезировать и другие факторы роста и факторы дифференцировки тканей, выделив вначале их мРНК, затем получив соответствующие гены. Это относится к соматомедину А, стимулирующему фиксацию серы в хряще, образование которого индуцируется соматотропином. В 1982 г. выделен и синтезирован полипептид, содержащий из 44 аминокислотных остатков, обладающий полной биологической активностью гипоталамического рилизинг-фактора соматотропина (СТГ-РФ). Введение СТГ-РФ способно компенсировать недостаток соматотропина. Применение СТГ-РФ возможно не только для лечения гипо-физарной карликовости, но и при некоторых формах диабета и для ускорения регенерации тканей у людей, получивших сильные ожоги.

Answer 62

Эритропоэтин (греч. eritrhros - красный + poietikos - создающий, производящий; син.: эритро-лоэзстимулирующий фактор) - гормон гликопротеиновой природы, стимулирующий пролиферацию и диффе-ренцировку эритропоэтин-чувствительных клеток в морфологически распознаваемые эритробласты. Это полипептид, состоящий из 165 аминокислот с м.м. 30400. Эритропоэтин стимулирует пролиферацию и дифференцировку клеток эритроидного ростка, действуя на специфические рецепторы эритропоэтина, которые имеются на предшественниках эритроцитов в костном мозге. Эндогенный эритропоэтин выделяется в почках в ответ на тканевую гипоксию. При анемии индукция эритропоэтина повышена, что стимулирует образование эритроцитов в костном мозге и приводит к коррекции анемии. Эритропоэтин показан больным с почечной недостаточностью и выраженной анемией. Он повышает уровень гемоглобина и обычно снимает необходимость переливания крови у этих пациентов; эритропоэтин полезен при СПИДе и раке. Эритропоэтин выделен первым из всех гемопоэтических факторов (впервые получен из мочи больных тяжелой анемией). Получение значимых количеств эритропоэтина человека из природных источников практически невозможно из-за низкого его содержания в сырье. С использованием генно-инженерной технологии в культуре клеток млекопитающих (штамм СНО) получают рекомбинантный человеческий эри-тропоэтин. Производство препарата основано на комбинации иммуно-аффинной и ионно-обменной хроматографии и позволяет получать практически гомогенный, мономерный, полностью активный белок, не содержащий значимых примесей. Уже много лет получаемый по новой технологии эритропоэтин является ведущим продуктом предприятия Amgen, Калифорния (США). Годовой оборот от его производства составляет более 3 млрд долларов. Эритропоэтин принадлежит к четырем генно-инженерным препаратам, производимым в России. В частности, НПО «Микроген» выпускает «Эритростим», представляющий высокоочищенный (99,5 %) рекомбинантный эритропоэтин человека с сывороточным альбумином в виде раствора на изотоническом нитратном буфере.

Answer 63

Вирусы — облигатные (безусловные) внутриклеточные паразиты, чья репликация полностью зависит от процессов синтеза ДНК, РНК и белков в клетке хозяина. Репликация вирусов включает несколько этапов: адсорбция и проникновение в клетку; синтез ранних, неструктурных белков, например, полимераз, нуклеиновых кислот; - синтез РНК или ДНК; синтез конечных структурных белков; сборка (созревание) вирусных частиц и их выход из клетки. При многих вирусных инфекциях репликация вируса достигает максимума во время появления первых клинических признаков заболевания или даже ранее. Формированию у реципиента иммунитета к патогенным микроорганизмам способствует вакцинация. Антитела, вырабатываемые в ответ на введение вакцины в организм, запускают иммунный ответ - вырабатываются антитела, которые при последующей инфекции блокируют пролиферацию патогенного микроорганизма и не позволяют развиться заболеванию. Эффект вакцинации был открыт более 200 лет назад (1796 г.) врачом Эдвардом Дженнером, доказавшим, что человек, перенесший коровью оспу, не очень тяжелую болезнь крупного рогатого скота, становится невосприимчив к оспе натуральной. Натуральная оспа - высоко-контагиозное (заразное) заболевание, с высокой смертностью; даже, если больной не погибает, у него нередко возникают различные уродства, психические расстройства, слепота. Э. Дженнер публично провел прививку коровьей оспы 8-летнему мальчику Джеймсу Фиппсу, использовав для этого экссудат из пустулы больной коровьей оспой, а затем, через определенное время, дважды инфицировал ребенка гноем из пустулы больного натуральной оспой. Все проявления заболевания ограни- • чились покраснением в месте прививки, исчезнувшим через несколько дней. Начиная с первой вакцины, созданной Э. Дженнером, большинство человеческих противовирусных вакцин созданы на основе убитых (инактивированных) патогенных микроорганизмов или живых, но не вирулентных (аттенуированных) штаммов. Этот подход достаточно эффективен и предотвращает распространение многих вирусных инфекций, однако его применение ограничено рядом причин: невозможностью культивирования всех патогенных микроорганизмов; потенциальной опасностью в работе с патогенными микроорганизмами и вирусами; возможностью ревертировать (возвращаться к исходному вирулентному штамму) аттенуированных штаммов (инактивация часто бывает неполной); высокой стоимостью производства традиционных вакцин (титр вирусов животных и человека в культуре и скорость их размножения, как правило, невысоки). Технология рекомбинантных ДНК позволяет создавать новое поколение вакцин более безопасных и эффективных, менее дорогих, не имеющих ограничений в применении. При этом используют разные подходы: 1.Патогенный микроорганизм модифицируют, делегируя (убирая) гены, ответственные за вирулентность, при этом сохраняется способность штамма вызывать иммунный ответ. Получаются живые вакцины, содержащие непатогенные микроорганизмы, которые не могут ревертировать и становиться патогенными. 2. Гены или их сегменты, кодирующие основные антигенные детерминанты (белки) патогенных микроорганизмов, экспрессиру-ют в альтернативном хозяине, например Е. coli, получают нужный продукт в большом количестве и используют его как вакцину. Такие вакцины, содержащие лишь отдельные компоненты патогенного микроорганизма, называют субъединичными вакцинами. Достоинства субъединичных вакцин состоят в том, что препарат, содержащий очищенный иммуногенный белок, стабилен и безопасен, его химические свойства известны, в нем отсутствуют дополнительные белки и нуклеиновые кислоты, которые могут быть причиной нежелательных побочных эффектов в организме-хозяине. Недостатки субъединичных вакцин — очистка специфического белка высока по стоимости; его конформация после выделения может отличаться от той, которую он имеет in situ (т.е. в составе вирусного капсида или оболочки), что может повлечь изменение его антигенных свойств. 3. Клонированные гены, кодирующие основные антигенные детерминанты патогенного организма, встраивают в геном непатогенного носителя (обычно вируса) и получают живую безопасную, не содержащую болезнетворных микроорганизмов вакцину. Живые вакцины, как правило, более эффективны, чем неживые или субъединичные. Одним из новых направлений создания рекомбинантных вакцин является разработка ДНК-вакцин (так называемых генных, полинуклео-тидных вакцин, вакцин из нуклеиновых кислот). Принцип применения ДНК-вакцин заключается в том, что в организм пациента вводят молекулу ДНК, содержащую гены, кодирующие иммуногенные белки патогенного организма и генетические элементы, которые необходимы для экспрессии этого гена в клетках эукариотов (человека). В качестве продуцентов таких генов используют бактериальные клетки, содержащие рекомбинантные плазмиды с соотвествующими генами. После получения достаточной биомассы (количества копий) плазмидную ДНК выделяют из бактерий, очищают от других молекул ДНК и примесей. Полученную ДНК-вакцину вводят парентерально, при этом большая ее часть поступает в межклеточное пространство, после чего включается в клетки. Противогерпетические вакцины. Вирус простого герпеса (HSV. Herpes simplex virus) вызывает инфекционное заболевание генерализованного или местного характера (характеризуется преимущественно поражением кожи, слизистых оболочек, нервной системы и хроническим рецидивирующим течением, урогенитальными инфекциями, тяжелым поражением глаз, энцефалитом и т.д.). Кроме того, он является онкогенным, поэтому вакцинация убитым или аттенуированным вирусом сопряжена с определенным риском развития рака. Для защиты от HSV-инфекции используют неонкогенную субъединенную вакцину. Для создания любой субъединенной вакцины прежде всего идентифицируют те компоненты патогенного микроорганизма, которые индуцируют выработку антител. В случае HSV-типа таким компонентом является гликопротеин Д-оболочки (gД\). В ответ на введение этого гли-копротеина мышам у них вырабатываются антитела, нейтрализующие интактный HSV. Ген gjД HSV-1 был изолирован, клонирован в одном из экспрессирующих векторов в клетках млекопитающих и введен в яйцеклетки китайского хомячка (СНО), в которых, в отличие от Е. coli, происходит гликолизирование чужеродных белков. Полноразмерный ген gД кодирует белок, в норме связывающийся с мембраной клетки млекопитающего. Затем модифицированным геном трансформировали СНО-клетки, которые гликозилировали белковый продукт и секретиро-вали его во внешнюю среду, так как он не мог встраиваться в клеточную мембрану. Антитела, вырабатываемые в ответ на введение модифицированного белка gД, эффективны в отношении вируса простого герпеса. Противосальмонеллезные вакцины. Разные штаммы Salmonella вызывают острые кишечные инфекции, постнатальную (послеродовую) инфекцию, брюшной тиф, пищевую токсикоинфекцию. Для профилактики всех этих заболеваний у овец, КРС, цыплят и человека эффективные пероральные вакцины созданы методом двойной делеции. Такой способ получения непатогенных штаммов, пригодных для создания на их основе живых вакцин, состоит в удалении из генома патогенных бактерий хромосомных областей, отвечающих за независимые жизненноважные функции. Лучше делетировать по крайней мере две такие области, так как вероятность их одновременного восстановления очень мала. Штамм с двойной делецией обладает ограниченной пролиферативной способностью и сниженной патогенностью, но обеспечивает выработку иммунного ответа. Штаммы Salmonella с двойной делецией вызывают легкую форму инфекции и обладают в 100 тыс. раз меньшей вирулентностью.

Answer 64

Цитокины - большая гетерогенная группа белков с различными функциями, синтезируемая лимфоретикулярными клетками. Цитокины участвуют во многих видах взаимодействий, обеспечивающих функционирование иммунной системы и контроль гемопоэза. Первая группа цитокинов была представлена интерферонами (ИФН), часть цитокй-нов была классифицирована как интерлейкины (ИЛ), пронумерованные в порядке их обнаружения. ИФН - это группа эндогенных гликопротеидов с м.м. около 3000, которые оказывают неспецифическое противовирусное действие, влияя на клеточные метаболические процессы синтеза РНК и белка. Первоначально было установлено, что ИФН вырабатывают клетки, инфицированные вирусами (тип I); в дальнейшем - что ИФН вырабатывают также лимфоциты в ходе иммунной реакции (тип II). Для получения больших количеств ИФН используют шестидневные однослойные культуры клеток куриного эмбриона или культивируемые лейкоциты крови человека, зараженные определенным видом вируса. Иными словами, для получения ИФН создают определенную систему вирус-клетка. Из клетки человека изолирован ген, ответственный за биосинтез ИФН. Экзогенный человеческий ИФН получают, используя технологию рекомбинантных ДНК. Процедура выделения кДНК ИФН-ов состоит в следующем: Из лейкоцитов человека выделяют мРНК, фракционируют,ее по размерам, проводят обратную транскрипцию, встраивают в сайт модифицированной плазмиды. Полученным продуктом трансформируют Е. coli; образовавшиеся клоны подразделяют на группы, которые идентифицируют. - , Каждую группу клонов гибридизируют с ИФН - мРНК. Из образовавшихся гибридов, содержащих кДНК и кРНК, выделяют мРНК, проводят ее трансляцию в системе синтеза белка. Определяют интерферонную противовирусную активность каждой смеси, полученной в результате трансляции. Группы, проявившие интерферонную активность, содержат клон с кДНК, гибридизировавшийся с ИФН - мРНК; повторно идентифицируют клон, содержащий полноразмерную ИФН - кДНК человека. ИФН проявляют некоторые виды активности как лимфокины и иммуномодуляторы. ИФН I типа, действующие преимущественно как ингибиторы репликации вирусов в клетке, реализуют свой эффект, стимулируя выработку рибосомами клеток хозяина клеточных ферментов, которые тормозят продукцию вирусов, нарушая трансляцию вирусной мРНК и синтез вирусных белков. ИФН вырабатывают большинство видов животных, но проявление их активности видоспецифично, т.е. они действуют только у того вида животных, в которых вырабатываются. Описаны три основных человеческих ИФН: ИФН-а, представляющий собой фибробластный ИФН типа I; ИФН-B - человеческий фибробластный ИФН типа I; ИФН-у - человеческий иммунный ИФН типа И. ИФН, вырабатываемые клетками любого типа, различают по химическому строению и виду активности (табл. 2). ИФН являются одним из основных эндогенных факторов, препятствующих поражению организма вирусной инфекцией. ИФН вызывают индукцию трех ферментов: протеинкиназы, нарушающей начальный этап построения пептидной цепи; олигоизоаденилат синтетазы, активирующей РНК-азу, которая разрушает вирусную РНК; фосфодиэстеразы, разрушающей конечные нуклеотиды тРНК, что приводит к нарушению элонгации пептида. С учетом антивирусного и иммуномоделирующего эффектов ИФН в НПО «Биомед» предложены и успешно апробированы суппозитории с ИФНаn и пробиотиками при терапии дисбактериозов вирусной и бактериальной этиологии, кандидозов; в гинекологической практике для лечения эндометритов, кольпитов, вагинитов и гинекологического герпеса.. Побочные эффекты ИФН включают лихорадку, утомляемость, головные боли, слабость, миалгии, анемии, желудочно-кишечные и сер-дечно-сосудичтые нарушения. Развитие методов клонирования генов в значительной мере облегчило продукцию высокоочищенных цитокинов всех типов и идентификацию большинства интерлейкинов (ИЛ). Специфический ген человеческого ИЛ с присоединенным к нему сегментом ДНК, кодирующим маркерный пептид (участок гибридной белковой молекулы, облегчающий идентификацию и очистку белка), переносят в микробные клетки-продуценты, где экспрессируется химерный белок (продукт клонированного гена, защищенный одной или несколькими аминокислотами от расщепления протеиназами клетки-хозяина). Конструирование рекомбинантных молекул ИЛ осуществляется набором специфичных ферментов. Маркерный пептид, входящий в состав химернвго белка, очищают иммуноафинной хроматографией. Главным из цитокинов являются ИФНу и ИЛ-2. ИФНу - ключевой медиатор активации системы естественной цитотоксичности, регулирует процесс дифференцировки естественных киллерных клеток и их ци-тотоксическое взаимодействие с клетками-мишенями, стимулирует ци-тотоксические и регуляторные функции макрофагов, активирует цито-токсические лимфоциты. Под действием ИФНу повышается продукция цитокинов, таких, как ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-12, ИФНр, и фактора некроза опухолей-а. ИЛ реализуют эффект через рецепторы на поверхности соответствующих клеток-мишеней. Многие ИЛ проходят стадию клинического изучения, другие — нашли разнообразное применение в лечении инфекций, воспалительных, аутоиммунных и неопластических расстройств. Так, ИЛ-1 показан для лечения воспалений и септического шока, ИЛ-2 включен в схемы лечения имуногенных опухолей (меланомы, почечноклеточного рака, рака мочевого пузыря).

Answer 65

Антибиотики - специфические продукты жизнедеятельности различных групп микроорганизмов, низших и высших растений и животных или их модификаций, обладающие высокой физиологической активностью в отношении определённых групп микроорганизмов или злокачественных опухолей, избирательно задерживающие их рост или подавляющие развитие. Образование антибиотиков - наследственно закреплённая особенность метаболизма организмов. Это проявляется в том, что каждый вид (или даже штамм) способен образовывать один или несколько определенных, строго специфичных для него антибиотических веществ. Вместе с тем одинаковые антибиотики могут образовываться несколькими видами организмов (это свидетельство того, что данные микроорганизмы имеют общего предка). Образование антибиотика обусловлено определённым характером обмена веществ, возникающим и закреплённым в процессе эволюции организма. Эволюционное значение антибиотиков подчёркивается тем, что в антибиотикообразование может быть включено около 1% генов продуцента (род Streptomyces) и эта часть ДНК, несмотря на энергетические затраты при её репликации, не теряется во время селекции в естественных условиях. Образование антибиотиков - фактор биологический, имеющий адаптационное значение. Для продуцента способность образовывать антибиотики важна не постоянно, а лишь в неблагоприятных условиях, например, при истощении среды питательными компонентами, при контакте со специфическими продуктами жизнедеятельности другого организма. Формы взаимодействие между организмами весьма разнообразны -от мирного сожительства до явного антагонизма. Типы связей внутри микробиологических сообществ подразделяют на трофические и метаболические. Трофические связи характерны для метабиоза (последовательное использование субстрата), когда продуты жизнедеятельности одного микроорганизма, содержащие значительное количество энергии, потребляют другие виды микроорганизмов в качестве питательного материала. Метаболические связи выстраиваются, когда одни микроорганизмы могут потреблять отдельные продукты метаболизма других микроорганизмов или продукты метаболизма являются их ингибиторами. Тип связи определяет специфику взаимодействия организмов. Сим-биотические взаимоотношения характеризуются тем, что различные виды микроорганизмов создают для себя взаимовыгодные условия. Например, совместное развитие аэробных и анаэробных микроорганизмов: развиваясь в аэробных условиях, микробы поглощают кислород, создавая благоприятные условия для развития анаэробов. Паразитизм ~ форма взаимоотношений, при которой некоторые микробы развиваются за счет веществ клетки других организмов, например бактерии. Паразиты бывают внеклеточные (риккетсии) и внутриклеточные (вирусы). Хищничество имеет место, когда некоторые микробы поглощают клетки организмов других видов, используя их в качестве источника питания (преимущественно продукты лизиса живых клеток других бактерий). К числу микроорганизмов-хищников относятся, главным образом, миксоформы (миксобактерии, миксоамебы, миксомицеты). Антагонизм — это условия, при которых один вид микроорганизмов угнетает или полностью подавляет рост и развитие других видов. Явление антагонизма широко распространено среди бактерий, актиномицетов, грибов и других микроорганизмов. Образование антибиотических веществ -специфическая особенность вида или даже штамма микроорганизмов, возникшая в результате их эволюционного развития как одна из приспособительных особенностей. В естественных условиях четко ограниченных форм взаимоотношений не наблюдается. В процессе эволюции на разных этапах роста организмов и в зависимости от условий их развития один тип взаимодействия может смениться другим. Так, ряд бактерий (Е. coli, В. subtilis, В. cereus и др.) образуют фермент пенициллиназу, разрушающий пенициллин, выделяемый Penicillium notatum, P. chrisogenum и мицелиаль-ными грибами других видов. Антибиотики - первые лекарственные средства, полученные биотехнологическим способом. С антибиотиками человечество сталкивается с древних времён. Уже в Библии упоминается использование травы иссоп для лечения кожных заболеваний. Эта трава, как известно, поражается плесенью рода Penicillium или Aspergillus и может быть насыщена метаболитами грибов антибиотического характера.

Answer 66

1870 г. - обнаружено, что в среде, содержащей плесень, бактерии не развиваются (Д. Сандерсон); 1872 г. - доказана способность Penicillium glaucum подавлять рост бактерий (Д. Листер); 1871-1872 гг. - показано, что молодая культура зеленой плесени -грибы рода Penicillium - способна задерживать развитие возбудителей ряда кожных заболеваний человека (В .А. Манассеин, А.Г. Полотебнов); 1877 г. — опубликовано сообщение о подавлении роста Bacillus an-thracis аэробными бактериями (Л. Пастер и С. Джеберт, А.Г. Лебединский); 1929 г. - обнаружены антибиотические свойства грибов Penicillium (А. Флеминг); 1940 г. - выделена субстанция пенициллина (X. Флори, Е. Чейн); 1942-1956 гг. - коллектив ученых и практиков во главе с академиками Л.А. Зильбером и З.В. Ермольевой провели поиск и отбор штаммов-продуцентов; разработали ферментационные среды и первые регламенты промышленного производства бензилпенициллина. Сравнение двух штаммов (советского и английского) показало, что советский штамм образует 28 ед/мл, английский - 20 ед/мл. Открытие и изучение свойств нового антибиотика, применяемого в медицинской или сельскохозяйственной практике, — это огромный труд ученых различных направлений (микробиологов, биохимиков, микологов, химиков, генетиков, фармакологов, биотехнологов, врачей). Со времени открытия пенициллина из разных микроорганизмов были выделены более 6000 антибиотиков, обладающих разной специфичностью и разным механизмом действия. Их широкое применение для лечения инфекционных заболеваний помогло сохранить миллионы жизней. Основные причины быстрого роста числа антибиотиков: многие антибиотические вещества или продукты их модификации являются незаменимыми ЛП при инфекционных заболеваниях, ранее считавшихся неизлечимыми; изменилась этиологическая структура инфекционных заболеваний, возросло число видов бактерий, их индуцирующих; широкое распространение получили инфекции, вызываемые грамот-рицательными инфекциями, оттеснив стафилококковые заболевания; —как лечебные средства антибиотики применяют в животноводстве, птицеводстве, пчеловодстве, растениеводстве; отдельные антибиотики являются стимуляторами роста животных; —проблема резистентности микроорганизмов предполагает замену одних антибиотиков другими, более эффективными; некоторые антибиотики применяют в качестве консервантов в пищевой промышленности; —развитие химии природных соединений (изучение структуры, их модификация и синтез) способствует появлению новых знаний об антибиотиках; —антибиотики используют при изучении отдельных сторон метаболизма организмов, расшифровке тонких молекулярных механизмов биосинтеза белка, механизма функционировании мембран, специфических ингибиторов ферментов, в первую очередь, инактивирующие антибиотики. Подавляющее большинство основных антибиотиков было выделено из грамотрицательной почвенной бактерии Streptomyces, хотя их продуцируют также грибы и другие грамположительные и грамотрица-тельные бактерии. Ежегодно во всем мире производится 100000 т антибиотиков на сумму около 5 млрд долларов, в том числе более 10 млн долларов приходится на долю антибиотиков, добавляемых в корм скоту в качестве пищевых добавок или ускорителей роста. По оценкам ВОЗ каждый год ученые обнаруживают от 100 до 200 новых антибиотиков, прежде всего в рамках обширных исследовательских программ по поиску среди тысяч различных микроорганизмов таких, которые синтезировали бы уникальные антибиотики. Получение, лабораторные и клинические испытания новых лекарственных средств обходятся дорого, до применения доходят только те из них, которые имеют большую терапевтическую ценность и представляют экономиче- , ский интерес; на их долю приходится 1-2% всех обнаруживаемых антибиотиков. Образование антибиотиков - наследственно закреплённая особенность метаболизма микроорганизмов, проявляющаяся в том, что каждый вид (или даже штамм) способен продуцировать один или несколько определенных, строго специфичных для него антибиотических веществ, что обусловлено определённым характером обмена, возникающим и закреплённым в процессе эволюции микроорганизма. Метаболиты являются промежуточными продуктами обмена веществ, результатом катаболических и анаболических реакций; конечный продукт обмена -антибиотики - синтезируются из первичных метаболитов. Специфичность антибиотиков характеризуется: высокой биологической активностью в отношении чувствительных к ним организмов, т.е. способностью проявлять эффект даже в очень низких концентрациях; избирательностью действия, т.е. способностью конкретного антибиотика проявлять свое действие лишь в отношении определенных организмов или групп организмов, не оказывая заметного эффекта на другие формы живых существ. Величину биологической активности антибиотиков выражают в условных единицах, содержащихся в 1 мл (ед/мл) или в 1 мг (ед/мг) препарата. За единицу антибиотической активности принято минимальное количество антибиотика, способное подавить развитие или задержать рост определенного числа клеток стандартного штамма тест-микроба в единице объема питательной среды. Так, за единицу активности пенициллина приято минимальное количество препарата, способное задерживать рост золотистого стафилококка (штамм 209) в 50 мл питательного бульона; для стрептомицина единица активности - минимальное количество антибиотика, задерживающее рост Е. coli в 1 мл питательного бульона. Угнетение роста микроорганизмов антибиотиками может осуществляться только при наличии трех условий: биологически важная для жизнедеятельности бактерий система должна реагировать на воздействие низких концентрацией препарата через определенную точку приложения; препараты должны обладать способностью проникать в бактериальную клетку и воздействовать на точку приложения; препарат не должен инактивироваться раньше, чем вступит во взаимодействие с биологически активной системой бактерии. Точки приложения действия антибактериальных препаратов в бактериях различны - большая часть их находится в клеточной мембране и внутри клетки. Для достижения этих точек антибиотики сначала должны проникнуть через поверхностные слои клетки, находящиеся снаружи от цитоплазматической мембраны. Главным барьером на этом пути препарата является клеточная стенка. В клеточной стенке грамположи-тельных бактерий содержится большое количество мукопептидов, являющихся основной мишенью для антибиотиков. Клеточная стенка грамотрицательных бактерий содержит большое количество липидов, в силу чего она менее проницаема и является надежным барьером для многих антибактериальных средств. Это обстоятельство служит причиной поиска новых антибиотиков (полусинтетические пенициллины и цефалоспорины), которые обладают хорошей проникающей способностью через липополисахаридный слой грамотрицательных бактерий и имеют высокую активность против большинства из них.

Answer 67

Сложилось несколько подходов к классификации антибиотиков: по принципу биологического происхождения (предпочтительна для биологов, изучающих организмы-продуценты антибиотических веществ); по химическому строению (удобна для химиков, занимающихся изучением строения молекул антибиотиков и путей из синтеза); по типу и механизму биологического действия (принята в медицинской практике). Тип действия антибиотиков бывает цидным (бактерицидным, фун-гицидным, вирицидным, протозоацидным), под ним понимают необратимое нарушение жизнедеятельности (гибель) инфекционного агента, и статическим (бактериостатическим, фунгистатическим, виристатиче-ским, протозоостатическим), при котором прекращается или приостанавливается размножение возбудителя. Такая градация имеет основное практическое значение при лечении тяжелых инфекций, особенно у пациентов с нарушениями иммунитета, когда обязательно назначение «цидных» препаратов. Связь антимикробного препарата с точками приложения в микробной клетке может быть прочной или непрочной, что, в той или иной мере, определяет степень активности данного препарата. Антибиотики должны обладать высокой избирательной токсичностью, т.е. они должны быть активны по отношению к микробным клеткам и безвредны для клеток больного организма. Подобная избирательная токсичность может быть реализована лишь в том случае, если активные биохимические системы микробных клеток - мишени антибиотиков - отличны от подобных систем клеток макроорганизма. Селективная токсичность может носить пограничный характер, когда отличия в биохимических структурах клеток организма человека и бактерии заключаются в различном положении фосфолипидов в цитоплазматической мембране. Проблема селективности антибиотиков сложнее по причине того, что для репликации вирусы используют ферменты клеток хозяина. В зависимости от точки приложения и механизма биологического действия антибиотики делят на: I. Специфические ингибиторы биосинтеза клеточной стенки (пе-нициллины, цефалоспорины и цефамицины, ванкомицин, рис-томицин, циклосерин, бацитрацин, тиенамицины и др.) II. Препараты, нарушающие молекулярную организацию и функции клеточных мембран (полимиксины, полиены). III.Препараты, подавляющие синтез белка на уровне рибосом (макролиды, линкомицины, аминогликозиды, тетрациклины, левомицетин, фузидин). IV. Ингибиторы синтеза РНК на уровне РНК-полимеразы и ингибиторы, действующие на метаболизм фолиевой кислоты (ри-фампицины). V. Ингибиторы синтеза РНК на уровне ДНК-матрицы (актиноми-цины, антибиотики группы ауреоловой кислоты). VI. Ингибиторы синтеза ДНК на уровне ДНК-матрицы (митомицин С, антрациклины, нитрофураны, налидиксовая кислота). При выделенном возбудителе назначают антибиотики с максимально узким спектром активности, так как «избыточная» широта спектра не дает преимуществ и опасна с точки зрения подавления нормальной микрофлоры. Общая стратегия рекомбинантных микроорганизмов, способных синтезировать антибиотики, состоит во введении в организм хозяина специфических генов, клонированных в подходящем векторе, которые кодируют один или несколько ферментов, катализирующих не свойственные микроорганизму метаболические реакции, или генов, влияющих на осуществляемый им в норме биосинтез определенных соединений. При создании рекомбинантных штаммов Streptomyces - основного микроорганизма, используемого для получения антибиотиков, важно, чтобы трансформация и отбор трансформированных клеток не должны быть слишком сложны. В отличие от Е. coli, Streptomyces существуют не в виде изолированных клеток, а в виде протяженных мицелл, поэтому перед трансформацией необходимо ферментативное разрушение клеточной стенки мицелл и высвобождение отдельных протопластов. Без этого невозможно отличить трансформированные клетки от не-трансформированных, поскольку видимые колонии на твердой среде будут образовываться из группы клеток, а не из индивидуальной клетки. Соответственно колонии, растущие в присутствии селективного антибиотика, будут представлять собой смесь трансформированных и нетрансформированных клеток. Проникновение плазмидной ДНК в протопласты Streptomyces облегчается в присутствии ПЭГ. После трансформации протопласты высевают на твердую среду, чтобы образова-' лась клеточная стенка, а затем для отбора трансформированных клеток переносят на селективную среду, обычно содержащую неомицин, где образуется колония, выросшая из трансформированных клеток, способных синтезировать антибиотик. С помощью генетических или биохимических экспериментов можно идентифицировать, затем выделить один или несколько ключевых ферментов биосинтеза антибиотиков, определить их N-концевые аминокислотные последовательности и, исходя из этих данных, синтезировать олигонуклеотидные комплементарные последовательности.

Answer 68

Технологический процесс производства антибиотиков представлен на рис. 20. Биосинтез антибиотика осуществляется микроорганизмами на определённом этапе их развития. Эта закономерность характерна для бактерий, мицелиальных грибов (Penicillium chrysogenum, Aspergillus fumi-gatus и др.) и для большинства актиномИцетов, образующих такие антибиотики, как стрептомицин, хлортетрациклин, окситетрациклин и другие. Максимально высокую активность штамма-продуцента способна обеспечить технология рекомбинантных ДНК, так как можно создавать новые антибиотики с уникальной структурой, оказывающие более мощное воздействие на определенные микроорганизмы и обладающие минимальными побочными эффектами. Генно-инженерные подходы используются для увеличения выхода антибиотиков и соответственно снижения стоимости их производства. Примеры промышленных продуцентов основных антибиотиков, используемые в РФ, представлены в табл. 3. При проведении первой стадии технологического процесса (рис. 20) применяют натуральные среды неопределенного состава, к числу которых относят продукты крахмалопаточного производства, агар, желатин, отруби, зерно. Композиция натуральных сред неопределенного состава не является постоянной. Например, агар, получаемый из разных видов морских водорослей, по химическому составу - сложный эфирный комплекс полисахарида с серной кислотой и разнообразными микроэлементами. Агар содержит также жирные кислоты, биотин, тиамин или его компоненты. В картофельной среде с глюкозой и пептоном, при одной и той же партии пептона и химически чистой глюкозы, состав картофельного экстракта зависит от сорта картофеля, места его произрастания, времени уборки, срока и режима хранения и других причин. Поэтому для получения сопоставимых результатов, особенно при изучении физиологических и биохимических особенностей микроорганизма, применяют синтетические среды, в состав которых входят определенные химически чистые соединения, взятые в точно указанных концентрациях. Задача второй стадии — создать оптимальные условия для развития продуцента и максимально возможного биосинтеза необходимого антибиотика. Особенность производства антибиотиков - двухфазный характер развития продуцентов. В первой фазе развития культуры, носящей название тропофазы (фазы сбалансированного роста микроорганизма), идет интенсивное накопление биомассы продуцента. Продуцент синтезирует белки, нуклеиновые кислоты, углеводы, ферменты, и другие БАВ, необходимые для роста микроорганизма; наблюдается быстрое потребление основных компонентов субстрата, интенсивное поглощение кислорода. В культуральной среде может снижаться рН, как результат накопления органических кислот. В тропофазе антибиотик, как правило, не образуется или его количество незначительное. Возможно, в этой фазе синтез ферментов, принимающих участие в образовании антибиотика, подавлен. Во второй фазе - идиофазе (фазе несбалансированного роста микроорганизма) - накопление биомассы замедлено. Культуральная среда уже обеднена компонентами, необходимыми для развития продуцента и обогащена продуктами его жизнедеятельности. В культуре преобладают протеолитические процессы, приводящие к её подщелачиванию. Продукты метаболизма микроорганизма частично используются на построение клеток мицелия, частично - на синтез антибиотика. Максимум биосинтеза антибиотика в культуральной среде наступает, как правило, после максимального накопления биомассы, этот максимум неодинаков у разных микроорганизмов и при разных условиях культивирования. Практика промышленной микробиологии показывает, что процесс получения того или иного продукта жизнедеятельности активнее идет в смешанных культурах, при совместном развитии нескольких видов (чаще двух) микроорганизмов. Совместным культивированием специально подобранных микроорганизмов создают условия, при которых значительно увеличивается образование антибиотиков, как результат активации ряда биохимических процессов. В смешанных культурах ферментативная реакция служит ответом на проявление определенных антагонистических взаимоотношений. При совместном культивировании различных микробов могут возникать своеобразные гибриды этих организмов, обладающие иными свойствами по сравнению с исходными чистыми культурами. С накоплением определенной концентрации антибиотика рост микроорганизмов прекращается (например, Streptomyces griseus прекращает свой рост при концентрации в среде стрептомицина сульфата 0,5%). Из культуральной среды антибиотики выделяют экстракцией органическими растворителями, осаждением, адсорбцией. Очистку антибиотиков проводят повторной заменой растворителя, адсорбционно-хроматографическими методами, ВЭЖХ. От степени чистоты препарата, влажности, температуры, рН растворителя зависит стабильность антибиотика. Затем оценивают антимикробный спектр, стерильность, токсичность, пирогенность, действие на лейкоциты крови и другие показатели. На всех стадиях получения антибиотика строго соблюдается технологическая дисциплина, все процессы осуществляются в асептических условиях.

Answer 69

Пенициллины и цефалоспорины - большая группа лекарственных препаратов, имеющих определенное сродство химического строения, механизмов действия, фармакологических, клинических эффектов. Эти препараты называют р-лактамными антибиотиками, что обусловлено наличием в их структуре общего для всей группы четырехчленного лак-тамного кольца. Все пенициллины имеют одинаковое строение основной группы, которая представлена тиазолидиновым кольцом, соединенным с р-лак-тамным кольцом, и имеющим аминогруппу - 6-аминопеницилановая кислота (6-АПК). * Различные пенициллины (G, X, F, К и др.) отличаются строением радикала молекулы боковой цепи (табл. 4), активностью и спектром действия. Важные, с точки зрения клинического использования, представители пенициллинов можно разделить на несколько групп: —обладающие наивысшей активностью в отношении грамполо-жительных микроорганизмов и слабой в отношении грамотри-цательных видов, а также гидролизуемые р-лактамазам (пенициллин G); —относительно резистентные к действию Р-лактамаз стафилококков, но с более низкой активнолстью в отношении грамположи-тельных микроорганизмов и не действующие на грамотрица-тельные (нафициллин, метациллин); —относительно высокоактивные против грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, но разрушаемых Р-лакта-мазами (карбенициллин, тикарциллин); —препараты с относительной киелотоустойчивостью и пригодные для перорального применения (пенициллин V, ампициллин, клоксациллин). Структурное единство ядра 6-АПК существенно для проявления биологической активности молекул. При ферментативном расщеплении р-лактамного кольца бактериальными р-лактамазами (пенициллиназа-ми) с образованием неактивной пенициллановой кислоты антибиотик лишается своих антимикробных свойств. Задачей получения новых пе-нициллинов является разработка препаратов, устойчивых к Р-лакта-мазам или со сниженной способностью к индукции синтеза Р-лактамаз. Для предотвращения возникновения резистентных форм бактерий к Р-лактамным антибиотикам получены липосомальные формы этих антибиотиков (защита антибиотика происходит в результате включения Р-лактама в положительно заряженные липосомы). Комплекс антибиотик— липосома обладает рядом преимуществ: —снижается токсичность препарата за счет направленного транспорта; —повышается проникновение антибиотиков через внешнюю мембрану грамотрицательных бактерий; —антибиотик, включенный в липосомы, защищен от действия Р-лактамоз; —повышается химическая стабильность антибиотика Для промышленного производства антибиотика используют культуру Penicillium chrysogenum и среду, содержащую кукурузный экстракт, гидрол, лактозу и минеральные соли. Вместо кукурузного экстракта может быть применена арахисовая мука, жмыхи, мука из хлопковых семян и другие источники; возможность широкого использования продуктов растительного происхождения обусловлена тем, что у P. chrysogenum имеются сильные протеоли-тические ферменты. В качестве углеводов часто используют сахарозу или смесь лактозы с глюкозой в соотношении 1:1. Глюкоза может снижать биосинтез антибиотика; на средах, содержащих лактозу или сахарозу (в условиях депрессии), биосинтез антибиотика идёт активнее. Важную роль в процессе биосинтеза пенициллина играет сера, которая содержится в структуре антибиотика. В качестве источников серы используются натрия сульфат и натрия тиосульфат. Избыток ионов меди не влияет на рост гриба, но подавляет биосинтез пенициллина. Эффект торможения биосинтеза снимается добавлением в среду ионов железа. P. chrysogenum в качестве источника фосфора может использовать не только фосфаты, но и фитаты (соли инозитфосфорных кислот): этот продуцент содержит фермент, разрушающий фитин с освобождением неорганического фосфора. Температура в период первой фазы должны быть 30 °С, во вторую фазу 20 °С, рН в период роста гриба - ниже 7,0, потребление углеводов должно быть медленным, что достигается использованием лактозы, либо дробным внесением глюкозы. Синтез того или иного пенициллина зависит от наличия специфичного вещества в среде, иначе говоря, предшественника, который микроорганизм включает в молекулу антибиотика без предварительного расщепления. Следует отметить, что предшественники биосинтеза пенициллина (фенилуксусная кислота, фенилацетамид, феноксиуксусная кислота) при определённых концентрациях и рН среды оказывают токсическое влияние на продуцента. Фенилуксусная кислота наименее токсична. Добавление её в среду в концентрации выше 500 мкг/мл угнетает рост мицелия, особенно в первые 24 ч его развития. Фенилуксусная кислота добавляется в концентрации от 100 до 500 мкг/мл через 24 ч развития P. chrysogenum, При таких условиях обеспечивается наибольший выход бензилпенициллина, который через 72 ч развития может достигать 500-1000 мкг/мл. При развитии гриба без внесения предшественника образуется около 45% бензилпенициллина (пенициллин G) и около 53% пенициллина К (радикал - и-гептилпенициллин). При добавлении к среде фени-луксусной кислоты (С6Н5СН2СООН) меняется соотношение образующихся компонентов в сторону резкого увеличения бензилпенициллина, количество которого в зависимости от возраста достигает 75—99% от смеси пенициллинов. В процессе культивирования P. chrysogenum в среде, не содержащей фенилуксусной кислоты, в ней накапливаются серосодержащие соединения не Р-лактамного характера, близкие к цис-теину и метионину. Добавление в среду фенилуксусной кислоты способствует более интенсивному метаболизму серосодержащих компонентов в соединения Р-лактамного характера. При развитии продуцента пенициллинов - гриба P. chrysogenum -на кукурузно-лактозной среде выделяют три фазы. Первая фаза — рост мицелия, выход антибиотика низок. Всегда присутствующая в кукурузном экстракте молочная кислота потребляется продуцентом с максимальной скоростью, лактоза используется медленно. Потребление кислорода высокое. Усиливается азотный обмен, в результате в среде появляется аммиак и резко поднимается значение рН. Вторая фаза - максимальное образование пенициллина, это связано с быстрым потреблением лактозы и аммонийного азота. рН среды остаётся почти без изменений, увеличение массы мицелия незначительное, потребление кислорода снижается. Третья фаза - снижение концентрации антибиотика в среде в связи с начавшимся автолизом мицелия и выделением в результате этого процесса аммиака, что сопровождается повышением рН среды.

Answer 70

В настоящее время описано шесть условно выраженных возрастных фаз продуцента пенициллина. Заметное количество пенициллина начинает образовываться с IV возрастной фазы гриба, максимум накопления приходится на VI фазу - в период автолиза. Определение возрастных фаз путём микроскопического контроля позволяет установить: 1) ход общего темпа развития гриба, его состояние, пригодное для использования посевного материала, контроль за ходом образования антибиотика; 2) дефекты развития и возможные причины этих дефектов; 3) момент окончания развития гриба в реакторе. По мере развития гриба меняется и химический состав мицелия. Количество общего азота и белка в мицелии уменьшается, содержание моносахаров в период максимального биосинтеза пенициллина (96 ч) увеличивается почти в 6 раз по сравнению с начальным периодом, количество дисахаридов уменьшается. Изменяется количество отдельных аминокислот. Процесс биосинтеза пенициллина ведётся при самом тщательном соблюдении стерильности всех операций, так как загрязнение культур посторонней микрофлорой резко снижает накопление антибиотика. Это связано с тем, что многие бактерии воздуха способны образовывать пе-нициллиназу. Особенно активно продуцируют этот фермент В. subtilis и В. cereus. Одним из активных продуцентов пенициллиназы является туберкулёзная палочка (Mycob. tuberculosis). Предположительно именно с этим свойством связана резистентность этого микроорганизма к пенициллину. Механизм биосинтеза молекулы пенициллина представлен на схеме. * Современная промышленная микробиология получает культураль-ные жидкости, содержащие свыше 55 тыс. ед/мл. Выделение пенициллина начинается с фильтрации или центрифугирования (отделения мицелия гриба). Из культуральной жидкости антибиотик, где он находится в виде кислоты, выделяют путём экстракции неполярными органическими растворителями (амилацетатом, хлороформом, бутилацетатом, бутано-лом и др.). Очистку антибиотика проводят путём замены растворителей, поскольку соли пенициллина плохо растворимы в органических растворителях. Экстрагированный пенициллин в виде кислоты переводят в водный раствор в виде соли, добавляя щёлочь. Повторяя эти операции, пенициллин концентрируют и очищают. Большинство пенициллинов производят в виде натриевых или калиевых солей. Новокаиновые и бен-затиновые соли являются основой пролонгированных препаратов пенициллина для внутримышечного введения. В сухой кристаллической форме пенициллиновые соли достаточно стабильны в течение длительного времени при температуре 4 °С. Растворы быстро теряют активность (в течение 24 часов при температуре 20 °С), их готовят непосредственно перед введением. В настоящее время большое практическое значение имеет полусинтетический (биологический + химический) способ получения аналогов природного пенициллина. Исходным продуктом служит 6-аминопени-циллановая кислота (6-АПК). 6-АПК получают в результате биосинтеза при развитии P. chryso-genum при отсутствии предшественника в среде или путём ферментативного дезацилирования бензилпенициллина или феноксиметилпени-циллина при участии фермента пенициллинацилазы (пенициллинамида-зы). Второй способ наиболее перспективен. Используется иммобилизованная пенициллинацилаза, которая гидролизует бензилпенициллин с образованием 6-АПК и фенилуксусной кислоты. Пенициллинацилаза образуется различными группами микроорганизмов, в том числе она образуется всеми продуцирующими пенициллин грибами. В настоящее время предложен способ получения иммобилизованных клеток Е. coli с высокой пенициллинацилазной активностью, пригодных для многократного применения. Сама по себе 6-АПК не активна. Её подвергают химическому аци-лированию и получают аналоги пенициллина с улучшенными или новыми свойствами; некоторые из них: оксациллин, ампициллин, мети-циллин, амоксициллин и другие. Всего в настоящее время используется порядка четырёх десятков таких препаратов. В настоящее время бензилпенициллин необходим не только как медицинский препарат, но и как вещество, являющееся исходным продуктом для получения 6-АПК и в дальнейшем полусинтетических пени-циллинов. Из общего количества природных пенициллинов примерно 35% используется как медицинские препараты, а 65% - для получения 6-АПК. В начале 60-х гг. были предприняты попытки химического синтеза пенициллинов, в частности был синтезирован феноксиметилпеницил-лин, но практического значения эти попытки не имели. Большинство пенициллинов производят в виде натриевых и калиевых солей. Новокаиновые и бензокаиновые соли являются пролонгированными формами для внутримышечного введения. В сухой кристаллической форме пенициллиновые соли достаточно стабильны при температуре 4 °С. Растворы быстро теряют активность (в течение 24 ч при температуре 20 °С), их готовят непосредственно перед введением. Пероральные пенициллины применяют за 1 ч до или через 2 ч после приема пищи, чтобы снизить связывание компонентами пищи и кислотную инактивацию препаратов. Цефалоспорин — антибиотик из грибов рода Cepholosporium. Основным продуцентом является С. acremonium. Впервые сообщение было сделано Джузеппе Бротцу в 1948 г. В культуральной жидкости было обнаружено несколько цефалоспоринов, основной из которых — цефалоспорин С. На основе этого антибиотика в дальнейшем были созданы многочисленные полусинтетические цефа-лоспорины с ценными свойствами. По химическому строению цефалоспорин принадлежит к Р-лактам-ным соединениям, но Р-лактамное кольцо конденсировано не с пяти, а с шестичленным гетероциклом. Цефалоспорины в отличие от пеницил-линов устойчивы к р-лактамазе, подавляют развитие и грамположи-тельных и грамотрицательных бактерий, но активность этого антибиотика ниже пенициллина. Цефалоспорин не инактивируется пенициллиназой. Но имеется аналогичный фермент, гидролизующий Р-лактамное кольцо цефалоспорина — цефалоспориназа. В процессе развития С. acremonium наряду с цефалоспорином С синтезируется и пенициллин N. Его образование идёт тем же путём, что и образование изопенициллина N в процессе биосинтеза бензилпени-циллина. Через ряд стадий из изопенициллина N образуется цефалоспорин С. Все пенициллины и цефалоспорины являются селективными ингибиторами синтеза клеточной стенки. Первый этап действия препаратов заключается в их связывании с клеточными рецепторами; такими рецепторами являются пенщиллинсвязывающие протеины (ПСП), количество которых составляет от 3 до 6 тыс. у различных бактерий. Отдельные ПСП могут иметь неодинаковый аффинитет к препарату, и каждый из них может опосредовать различное действие. Так, присоединение пенициллина к одному ПСП может вызывать аномальное увеличение клетки, присоединение к другому - приводить к дефекту на поверхности клеточной стенки без последующего лизиса клетки. ПСП контролируется хромосомами, мутации могут изменить их количества и аффинитет к отдельным Р-лактамным препаратам. После связывания /?-лактамнного препарата с рецепторами ПСП ингибируется реакция транспепдидирования и останавливается синтез пептидогликана. Следующий этап - устранение или инактивация ингибитора аутолити- ческих энзимов (гидролаз) в клеточной стенке, что сопровождается активизацией литического фермента у некоторых микроорганизмов и может привесити к лизису клетки.

Answer 71

В последние годы методом смешанного (биологического и химического) синтеза удалось получить около 50 тыс. аналогов цефалоспори-на. Примерно 50 антибиотиков имеет практическое клиническое значение. Цефалоспорины традиционно делят на четыре поколения по спектру действия и антимикробной активности (табл. 5). * Стрептомицин принадлежит к группе аминогликозидных антибиотиков. Актиномицет, синтезирующий стрептомицин Streptomyces griseus впервые был выделен в лаборатории микробиологии Ратжерского университета в 1943 г. С появлением стрептомицина медицина получила мощное оружие для борьбы с таким тяжёлым и достаточно широко распространённым заболеванием, как туберкулёз. Поэтому детально разрабатывались вопросы применения стрептомицина в терапии различных инфекционных заболеваний и его промышленного производства. Стрептомицин продуцируют ряд видов актиномицетов рода Streptomyces. Однако основным продуцентом стрептомицина признан S. griseus, способный синтезировать до 10—20 тыс мкг/мл антибиотика. Культуры актиномицетов весьма вариабельны и каждому штамму должна соответствовать определённая среда и свой режим для развития микроорганизма. На их изменчивость влияют условия культивирования и особенно состав сред (на более богатых по составу средах наблюдается и более быстрая изменчивость). Изменчивость продуцентов стрептомицина - результат генетической нестабильности этих микроорганизмов, обусловленный существенными перестройками ДНК, которые затрагивают многие гены, в том числе и гены биосинтеза антибиотиков и гены устойчивости к ним. Для стабилизации признаков, связанных с антибиотикообразовани-ем, при хранении и поддержании штамма иногда в среды добавляют антимутагены - вещества, способные стабилизировать процессы, приводящие к хромосомным перестройкам и регуляции экспрессии генов. Среди антимутагенов — пуриновые нуклеотиды, ионы марганца, L-метионин, гистидин, полиамины, кофеин и другие соединения. В контроле биосинтеза стрептомицина S. griseus принимает участие плазмид-ная ДНК, в процессе биосинтеза - 20-30 генов. При промышленном производстве стрептомицина используются штаммы, хорошо развивающиеся на соевых средах, их основными компонентами является соевая мука, гидрол, аммонийные соли. Существенную роль в биосинтезе стрептомицина играют жиры соевой муки и её минеральный состав. Белок сои и его кислотный гидролизат малопригодны для биосинтеза антибиотика. Аэрация среды имеет существенное значение, так как S. griseus -высокоаэробный организм и поглощает значительное количество кислорода, которое зависит от состава среды и стадии развития продуцента. В ранний период развития актиномицета потребление кислорода воздуха более интенсивное, а затем оно падает до нуля. Увеличение степени аэрации повышает выход стрептомицина. В анаэробных условиях продуцент стрептомицина развивается слабо. Мицелий,- выращенный в аэробных условиях и перенесённый затем в анаэробные, стрептомицина не образует. Для максимального накопления антибиотика культура должна находиться в условиях непрерывной аэрации. Оптимальная температура для развития антибиотика 27-29 °С. Повышение её до 30 °С и выше резко снижает и даже прекращает его образование. Оптимальную температуру меняют в зависимости от штамма продуцента и состава среды. Лучшим начальным рН для развития актиномицета является 7,0. Стрептомицин образуется при значении рН от 7,5 до 8,5. В кислых средах активность стрептомицина снижается, в щелочных - максимальная. Так, активность стрептомицина при рН 5,8 в 20-80 раз меньше, чем при рН 8,0. Для проявления максимальной антимикробной активности стрептомицина оптимальное значение рН 7,5-8,0. Наличие некоторых веществ в среде влияет на антибиотическую активность стрептомицина. Если к этой среде прибавить 0,5-3% натрия хлорида, калия хлорида или натрия сульфата, Е. coli развивается в присутствии 10 мкг/мл стрептомицина. Имеется два объяснения этому факту: в присутствии натрия хлорида уменьшается скорость и степень диффузии стрептомицина, или натрия хлорид снижает адсорбцию антибиотика бактериальной клеткой. При концентрации пировиноградной, фумаровой кислот до 1% продуцент развивается в присутствии 10 мкг/мл стрептомицина, если концентрацию солей повысить до 3%, рост бактерий наблюдается при концентрации антибиотика 150 мкг/мл. Защитные свойства этих кислот по-разному проявляются по отношению к различным микроорганизмам. В отношении Е. coli защитные свойства проявляются в большей степени, в отношении Staph. aureus защитных свойств не наблюдается. Сильно снижается активность стрептомицина в присутствии цистеина и гидроксиламина (цистеин полностью инакти-вирует антибиотик в течение нескольких часов). При развитии продуцента различают две основные стадии. На первой стадии идёт быстрый рост и развитие микроорганизма с энергичным использованием основных компонентов субстрата, максимальное потребление кислорода. В цитоплазме высокое содержание РНК, ДНК вначале отсутствует и обнаруживается только через 12 ч развития. В среде происходит некоторое увеличение аммонийного азота, связанное с разложением белков соевой муки. рН вначале несколько снижается, затем повышается с 6,8 до 7,9. Образование стрептомицина незначительное. Через 28 ч масса мицелия прекращает увеличиваться, начинается вторая стадия — процесс образования стрептомицина. На третьи сутки рН с 7,9 падает до 6,7, а на четвёртые и пятые - вновь возрастает до 7,7. Вторая стадия характеризуется медленным потреблением оставшихся в среде питательных веществ, замедлением роста актиномицета, снижением потребления кислорода, автолизом мицелия, максимальным образованием стрептомицина. Максимальное накопление стрептомицина наблюдается, когда автолитические процессы начинают преобладать над процессами роста. Количество аммонийного азота продолжает возрастать, что, по всей вероятности, связано с разложением белков соевой муки и автолизом мицелия. В культуральной жидкости находятся минеральные вещества, белки, нуклеиновые кислоты, аминокислоты, полисахариды, жиры, стрептомицин и другие вещества. S. griseus при определённых условиях развития культуры образует ещё один антибиотик - маннозидострептомицин (стрептомицин В), в чистом виде выделенный в 1947 г. из культуры актиномицета методом противоточной хроматографии. Маннозидострептомицин отличается от стрептомицина наличием в молекуле маннозы. Он менее активен, чем стрептомицин. Культуры S. griseus содержат фермент, превращающий маннозидострептомицин в стрептомицин. При соответствующем контроле развития культуры актиномицета можно добиться минимального образования маннозидострептомицина. Основная часть стрептомицина выделяется в культуральную среду, но часть его остаётся в мицелии и на его поверхности. С целью извлечения стрептомицина из микроорганизма культуральную жидкость вместе с биомассой обрабатывают минеральной кислотой. При этом весь антибиотик переходит в раствор. Мицелий отделяют прессованием или центрифугированием. Свободную от мицелия культуральную жидкость обрабатывают щавелевой кислотой. Этим достигается удаление белков и органических оснований, ионов металлов (кальция, магния, железа), далее ведётся выделение стрептомицина в чистом виде. Стрептомицин - сильно полярное соединение и его основание и соли неорганических кислот хорошо растворимы в воде. Соли же органических кислот стрептомицина нерастворимы почти во всех органических растворителях. Для выделения стрептомицина из культуральной жидкости в чистом виде используются методы адсорбции на активированном угле и метод ионообменной хроматографии. В основу первого метода положена адсорбция стрептомицина на активированном угле при нейтральном или слабощелочном рН среды. При рН 2-4 стрептомицин остаётся в растворе, в то время как примеси адсорбируются на сорбент. После удаления примесей на активированный уголь адсорбируют из подщелоченной среды антибиотик, его десорбцию осуществляют этанолом, подкисленным кислотой хлороводородной. Далее в раствор добавляется диэтиловый эфир - стрептомицин выпадает в осадок. Стабильность стрептомицина имеет значение для производства и хранения антибиотика. Она зависит от чистоты препарата, влажности, температуры, рН растворителя. Химически чистый стрептомицин устойчив в сухом состоянии и в виде растворов. Соли стрептомицина при хранении при комнатной температуре инактивируются лишь в незначительной степени на протяжении нескольких лет. Максимальная стабильность растворов стрептомицина сульфата и гидрохлорида находится при рН от 3,0 до 7,0 при температуре от 7 до 25 °С.

Answer 72

По отношению к стрептомицину микроорганизмы условно делятся на 3 группы: 1.Чувствительные, рост которых подавляется при концентрации стрептомицина 10 мкг/мл, это роды Bacillus, Bordetella, Brucella, Klebsiella, Mycobacterium, Staphylococcus и некоторые другие. 2.Умеренно чувствительные, для подавления которых in vitro необходима концентрация антибиотика от 10 до 100 мкг/мл, сюда относят многие бактерии из родов Enterobacter, Corinebacterium, Diplococcus, Proteus, Streptococcus, Vibrio. 3.Устойчивые, для подавления которых необходима концентрация стрептомицина, превышающая 100 мкг/мл. К этой группе относят роды Bacteroides, Clostridium, некоторые виды Proteus, многие виды грибов, дрожжей, риккетсии, вирусы. К стрептомицину легко возникает вторичная резистентность. Повышение устойчивости к нему в 1000 раз возникает у золотистого стафилококка всего лишь через три пассажа на бульоне с возрастающими концентрациями антибиотика, а у Salmonella typhi повышение устойчивости после 14 пассажей наблюдается в 22 600 раз. При лечении стрептомицином необходимо учитывать его побочные эффекты, могут появиться глухота, вестибулярные и другие нарушения функций. Их развитие определяется длительностью периода лечения, дозой антибиотика, методами введения, степенью очистки. Токсичность менее очищенных препаратов стрептомицина первого периода получения и применения стрептомицина была более высокой, что связано с наличием в препаратах гистаминоподобных веществ, которые сами достаточно токсичны.

Answer 73

Грамицидин С. Продуцент Bacillus brevis способен синтезировать полипептидные антибиотики, к числу которых относят грамицидины А, В, CD, D, С. Последний иногда обозначают как грамицидин S (советский грамицидин). Все они отличаются как по аминокислотному составу, так и по пространственной структуре молекулы. Для производства грамицидина С (S) предложены среды на основе мясного и дрожжевого гидролизатов, содержащие сбалансированный набор минеральных и органических солей. В процессе культивирования необходимо подобрать сбалансированное сочетание интенсивности аэрации среды (от 0,38 до 4,38 г O2(л/ч)) и концентрации входящих в неё веществ. Температура культивирования -40 °С. Развитие продуцента и синтез антибиотика может идти и при температуре 28 °С, но в этом случае максимальный биосинтез антибиотика наблюдается в первые 24 ч, в то время, как при температуре 40 °С - между 24 и 48 ч. При выделение грамицидина С культуральную жидкость подкисляют кислотой хлороводородной до рН 4,5-5,0. В осадок выпадает ди-хлоргидрат грамицидина С вместе с бактериальными клетками продуцента. Из осадка антибиотик экстрагируют этанолом. Концентрат, содержащий 4 % грамицидина, используется в медицинской практике.

Answer 74

Неомицины. В 1949 г. 3. Ваксман и X. Лешевалье из культуры Streptomyces fradiae выделили неомицин. В дальнейшем было установлено, что это комплекс, состоящий из семи антибиотиков аминоглико- зидного строения. На синтетической среде актиномицет развивается лучше, чем на среде с соевой мукой, но биосинтез неомицина на синтетической среде почти в 8 раз ниже, чем на натуральной среде неопределённого состава. Некоторые вещества способствуют повышению выхода неомицина на 50%. К ним относятся ауксин, а-нафтилуксусная кислота. Наиболее эффективная доза ауксинов - семь частей на миллион, внесённая в среду перед стерилизацией. Стимулирующий эффект ауксинов проявляется при продолжительности процесса 138-162 ч, в ранние сроки развития культуры эффект отсутствует. В процессе образования антибиотика существенную роль играет цинк. Степень аэрации культуры должна быть несколько ниже, чем при выработке стрептомицина. Неомицины - основания, хорошо растворимые в воде и нерастворимые в органических растворителях, наибольшая их антибиотическая активность проявляется в щелочной среде. Неомициновый комплекс не теряет антимикробных свойств при длительном хранении (до 2-х лет) как в виде растворов, так и в твёрдом состоянии. Антимикробный спектр сходен со спектром стрептомицина. Но не-омицин подавляет развитие устойчивых к стрептомицину штаммов Му-cobacterium tuberculosis. Он малоактивен в отношении большинства видов Clostridium, Streptococcus, грибов, а также против вирусов и про-тозоа. Чувствительные к неомицину микроорганизмы приобретают устойчивость к нему в меньшей степени, чем к стрептомицину. При использовании неомицина следует учитывать его токсичность. Для человека неомицин более токсичен, чем стрептомицин. Степень токсичности колеблется в зависимости от состава неомицинового комплекса и чистоты препарата.

Answer 75

Ферменты (Ф) - белковые вещества, выполняющие функции катализаторов химических реакций и используемые в медицине, пищевой, фармацевтической и химической промышленности. Реакции, осуществляемые ферментами, не требуют экстремальных условий (температуры, кислотности среды и др.)> оптимальное значение температуры для большинства Ф 20-40 °С, ее повышение до 40 °С и выше, как правило, влечёт снижение активности Ф или их полную денатурацию. Ферменты характеризуют высокая скорость, стереоспецифичность, и незначительное количество образующихся побочных продуктов. Важное их свойство - эффективность катализа (ферменты увеличивают скорость в 1010-1012 раз) и избирательность действия (каждый фермент, как правило, катализирует одну химическую реакцию). Ферменты способны катализировать не только расщепление, но и образование химической связи. Ферменты - высокомолекулярные соединения с м.м. от 10000 до 1000000. Ферментные белки малоустойчивы, весьма чувствительны к изменениям рН и температуры. Для каждого Ф существует оптимум значения рН, при котором скорость катализируемой реакции максимальна; отклонения значения рН в ту или иную сторону ведут к снижению скорости ферментативной реакции. По экономическим и технологическим соображениям получать Ф с помощью микроорганизмов более выгодно, чем из растительных и животных источников. Микробные клетки содержат или продуцируют более двух тысяч Ф, которые катализируют биохимические реакции, связанные с ростом, дыханием и образованием продуктов. Культуры микроорганизмов способны вырабатывать большое количество Ф за короткое время с использованием дешёвых исходных веществ. Многие из этих Ф могут быть выделены и проявляют свою активность независимо от клетки. К настоящему времени в научной литературе описано около 3000 Ф, примерно 100 из них применяют в промышленном производстве. Промышленность выпускает свыше 50 индивидуальных Ф и вдвое больше ферментных препаратов, последние представляют собой смеси, содержащие кроме целевого продукта — Ф — значительное количество близких по физико-химическим свойствам белков. В биологических объектах Ф находятся в фиксированном состоянии на поверхности различных клеточных структур и сохраняют активность в течение длительного времени. Выделенные из органов и тканей или полученные из микробного сырья, особенно в высокоочищенном состоянии, Ф быстро инактивируются.

Answer 76

1. Культивирование микроорганизма - продуцента 2. Отделение биомассы (центрифугирование, сепарирование, фильтрование) 3.а. Если продукт в биомассе - внутриклеточный 3.1. Деградация клеток (механическая, гидродинамическая, УЗ, ферментативная) 3.2. Экстракция белков 3.3. Отделение экстракта от разрушенных клеток (центрифугирование, сепарация, мембранная фильтрация) 3.б. Если продукт в культуральной жидкости - внеклеточный 3.1. Концентрирование (ультрафильтрация, ионно обменная хроматография итд) 4. Очистка целевого продукта 5. Изготовление лекарственных форм

Answer 77

Интенсивность биосинтеза любого фермента микроорганизмом, его продуктивность обусловлена генетическими свойствами продуцента. Функционирование биосинтетической системы регулируется составом питательной среды и динамикой изменения отдельных ее компонентов во время роста микроорганизмов. Культивирование микроорганизмов -продуцентов ферментов целесообразно в средах строго детерминированного состава, обеспечивающих направленный биосинтез нужного Ф. Синтез многих Ф репрессируется легкоусвояемыми источниками углерода (глюкозой, фруктозой, маннозой и др.); этот эффект носит название катаболитной репрессии (иногда глюкозным эффектом). Катабо-литной репрессии подвержен биосинтез таких Ф, как а-амилаза, целлю-лаза, глюкоамилаза, инвертаза, трансэлиминаза полигалактуроновой кислоты. Ферменты, катализирующие превращение азотсодержащих субстратов, также регулируются по механизму катаболитной репрессии; их биосинтез репрессируется ионами аммония или быстроусвояемыми аминокислотами. Аминокислоты в анаэробных условиях культивирования инициируют биосинтез соответствующих декарбоксилаз. При наличии в среде большой концентрации мочевины стимулируется биосинтез уреазы. Введение в среду культивирования аргинина индуцирует биосинтез аргиназы. Источниками органического азота могут служить пептон, триптон, дрожжевой экстракт, гидролизат казеина или любая их смесь. Наличие в среде культивирования различных биополимеров обусловливает одновременное накопление комплекса протеаз, амилаз, нук-леаз, липаз. На рост микроорганизмов и биосинтез Ф существенное влияние оказывают ионы кальция, марганца, цинка и др. Ионы железа и магния активируют и стабилизируют протеолитические ферменты. Присутствие ионов железа и меди в среде культивирования существенно для биосинтеза железо- и медьсодержащих Ф, участвующих, как правило, в окислительно-восстановительных реакциях (утилизации и превращения энергии). Отсутствие таких ионов может негативно отразиться на скорости многих метаболических процессов и на биосинтезе Ф, катализирующих эти процессы. Продуценты Ф, относящиеся к строгим анаэробам, требуют полностью безкислородных условий культивирования и очень богатых, полноценных сред. Процесс культивирования в этом случае можно проводить в более простых ферментерах, так как не нужна аэрация и перемешивание. Оптимизация питательных сред и условий культивирования для обеспечения направленного биосинтеза продуцентом целевого продукта является важным этапом разработки биотехнологического процесса получения высокоочищенных Ф. Преимущественный биосинтез культурой нужного продукта с минимальным содержанием посторонних белков позволяет в дальнейшем существенно упростить выделение и очистку Ф.

Answer 78

Большинство Ф промышленного производства относится к внеклеточным, поэтому они находятся в культуральной жидкости. При выделении внутриклеточных Ф (изоферментов) основной задачей является сбор клеток, содержащих Ф. Глубинная культура представляет собой суспензию, содержащую остатки питательных веществ, продукты метаболизма (в том числе внеклеточные Ф), взвешенные клетки продуцента. В период культивирования обычно происходит ограниченный лизис микробных клеток и в суспензии появляется неконтролируемое количество внутриклеточных метаболитов. Из этой достаточно сложной и многокомпонентной смеси приходится выделять и очищать один Ф. Технологический процесс начинают с разделения растворимых и нерастворимых веществ, концентрирования и фракционирования, заканчивают разнообразными способами хроматографической очистки. Фильтрация жидкости, содержащей мелкодисперсный клеточный материал, частично разрушенные клетки и внутриклеточные полимеры, сопряжена с определенными трудностями. Фильтруемый раствор вязок, склонен к гелеобразованию, осадок сжимается и закупоривает поры фильтра. Для избежания этого применяют крупнопористые фильтрующие материалы - диатомиты, кизельгур, бентонит, фильтроперлит и др.: они задерживают очень мелкие частицы, образуются несжимаемые слои фильтрующего материала и биомассы, которые не изменяют фильтрующих свойств и не забивают фильтры. На фильтрующем материале может происходить сорбция или денатурация некоторых белков, в результате значительно снижается выход Ф. Обработка фильтроперлита раствором ЭДТА уменьшает потери на 2-6%. Сепарацию клеточной массы и сопутствующих конгломератов осуществляют с помощью центрифуг (фирмы «Beckman», США, MSE, Англия, «Hitadi», Япония). Дезинтеграция биомассы. Основное количество Ф обычно находится внутри клеток, где он образует комплексы с другими биополимерами. Клеточные структуры могут быть разрушены в результате прямого механического воздействия (баллистическими, УЗ-, экструзионными, ферментативными методами - см. гл. 5.7). После дезинтеграции биомассы продуцента фермента получается вязкая, опалесцирующая суспензия, содержащая фрагменты клеточных стенок, субклеточных структур и продукты их деградации, а также самые разнообразные высоко- и низкомолекулярные органические вещества. Ферменты находятся в растворенном состоянии, поэтому на одной из первой стадий обработки клеточного гомогената должны быть удалены нерастворимые частицы. Для этого применяют скоростное центрифугирование. Образуется прозрачный клеточный экстракт, содержащий только растворенные биополимеры и низкомолекулярные компоненты. Среди нежелательных процессов, которые могут происходить в таком растворе - протеолиз собственными клеточными протеазами, что влечет потерю каталитической способности, изменение специфичности или стабильности выделяемого Ф. Этот процесс может протекать несмотря на поддержание низкой температуры, особенно при очистке Ф, так как после удаления сопутствующих белков Ф становится единственным субстратом протеазы. Инактивацию протеаз осуществляют обработкой клеточного экстракта специфическими ингибиторами-комплексонами (ЭДТА, о-фенантролин, оксихинолин), солями ртути или серебра. Протеазы из клеточных экстрактов могут быть удалены сорбцией на аффинных сорбентах. Если протеазы термолабильны, а выделяемый Ф термостабилен, их можно денатурировать нагреванием клеточных экстрактов. Денатурацию нуклеиновых кислот в процессе очистки Ф обусловливает низкая ионная сила или основность среды. Можно использовать специальные осадители, образующие с нуклеиновыми кислотами нерастворимые комплексы. С этой целью применяют бромистый цетилтриметиламмо-ний, стрептомицинсульфат, протаминосульфат, полиэтиленимин. Полнота удаления нуклеиновых кислот зависит от рН и ионной силы раствора, концентрации осадителя и белка. Чтобы белки остались в растворенном состоянии, повышают ионную силу растворов. По эффективности осаждающего действия на нуклеиновые кислоты в экстрактах Е. coli осадители располагаются в следующем порядке: полилизин > полиэтиленимин > бромистый цетиолтриметиламмоний > стрептомицинсуль-фат > протаминсульфат > магния хлорид. Другой способ удаления нуклеиновых кислот из клеточных экстрактов - их гидролиз под действием нуклеаз; для этого применяют панкреатические ДНК-азу и РНК-азу. Значительную часть биополимеров можно удалить термообработкой клеточных растворов, если Ф термостабилен. Далее проводят хро-матографическую очистку, в том числе аффинную. В качестве сорбентов применяют различные гели — фосфатов кальция, гидроксида алюминия, реже - древесный уголь или гель гидрооксида цинка. Сорбцию на гелях проводят в слабокислых растворах (рН 5,0-6,0); важны оптимальные соотношения между количеством геля и белкового раствора. Гель, содержащий сорбированный Ф, отделяют центрифугированием. Для ультрафильтрации используют мембранные фильтры, селективность и скорость работы которых зависят от давления, гидродинамических условий, температуры, состава фракционируемой смеси и ее концентрации. Для фракционирования белковых растворов используют нейтральные соли. Известно, что растворимость белков зависит от величины молекул белка, степени их гидратации и ионной силы солевых растворов. Растворяясь, соль связывает воду и, таким образом, изменяет степень гидратации молекул белка, что приводит к их агрегации и образованию осадка. С этой целью применяют аммония сульфат, который обладает стабилизирующим эффектом по отношению ко многим Ф. Обычно выход Ф при фракционировании аммония сульфатом достигает 100%. Фракционирование белков растворителями. При смешивании органических растворителей с водой изменяется ее диэлектрическая константа и соответственно степень гидратации молекул, вплоть до замены молекул воды молекулами органического растворителя. Все это ускоряет образование нерастворимых агрегатов белковых молекул. Обычно для фракционирования растворов Ф применяют этанол и ацетон. При повышенной температуре (более 4 °С) в водно-органических смесях Ф денатурируют, поэтому работы с органическими растворителями проводят при низких температурах. Органический растворитель охлаждают до (-30) - (-40 °С) сухим льдом или жидким азотом; температура смеси поддерживается при этом на уровне от -10 до -20 °С. Осадок центрифугируют, затем растворяют в небольшом объеме буферного раствора, удаляя следы органических растворителей диализом или ультрафильтрацией через гель. Для хроматографического фракционирования применяют ионно-обменную, аффинную хроматографию и гель-фильтрацию. Наиболее эффективная очистка Ф достигается ионно-обменной хроматографией с использованием сорбентов на основе сополимеров метакриловой кислоты и различных гидрофобных мономеров. В препаративной энзимоло-гии применяют иониты на основе натуральных или полусинтетических полисахаридных матриц (ионно-обменные целлюлозы). Среди многих производных целлюлозы чаще используют ДЭАЭ-, ТЭАЭ-, КМ- и фос-фоцеллюлозы (первые два - аниониты, последние - катиониты). Предпочтительна гранулированная целлюлоза, гидродинамические свойства которой позволяют проводить хроматографический процесс с большой скоростью. После элюирования из колонки функционально активных белков сорбент подлежит регенерации. Для удаления неактивных белков, пигментов и др. сорбированных соединений колонку промывают щелочами, водой, кислотами и вновь водой. Иногда для полного удаления пигментов используют органические растворители или детергенты. Процесс регенерации колонки завершается обработкой стандартным буферным раствором. Фракционирование смесей Ф, имеющих различный размер молекул, проводят гель-фильтрацией на разных типах сефадексов - модифицированных производных линейного полисахарида полидекстрана. Для фракционирования крупномолекулярных смесей применяют поперечно-сшитые акриламиды под названием ультрагелей (фирма LKB, Швеция) и агарозу в поперечно-сшитом состоянии (сефарозы CL 2В, 4В и 6В). В поперечно-сшитых агарозах хроматографический процесс можно осуществить в широком интервале рН и температуры, использовать буферные растворы, содержащие органические растворители, соли. Аналогичными свойствами обладают декстраны, поперечно-сшитые акрила-мидом сефакрилы: на них можно фракционировать смеси белков с м.м. от 105 до 107. Наряду с натуральными и полусинтетическими полисахаридными матрицами для гель-фильтрации используют синтетические поликри-ламидные гели (биогель Р, акрилекс фирм «Bio Rad Laboratories», США и «Reanal», Венгрия). Большое количество аминогрупп в их структуре придает полимеру гидрофобные свойства, хорошую набухаемость в воде с образованим пористой структуры геля. К синтетическим гелям относят также оксиакрилметакрилатные гели-сфероны (фирма «Lachema»,Чехия). Для гель-хроматографии, в отличие от других методов хроматогра-фического разделения белков, не требуется обессоливать пробу, корректировать рН, не нужны специальные элюирующие буферы. Смесь белков, продвигаясь по сорбенту, освобождается от солей и распределяется в порядке уменьшения м.м. Белки и другие компоненты смеси с сорбентом не взаимодействуют. Из колонки вначале выходят самые крупные молекулы, затем — меньшими м.м. и, наконец, соли. В большинстве случаев после того, как из сорбента вышли белки и все низкомолекулярные компоненты, колонка пригодна для применения в следующем хроматографическом цикле. Аффинная хроматография характеризуется высокими выходом и степенью очистки выделяемого белка. Основа этого биоспецифического метода состоит в том, что в многокомпонентной смеси между одним или несколькими белками-ферментами и полимерными сорбентами образуется стабильная связь, в результате чего эти белки из раствора переходят на нерастворимый сорбент. Чем меньше белков связывает сорбент, тем выше его селективность (идеальная селективность - связывание одного Ф). Центром связывания служат субстраты, их аналоги, обратимые ингибиторы, коферменты, антитела и другие вещества, называемые лигандами, присоединенные к матрицам. Лиганды специфически взаимодействуют с активными центрами выделяемого Ф. В качестве лигандов используют синтетические аналоги субстратов или кофер- ментов. Матрицей сорбента, к которой присоединен лиганд, может быть любой полимер, обладающий: крупнопористой гелевой структурой, позволяющей крупным молекулам Ф проникать внутрь структуры и взаимодействовать с центрами связывания; гидрофильностью структуры, обеспечивающей взаимодействие с водой и отсутствие неспецифического связывания белков по гидрофобным центрам; отсутствием в структуре заряженных групп, исключающих образование неспецифичных электростатических связей; способностью полимера легко активироваться определенными химическими агентами, позволяющими за счет несложных процессов присоединять большое количество лиганда; достаточной химической, механической, микробиологической стойкостью, обеспечивающей стабильность во время работы сорбентов. Указанным требованиям наиболее полно отвечают различным образом модифицированные агарозы; недостаток агароз - нестойкость к воздействию микроорганизмов, малая механическая прочность, высокая стоимость. Строгая специфичность аффинного сорбента к выделяемому Ф значительно улучшает сам хроматографический процесс, состоящий из последовательно сменяющихся этапов сорбции, удаления несорбиро-ванных белков и элюирования сорбированного Ф. Условия сорбции подбираются таким образом, чтобы выделяемый Ф сорбировался наиболее полно, а сопутствующие белки не задерживались. Это зависит от рН, ионной силы, природы буферных растворов, температуры. После отмывки сорбента от несорбированных белков резко изменяется один или нескольких из указанных параметров, в результате разрушается комплекс фермента с сорбентом и Ф высвобождается. Элюирование Ф проводят, добавляя в элюент специфически взаимодействующие с ферментом вещества - субстраты, коферменты, растворимые ингибиторы. Как правило, это повышает эффективность очистки, так как специфические агенты не разрушают неспецифические комплексы между сорбентом и сопутствующими белками.

Answer 79

Высокая лабильность Ф к различным факторам окружающей среды (значению рН, температуре), быстрая инактивация в организме и выделение из организма, наличие антигенных свойств чужеродных организму белков - в значительной мере могут быть устранены при использовании Ф в иммобилизованном виде. Иммобилизация Ф - это повышение их стабильности. Существует несколько общепринятых методов иммобилизации Ф, которую проводят в строго асептических условиях, но ни один из существующих методов иммобилизации биологически активных молекул, таких, как Ф, антитела, антигены, не является универсальным. Самый простой способ иммобилизации Ф — физический метод (адсорбция на нерастворимом носителе). В основе метода лежат действия электростатических сил и сил поверхностного натяжения. Процедуpa иммобилизации состоит в смешивании при соответствующих условиях Ф и носителя, инкубации и отделении нерастворимого компонента смеси от растворимого центрифугированием или фильтрованием. Недостаток этого метода — непрочная связь Ф с носителем. Например, адсорбция Ф на носителе ДЭАЭ — сефадекс (диэтиламиноэтил) осуществляется за счёт множественных солевых связей. На такого рода связи влияют даже незначительные изменения рН, ионной силы, температуры и природы растворителя, что может приводить к десорбции фермента с носителя, десорбцию Ф может вызвать даже субстрат. Кроме солевых связей во взаимодействии Ф с носителем могут участвовать и другие слабые силы, например, водородные или ван-дер-ваальсовые. Материалы, используемые для адсорбции Ф: алюминия оксид, бентонит, кальция карбонат, гель кальция фосфата, активированный уголь, целлюлоза, глина белая, коллаген, ионно-обменные смолы, фенольные полимеры, силикагель. Адсорбция - мягкий метод иммобилизации, который, как правило, слабо влияет на каталитическую активность Ф. Иммобилизация Ф с помощью ковалентного связывания считается мягким методом. Способ основан на образовании химической связи между молекулами Ф и носителя. При этом важно, чтобы аминокислоты, необходимые для проявления каталитической активности Ф, не участвовали в ковалентном связывании с носителем. Способ ковалентной иммобилизаций может приводить к снижению ферментативной активности. Инактивацию можно предотвратить, проводя иммобилизацию в присутствии субстрата, защищающего активный центр. Типичные во-донерастворимые носители, используемые для ковалентной иммобилизации - агароза (сефароза), целлюлоза, декстран (сефадекс), сополимеры полиакриламида, полиаминостирол. Для ковалентного присоединения требуется предварительная активация носителя. Активированный носитель может реагировать с опре- ч. делёнными группами Ф: а- и е-аминогруппами остатков лизина, функциональными группами остатков тирозина, гистидина, аргинина, цис-теина. цис-теина. Например, носитель сефароза активирована бромцианом, что основано на реакции между бромцианом и гидроксильными группами сефарозы; образующиеся при этом имидокарбонатные группы могут реагировать со свободными аминогруппами Ф. Для определения количества Ф, иммобилизованного на носителе, измеряют ферментативную активность исходного раствора, который инкубирован с носителем, и активность, остающуюся в растворе после завершения процесса иммобилизации. Разность между этими активностями соответствует теоретическому или максимальному количеству иммобилизованного Ф. Иммобилизация Ф металлохелатным методом. Для этой цели используют свойства переходных металлов образовывать комплексы. В качестве переходных металлов используют титана хлорид чистый или в кислом растворе, гидроксиды титана, циркония, хрома (их оксиды не токсичны), железа, ванадия, олова. В качестве носителей - производные целлюлозы и силикагели (с соответствующим размером пор), глутаро-вый альдегид. Гелеобразные гидратированные оксиды металлов образуют с Ф нерастворимые комплексы, обладающие хорошей ферментативной активностью. На полисахаридных носителях, именно целлюлозе, получают препараты иммобилизованных Ф с наиболее высокой активностью. Например, хелатный комплекс титана хлорида и целлюлозы (D-глюкопиранозы); гидроксильные группы в положении 6 D-глюкопира-нозы, взаимодействуя с ионами титана, образуют полимерный хелат. В нейтральном водном растворе между полимером, активированным титана хлоридом, и Ф образуется ковалентная связь; далее смесь должна быть полностью высушена. Температура высушивания избирательна, но она не должна превышать 50 °С; обычно активирование носителя проводят под вакуумом. Связывание Ф с титановыми комплексами полимеров происходит в молекуле Ф по свободным карбоксильным группам кислых аминокислот, фенольным гидроксилам остатков тирозина, спиртовым гидроксильным группам остатков серина и треонина, свободным сульфгидрильным группам остатков цистеина, е-аминогруппам остатков лизина. Иммобилизация клеток и Ф с включением в гель относится к механическим методам. Гель, в который включают клетки, как правило, состоит из сферических частиц. Включение живых клеток и Ф требует мягких условий иммобилизации, носитель должен представлять систему открытых пор с хорошими условиями для газообмена. Включение клеток в полиакриламидный гель. Полиакриламид (ПАА) - носитель, чаще других используемый для включения Ф, так как он не обладает ионно-обменными свойствами, поэтому при иммобилизации рН-профиль активности Ф практически не меняется. Для удерживания включённых белков с носителем требуется высокая степень сшивки носителя, т.е. полная полимеризация. Важным фактором при этом является удаление кислорода из раствора. Включение клеток в гель кальция алъгината. Альгинат — основной структурный полисахарид бурых морских водорослей. Моновалентные катионы полисахарида даже в низких концентрациях образуют вязкий раствор в присутствии двухвалентных катионов, особенно кальция, что способствовало широкому применению альгината для иммобилизации живых клеток. Ионы кальция можно заменить другими двухвалентными катионами, например бария. Важно отсутствие в системе хелати-рующих агентов, таких, как фосфаты и цитраты, разрушающие структуру геля, связывая кальций. Включение клеток в гели каррагенина. Каррагенины - гетероциклические полисахариды, содержащие эфиры a-D-галактопиранозил серной кислоты. В водном растворе каррагенин (гель) при добавлении ионов кальция образует нерастворимую фракцию. Включение клеток в гели агара. Препараты клеток, включенных в агар, как и в каррагенин, получают в виде сферических частиц. Иммобилизацию проводят в растворе, нагретом до температуры, при которой агар остаётся жидким. Затем добавляют клетки и смесь охлаждают до образования геля. Как и в случае с каррагенином, клетки должны быть устойчивы к нагреванию при 40 °С. Иммобилизацию проводят в реакторе при непрерывном режиме с перемешиванием или в реакторах, работающих в режиме псевдоожижения. В процессе полимеризации геля молекулы Ф связываются на небольших расстояниях и Ф оказывается заключённым внутри ячеек геля. Размеры пор геля должны быть меньше размера молекул Ф, но они не должны препятствовать доступу субстрата к Ф. Иммобилизация Ф микрокапсулированием. Основное при этом виде иммобилизации - удержание раствора, окружающего Ф. Иммобилизуется целиком исходный раствор, содержащий Ф, а не отдельные молекулы Ф. Преимущество микрокапсулирования — большая площадь поверхности, приходящаяся на единицу активности иммобилизованного Ф, позволяющая использовать высокие концентрации Ф в исходном растворе и достигать большей эффективности действия иммобилизованного Ф. Размер микрокапсул составляет десятки или сотни микрон. Для предотвращения Ф от инактивации с органическими растворителями и мономерами перед микрокапсулированием Ф смешивают с полимерами, способствующими сохранению его активности - бычьим сывороточным альбумином, гемоглобином, ПВП, ПВС, ПЭГ в концен- трации 1%. Гидрофобные участки полимеров экранируют молекулу Ф, защищая её в процессе микрокапсулирования. Для образования микросфер в органическом растворителе используют эмульгатор (span-85 в концентрации 0,1%) для покрытия поверхностей капелек водной фазы, что предохраняет Ф от непосредственного контакта с органическим растворителем. Физические и химические свойства микрокапсулированных Ф зависят от природы полимера, из которого формируется микрокапсула. Полимер должен обладать когезионными свойствами, обеспечивающими образование непрерывной плёнки, быть проницаем для субстрата, инертным по отношению к реакционной смеси. Для получения микрокапсул используют природные и синтетические полимеры - карбокси-метилцеллюлозу, ацетатфталат целлюлозу, нитрат целлюлозы, желатин, эпоксидные смолы, полиуретаны, стирол, полиамиды. Для микрокапсулирования ферментных систем чаще всего используют коацервацию. Полимерами для коацервации являются - ацетат и нитрат целлюлозы, бутадиеновый каучук. Микрокапсулирование включает следующие стадии: 1) Растворение Ф в буферном растворе, содержащем для защиты Ф от денатурации другие белки, например альбумин. 2) Приготовление органической фазы, содержащей эмульгирующий агент, например, span-85. Органическая фаза не должна смешиваться с водой; обычно это эфир, циклогексан, толуол. 3) Внесение водного раствора Ф в органическую фазу, перемешивание в течение заданного времени с определённой скоростью; от скорости перемешивания зависит размер микрокапсул. 4) Добавление к двухфазной смеси второго органического раствора, содержащего полимер и органический растворитель (перечисленные на второй стадии). При добавлении второго органического раствора происходит образование мелкого коллоида, обусловленное разбавлением органического растворителя. 5) Не прекращая перемешивания в условиях вакуума (до 25 мм рт. ст.), отгоняют органический растворитель, при этом происходит дальнейшее осаждение водных микросфер с плотной мембраной. Толщина мембраны зависит от количества полимера, добавленного к органической фазе и времени преципитации. 6) Выделение микрокапсул из органической фазы центрифугированием и промывка буферным раствором, содержащим твин-20. Включение Ф в липосомы. Известно, что липосомы — бислойные сферические образования с водной фазой внутри или полислойные образования, состоящие из нескольких концентрических бислоев с внутренней полостью и размером до 10 нм. Для получения липосом Ф или другие БАВ в водных растворах подвергают УЗ-обработке в присутствии положительно или отрицательно заряженных фосфолипидов. В зависимости от физических параметров фосфолипидов (заряда, жидкости, размера) липосомы проникают в клетку эндоцитозом или за счет слияния с природными мембранами. При эндоцитозе фосфолипид-ная оболочка липосом внутри клеток разрушается фосфолипазами и Ф высвобождаются в цитоплазму; при слиянии с клеточной мембраной фосфолипидный комплекс липосом входит в состав клеточных мембран, активная субстанция поступает в цитоплазму. Направленность действия липосом может быть изменена за счет состава компонентов, образующих мембрану, сродство липосом к клеткам-мишеням усилено специфическими факторами (антителами и др.). Таблетки и гранулы ферментных препаратов (трипсина, лизоцима, щелочной фосфотазы, каталазы и др.) получают в смеси с биосовместимыми полимерами (ПАВ, ПВП, ПВС и др.). Имплантированный в очаг поражения или поблизости от него Ф, находящийся в полимере, практически полностью защищен от воздействия агрессивной физиологической среды. Из полимера Ф выходит в нативном состоянии, скорость его последующей инактивации и выведения (как и вызываемые им токсические, аллергические и иммунные реакции) аналогична нативному Ф, применяемому традиционным способом. Ферментсодержащие препараты с помощью катетеризации вводят непосредственно в мышечную ткань или в капиллярную сеть поражённого органа, иммобилизованные Ф поддерживают там высокую локальную концентрацию. Иммобилизованные на водорастворимой полисахаридной матрице тромболитические Ф (стрептодеказа, стрептокиназа, целиаза), депонируемые в место расположения тромба методом катетеризации, эффективны в меньшей дозе.

Answer 80

Известно широкое использование иммобилизованных Ф в качестве стабильных биокатализаторов. Иммобилизованные клетки микроорганизмов способны относительно долго осуществлять характерные для них биохимические процессы. Иммобилизованные клетки бактерий, грибов способны синтезировать соответствующие антибиотики; главное - подбор метода иммобилизации клеток - продуцентов антибиотиков, позволяющего сохранить способность клеток синтезировать большое количество того или иного антибиотика длительное время. Растительные клетки весьма чувствительны к изменениям окружающей среды, и для их иммобилизации могут быть использованы только наиболее мягкие методы, например включение в гель кальция альгината. С помощью иммобилизации растительных клеток частично или полностью удаётся решить проблемы, связанные с использованием культур растительных тканей для получения сложных органических соединений. Например, иммобилизованные клетки Digitalis lanata способны осуществлять 1-2-Р-гидроксилирование производного дигоксина с образованием дигитоксина - единственного препарата наперстянки, который используется во всём мире. Разработана технология получения биологически активных веществ из биомассы растительных клеток, культивируемых в ферментерах различной вместимости суспензионным способом. Созданы коммерческие препараты (женьшень, шиконин и др.) Получен патент на штамм женьшеня ДАН-25. Иммобилизованные клетки используют при трансформации стероидных соединений, так как некоторые стероидтрансформирующие Ф, особенно гидроксилазы и дегидрогеназы, - весьма лабильные белки. В качестве носителей используют ПАА, ПВС, каррагенины, агар, кальция альгинат.

Answer 81

Микрофлора человека составляет основу его микроэкологии, организм человека населяют примерно 500 видов бактерий, не считая вирусов, простейших, а также грибов. Нормальную флору принято рассматривать как совокупность микробиоценозов различных частей тела, контактирующих с внешней средой. Совокупность микробиоценозов обозначается как нормобиоценоз или эубиоз. Для здорового человека характерно состояние равновесия микроэкологии организма. В организме человека проживает 1014-1016 бактерий, т.е. бактериальных клеток значительно больше, чем клеток самого организма. Они составляют своеобразный «экстракорпоральный» (хорошо организованный) орган. Этот «орган», как и любой орган человека, имеет свои функции, критерии, показатели функционального состояния, т.е. нормы и отклонения от нее. Велика защитная роль нормофлоры в обеспечении здоровья, поэтому нарушение равновесия между отдельными видами микроорганизмов в местах их постоянного обитания за счет более интенсивного размножения или гибели какого-либо вида может повлечь нарушение гомео-стаза с соответствующими последствиями патологического характера. Дисбиотические состояния приводят к изменениям количественного и качественного состава нормофлоры человека. Микроорганизмы индигенные (постоянные) и транзиторные (случайные), с которыми человек встречается в течение жизни, можно условно разделить на 4 группы: 1) микроорганизмы, не способные к длительному пребыванию в организме человека, нахождение которых в нем носит случайный характер; 2) постоянные представители микрофлоры, приносящие несомненную пользу (бифидо-, лакто- и колибактерии); 3) условно-патогенные представители нормофлоры, которые при определенных условиях могут стать патогенными (стафило кокки); 4) микроорганизмы - возбудители инфекционных заболеваний. Рассматривая микрофлору желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) даже практически здорового человека, нельзя говорить об абсолютной норме. В табл. 7 приведены данные примерного состава микрофлоры кишечника в колониеобразующих единицах (КОЕ) на 1 г фекалий. Нормальная микрофлора кишечника в процессе эволюции приооре-ла исключительно важную роль в формировании колонизационной ре-зистентности организма. Одним из главных механизмов защиты от колонизации условно-патогенными и патогенными бактериями является присутствие в организме достаточного количества собственной полезной микрофлоры, к которой, в первую очередь, относятся лакто- и би-фидобактерии. Молочнокислые бактерии (Lactobacteriauae) относятся к грампозитивным истинным бактериям, имеющим округлую форму (Streptococcus, Diplococcus) или палочковидную (Lactocobacterium) форму. Молочнокислые кокки и многие бактерии располагаются в виде коротких или длинных цепочек. Те и другие не образуют пор, неподвижны, анаэробны. Молочнокислые бактерии в кишечнике человека занимают одно из ведущих мест по своей численности среди других представителей бактериальной флоры. Бесспорно, что эти микроорганизмы играют первостепенную роль в симбиотических взаимоотношениях нормальной микрофлоры кишечника с макроорганизмом. В процессе сбраживания сахара одни молочнокислые бактерии образуют в качестве главного продукта молочную кислоту. Поэтому их называют гомоферментными (одноферментными), другие - гетеро-ферментыми, продуцирующими в качестве основных продуктов молочную и уксусную кислоты, этанол, двуокись углерода и некоторые летучие вещества типа эфиров. Гомоферментативные бактерии включают S. lactis, S. cremoris, Lactobacterium casei, L. lactus и др. К гетеро-ферментым относят ароматообразующие бактерии (S. citrovorus, S. асе-tonicus), а также представителей бактерий из групп Betabacterium, Coli -aerogenes и некоторые другие (S. faecalis, S. bovis и др.). Имеются молочнокислые бактерии, развивающиеся при оптимальной температуре 25-35 °С (мезофилы), S. lactis, S. fovis, L. Casei, ароматообразующие бактерии; при 40-45 °С (термофилы) - L. lactis, L. hel-venticum. Нормальная микрофлора кишечника выполняет и регулирует многие функции организма, которые можно уподобить работе лаборатории, осуществляющей многие сотни биохимических процессов. Биомасса микробов, заселяющих кишечник взрослого человека, составляет 2,5-3 кг. В процессе их жизнедеятельности образуются органические кислоты, снижающие рН среды толстой кишки до 5,3-5,8, лизоцим и другие антибиотикоподобные вещества, обусловливающие антагонистическую активность этих бактерий по отношению к патогенной, гнилостной и газообразующей микрофлоре. В результате значительно снижается хроническое отравление организма продуктами гнилостного распада в кишечнике (индол, фенол, скатол). Представители нормофлоры в кишечнике конкурируют с патогенной флорой за аргинин, аспарагиновую кислоту, серии, за область обитания - экологические ниши. Таким образом, бифидо- и лактобактерии регулируют количественный и качественный состав нормальной микрофлоры кишечника, сдерживая рост и размножение в нем патогенных и условно-патогенных микробов. Важна ферментопродуцирующая роль микрофлоры кишечника, имеющая большое значение в процессах пищеварения и метаболизма. Бактериальные протеазы гидролизуют белки и пептиды, последние под действием бактероидов гидролизуются до аминокислот и пептидных остатков. Одним из свойств нормофлоры является метаболизм азот- и углеродсодержащих соединений за счет микробных ферментов. Метаболизм мочевины в кишечнике происходит за счет микробных уреаз. Микрофлора кишечника участвует в деградации липидов и в их синтезе. Нормальная микрофлора принимает участие в рециркуляции желчных кислот и активно влияет на холестериновый и билирубиновый метаболизм. Бифидо- и лактобактерии, бактероиды, эубактерии способствуют всасыванию кальция, витамина Д, железа. Эшерихии, бифидо- , лакто- и эубактерии выполняют витаминооб-разующую функцию (участвуют в синтезе и всасывании витаминов К, группы В, тиамина, биотина, цианкобаламина, фолиевой и никотиновой кислот). Кроме того, они способствуют синтезу незаменимых аминокислот, лучшему усвоению солей кальция, витамина Д. Метаболиты бифидо- и лактобактерии препятствуют микробному декарбоксилиро-ванию пищевого гистидина и повышению количества гистамина, т.е. обладают антианемическим, антирахитическим, антиаллергическим действием. Лактобактерии образуют молочную кислоту, продуцируют лизоцим, лизин, ацидофилин и др. Кишечная палочка способствует синтезу иммуноглобулинов, что препятствует развитию инфекции, вырабатывает канцеролитические вещества. Большое значение имеет продуцирование анаэробами биологически-активных соединений - летучих жирных кислот, принимающих участие в рециркуляции и абсорбции ионов натрия, калия, кальция, магния, цинка, хлора, воды. Кишечная нормофлора способна разлагать белки до конечных продуктов распада (индол, фенол, скатол), утилизировать непереваренные пищевые субстраты, образуя органические кислоты, аминокислоты и другие соединения, которые нормализуют обмен веществ в организме. Микрофлора кишечника, в конечном счете, поддерживает водный, электролитный и кислотно-щелочной балансы организма. Нормальная микрофлора кишечника играет важную роль в формировании и функционировании иммунной системы. В экспериментах на животных установлено, что пероральное введение бифидо- и лактобактерии повышает устойчивость к различным инфекциям, что дает возможность говорить об иммунопотенциирующей способности эубиоти-ков. Иммуностимулирующий эффект под воздействием нормофлоры проявляется усилением фагоцитарной активности макрофагов, моноцитов, синтезом цитокинов, стимуляцией клеточных иммунных механизмов защиты. Нормальная микрофлора способствует пролиферации плазматических клеток. Бифидобактерии стимулируют синтез антител, лактобактерии повышают активность фагоцитов и лимфоцитов. Бактериальные модулины бифидо- и лактобактерии стимулируют лимфоидный аппарат, синтез иммуноглобулинов, интерферона, увеличивают уровень пропердина и комплемента, повышают активность лизоцима, способствуют уменьшению проницаемости сосудисто-тканевых барьеров для токсичных продуктов патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, препятствуют транслокации бактерий во внутренние органы и кровь, уменьшают воспалительные процессы слизистой кишечника. Анаэробные бактерии вырабатывают БАВ, как Р-аланин, 5-амино-валериановая и у-аминомасляная кислоты, а также медиаторы, влияющие на функцию ЖКТ, печени, сердечно-сосудистой системы, кроветворение и обменные процессы. Продукты жизнедеятельности нормальной микрофлоры кишечника (в том числе пропеоновые бактерии) оказывают регулирующее действие на вегетативную нервную систему. Как «естественный биосорбент» нормальная микрофлора способна аккумулировать значительное количество различных токсических продуктов, включая металлы, фенолы, яды растительного и микробного происхождения, другие ксенобиотики. Деятельность нормальной микрофлоры кишечника делает организм менее зависимым от окружающей среды. Положительными функциями нормальной микрофлоры кишечника являются: 1.Колонизационная резистентность; 2.Синтетическая функция - способность бактерий продуцировать витамины, гормоны, антибиотики; 3.Поддержание высокого уровня содержания лизоцима, секреторных иммуномодулинов, интерферона, важных для иммунологи-, ческой резистентности; 4.Детоксикация экзогенных и эндогенных субстратов и метаболитов; 5.Обменная функция - участие бактерий в метаболизме белков, углеводов, липидов, нуклеиновых кислот, солей, желчных кислот и других жизненно важных веществ; 6.Пищеварительная - морфокинетическое влияние на слизистые оболочки, абсорбцию абиотических компонентов, транзит нутри-ентов, газовый состав, мышечный тонус кишечника, перистальтику кишечника, эвакуацию кишечного содержимого. Защитные и физиологические функции нормальной микрофлоры кишечника в условиях нормобиоценоза указаны в табл. 8. При определенных условиях микрофлора человека может оказать неблагоприятное влияние на жизнедеятельность и состояние организма человека. Возможно возникновение гнойно-воспалительных реакций, сенсибилизации организма со многими клиническими проявлениями аллергического порядка, формирование в организме банка плазмид и генов с проявлениями мутагенной и антимутагенной активности.

Answer 82

Факторы, ведущие к нарушениям в состоянии нормофлоры, весьма многочисленны. Возможно, в связи с этим почти 90% населения нашей страны, в той или иной мере, страдает дисбактериозами, т.е. микроэкологическими нарушениями. Наиболее распространен дисбактериоз кишечника (в англоязычной литературе принят термин «синдром бактериального разрастания», bacterial overgrowth). Наиболее распространен дисбактериоз кишечника, причинами которого могут быть тяжелые болезни, интоксикации, нерациональное питание, нарушения в иммунной системе и, особенно часто, бесконтрольное и необоснованное применение антибиотиков и других антимикробных препаратов. Дисбактериоз может служить причиной возникновения колитов, холециститов, диатеза, нейродермита, анемии, псориаза, грибковых поражений слизистых, аллергии. Тактика лечения зависит от степени выраженности дисбактериоза и предполагает, как правило, комплексный подход, включающий: —устранение избыточного бактериального обсеменения тонкой кишки, восстановление нормальной микробной флоры; —улучшение кишечного пищеварения и всасывания; —восстановление нормальной моторики кишечника; —стимуляция реактивности организма. В профилактике и лечении дисбактериозов показано применение биопрепаратов нормальной микрофлоры кишечника, т.е. эубиотиков (пробиотиков) — препаратов нормальной микрофлоры человека. Термин «пробиотики» впервые ввели в научную литературу в 1965 г. Lilley и Stillwell для обозначения соединений микробного происхождения, которые, в отличие от антибиотиков, не убивали, а стимулировали рост микроорганизмов. Пробиотики (эубиотики) имеют в своем составе живые клетки специально подобранных штаммов микроорганизмов растительного или животного происхождения; они выживают в условиях кишечного окружения, непатогенны, нетоксичны, стабильны в течение длительного срока хранения. Механизм положительного влияния пробиотиков включает: —подавление микробных патогенов за счет продукции антибактериальных веществ, конкуренции за лимитируемые питательные вещества и сайты адгезии на кишечной стенке; —влияние на ферментативную активность кишечных микроорганизмов; —стимуляцию иммунной системы макроорганизма. Препаратами этой группы являются бифидумбактерин, бификол, бифи-форм, лактобактерин, бактисубтил, линекс, энтерол и др. Весьма перспективно создание с помощью генной инженерии рекомбинантных пробиотиков, характеризующихся одновременно антибактериальными и антивирусными свойствами. Пребиотиками принято считать пищевые добавки, селективно-стимулирующие рост и размножение так называемых дружественных человеку бактерий. Это низкомолекулярные углеводы (фруктозо-олигосахариды, инулин, лактулоза и др.), которые не должны подвергаться гидролизу пищеварительными ферментами. Симбиотики - комплексные препараты, содержащие пробиотик и пребиотик. Возможен еще один способ устранения дисбактериоза - воздействие на патогенную микробную флору продуктами метаболизма нормальных микроорганизмов. К таким препаратам относится хилак форте, представляющий собой стерильный концентрат продуктов обмена веществ нормальной микрофлоры кишечника: молочной кислоты, лактозы, аминокислот и жирных кислот. Эти вещества способствуют восстановлению в кишечнике биологической среды, необходимой для существования нормальной микрофлоры, и подавляют рост патогенных бактерий. Возможно, продукты метаболизма улучшают трофику и функцию эпи-телиоцитов и колоноцитов.

Answer 83

Необходимым условием массового производства препаратов эубио-тиков является сохранение их стабильности в течение длительного времени. Бактерийные препараты, содержащие живые микроорганизмы, относятся к наименее стойким, их активность снижается за счет гибели клеток. Микроорганизмы, имея низкий уровень биологической организации, сохраняют жизнеспособность практически при полной потере воды, при этом в них обратимо замедляются или прекращаются обменные процессы. Для увеличения сроков жизнеспособности бактерий показана сублимационная сушка, проходящая в условиях низкой температуры и глубокого вакуума (незначительной концентрации кислорода). По причине гигроскопичности укупорку сухих биопрепаратов проводят под вакуумом или в токе инертного газа. К факторам, оказывающим влияние на выживаемость микроорга-. низмов в препаратах сухих эубиотиков при хранении, следует отнести: • регламентированное содержание остаточной влаги; • наличие защитных сред; • хранение сухих препаратов в атмосфере, не содержащей кислород. В целях защиты эубиотиков от кислой среды желудка на таблетиро-ванные и капсулированные формы наносят ацидорезистентные покрытия или проводят иммобилизацию бактерий на сорбенте. Производство должно быть организовано в соотвествии с ГОСТ Р 52249-2004 «Правила производства и контроля качества лекарственных средств (good manufacturing practice for medicinal products (GMP))».

Answer 84

1.Подготовка производственных помещений, оборудования, посуды, персонала, вентиляционной системы - проводят в соответствии с требованиями инструкций, регламентирующих условия работы со стерильными лекарственными средствами. 2.Подготовка и стерилизация сред (концентрированной, производственной и защитной среды высушивания). Предварительные работы включают: —качественный подбор необходимых для данной культуры веществ; —оценку влияния отдельных компонентов на выход целевого продукта; —нахождение оптимального соотношения составляющих и удешевление сред. 3. Выращивание маточных (до 6 пассажей) и производственных культур. Вначале выращивают маточную культуру из специального штамма при температуре 370 °С, используя различные питательные среды. Производственную культуру выращивают методом глубинного культивирования в реакторах, установленных в боксах. Реакторы оснащены магнитной мешалкой и паровой рубашкой. 4.Розлив жидкого полуфабриката во флаконы. Розлив микробной суспензии в ампулы и флаконы проводят на аппаратах розлива и запайки ампул. Заполненные ампулы и флаконы поступают на сублимацию. 5.Сублимационная сушка. Ампулы помещают в морозильные камеры под углом 750°. Содержимое ампул замораживают при температуре -400 °С, выдерживают при этой температуре 18-24 ч, подвергая сублимации. 6.Укупорка. Ампулы с сухой микробной массой запаивают (флаконы укупоривают) с газовой защитой. 7. Маркировка, упаковка. Ампулы маркируют и упаковывают в пачки по 10 штук. 8. Контроль качества готовой лекарственной формы. Частная технология препаратов нормофлоры Лактобактерин. Для производства лактобактерина применяют штамм лактобактерий Lactobacillus plantarum, который относится к роду Lactobacillococcus. Лактобактерий представляют собой грамположи-тельные палочки длиной 0,7-3,0 мкм. Растут в атмосфере СО2, N2, О2. Лактобактерин сухой (Lactobacterium siccuum) получают по общей схеме для бактерийных препаратов. /. Приготовление и стерилизация питательных сред: Приготовление гидролизованного молока (к прокипяченному обезжиренному молоку с рН 7,7±0,1 добавляют панкреатин и хлороформ, выдерживают при 40±2 °С 72 ч, затем фильтруют, разводят вдвое водой для инъекций, разливают в бутыли и стерилизуют). 1.2. Приготовление дрожжевого аутолизата (хлебопекарные дрожжи разводят в бутылях водой для инъекций и стерилизуют). 1.3. Приготовление среды МРС (к гидролизованному молоку добавляют дрожжевой аутолизат и навески следующих веществ: марганца и магния сернокислого, аммония лимоннокислого, глюкозы и др.). 1.4.Приготовление гидролизата казеина (в реакторе готовят раствор казеина, устанавливают необходимое значение рН, добавляют хлороформ, выдерживают пять суток при 45 °С, затем фильтруют в бутыли и стерилизуют). 1.5.Приготовление казеиново-дрожжевой среды. 1.6.Приготовление защитных сред высушивания (желатин, сахароза, молоко, натрий лимоннокислый и вода). 2. Получение маточной культуры (6 пассажей в пробирках, чашках Петри, флаконах и бутылях - в течение 9 суток). 3.Выращивание производственной культуры (в реакторах с жидкой питательной средой в течение 8-12 ч при 370 °С; в 1 мл микробной суспензии производственного штамма должно быть не менее 6 млрд живых микробных клеток; к полученной микробной суспензии добавляют защитные среды высушивания - сахарозно-желатозную или обрат молока). 4.Розлив лактобактерина в ампулы (доза зависит от концентрации живых микробных клеток). 5.Лиофильная (сублимационная) сушка: 5.1.Замораживание ампул с лактобактерином, расположенных наклонно под углом 75°, в течение 18-24 ч в холодильной камере до минус 40 °С; 5.2.Лиофилизация (сублимирование) - сушка в условиях глубокого вакуума, длительность сублимации 68-70 ч. 6.Запайка ампул (в режиме газовой защиты - в атмосфере азота). 7. Контроль качества: 1.1. Описание: кристальная или пористая масса желтовато-белого цвета, кисломолочного запаха и вкуса. Определяют органолептически. 72. Подлинность определяется наличием характерных морфологических, культуральных и биохимических свойств в производственных штаммах лактобацилл. 7.3.Показатель рН растворенного препарата должен составлять 5,5*0,5. 7.4.Остаточная влажность лактобактерина в ампулах или флаконах не должна превышать 3,5%, в таблетках 5%. 7.5.Растворимость. Сухой препарат должен растворяться в воде, очищенной и добавленной из расчета 1 мл на 1 дозу, в течение 5 мин образовывать гомогенную взвесь, желтовато-бежевого цвета. Определяют визуально. 7.6 Бактериальная контаминация проверяется бактериоскопически и бактериологически. Бактериоскопически - путем просмотра мазков, приготовленных из взвеси растворенного препарата и окрашенных по Граму. В мазках должны быть клетки, характерные для лактобацилл (грамположи-тельные). Бактериологически — путем посева на питательные среды и инкубации в течение 2-х суток не должно содержаться колоний. Если обнаружили рост хотя бы в одной пробирке или чашке, производят повторный посев удвоенного количества образцов. В случаях повторного роста серию препарата бракуют. Препарат сухой не должен быть контаминирован посторонней микрофлорой. Препарат в таблетках не должен содержать патогенных и условно-патогенных микроорганизмов; допускается наличие микробов сапрофи-тов в количестве не более 300 на 1 таблетку. 7.7.Специфическая безвредность. Препарат должен быть безвредным для белых мышей при введении его внутрь в количестве одной дозы. Наблюдение за мышами осуществляется в течение 5 суток. В случае гибели за этот срок хотя бы одной мыши контроль повторяют на удвоенном количестве животных. Если мыши не погибнут, препарат считают выдержавшим испытание; в противном случае данную серию препарата бракуют. 7.8.Специфическая активность. По количеству жизнеспособных клеток лактобацилл в 1 дозе препарата и активностью кислотообразо-вания. 7.8.1. Определение количества живых лактобацилл в 1 дозе. Для определения количества живых лактобацилл в одной дозе препарата от каждой серии испытывают не менее 3-х образцов. Содержимое флакона после разведений высевают по 0,1 мл микробной суспензии на 4 чашки Петри. После 44 ч инкубации при t = 37°С производят подсчет выросших колоний и вычисляют содержание живых бактерий в 1 дозе препарата. 7.8.2. Определение активности кислотообразования проводят тит-риметрическим методом при выращивании бифидобактерий в модифицированной печеночной среде. Каждую пробу титруют раствором натрия гидроксида 0,1 моль/л в присутствии индикатора фенолфталеина до появления слабо-розового окрашивания. В одной дозе препарата (1 таблетка) при выпуске должно содержаться не менее 2-109 живых лактобацилл. Показатель активности кислотообразования лактобактерина, выраженный в градусах Тернера (ТО), должен быть не менее 200. 7.9. Определение компонентов стабилизирующей среды высушивания и других веществ, входящих в состав препарата. 8. Маркировка и упаковка При производстве таблеток лактобактерина микробную суспензию сушат в кассетах. Сухую микробную массу (СММ) протирают через металлическое сито в бутыли с азотом. Таблеточную массу готовят в шаровой мельнице с добавлением к СММ вспомогательных веществ (лактозы, аэросила, кальция стеарата). В таблеточной массе определяют количество живых лактобактерий и рассчитывают массу таблетки. Таб-летирование ведут методом прямого прессования в асептических условиях при строгом соблюдении влажности воздуха (не более 50% при 18 °С). Таблетки передают на фасовку во флаконы. Препарат должен находиться в вакууме, атмосфере азота или стерильного воздуха. С целью защиты бактерийных препаратов от агресивной кислой среды желудка создаются таблетки с ацидорезистентным покрытием, капсулиро-ванные формы, иммобилизованные на сорбенте бактерии. Предприняты попытки создания микрокапсулированных форм пробиотиков. Продолжительность процесса производства лактобактерина в ампулах и таблетках составляет соответственно 42 и 66 суток. Хранят препарат в сухом, темном месте при Г= 5±3 °С. Срок годности 12 и 6 месяцев. Срок годности равен 12 месяцам, если в одной дозе при выпуске содержится 4 млрд и более живых лактобацилл; 6 - при содержании от 2 до 3,9 млрд. К концу срока годности должно содержаться 1 млрд живых лактобацилл.

Answer 85

Последние годы характеризуются бурным увеличением количества пробиотиков за счет как модернизации и улучшения свойств старых препаратов, так и появления новых, в том числе поликомпонентных, содержащих новые штаммы микроорганизмов, а также различные биологически активные вещества. Это позволило классифицировать группу пробиотиков на несколько составляющих ее подгрупп: 1. Монокомпонентные. Бифидосодержащие (бифидумбактерин, состоящий из штаммов вида B.breve, бифидин, содержащий штаммы вида B.adolescentis M-42). Лактосодержащие (биобактон, состоящий из ацидофильных лактобактерий). Препараты из апатогенных представителей рода bacillus (споробактерин). 2. Поликомпонентные. Бифилонг, ацилак, аципол, биоспорин, линекс - 3-компонентный препарат из ацидофильных лактобактерий, би-фидобактерий инфантис и фекального стрептококка. Бифилак, би-фикол, бифиформ, бифилонг, ацепол, ацелак, линекс. 3. Комбинированные. Бифидумбактерин форте, кипацид - лактобактерий и комплексный иммуноглобулин, препарат с лизоцимом -бифилиз, биофлор жидкий с экстрактом сои, овощей и прополиса. 4. Иммобилизованные на сорбенте бактерии — бифидумбактерин форте. Бифидо- и лактосодержащие пищевые продукты - бифилакт, би-фидок и др. Бактисубтил (Bactisubtile) - препарат на основе устойчивых к действию желудочного сока спор бактерий, прорастание которых происходит в кишечнике. Вегетативные формы бактерий высвобождают энзимы, расщепляющие углеводы, жиры, белки; в результате образуется кислая среда, угнетающая процессы гниения. Препарат препятствует нарушению синтеза в кишечнике витаминов группы В и Р. Форма выпуска - капсулы. Бифидумбактерин в порошке (Bifidum bacterium in pulveris) представляет собой лиофилизированную микробную массу живых антагонистически активных штаммов Bifidumbacterium bifidum. Обладает антибактериальной активностью в отношении широкого спектра патогенных и условнопатогенных бактерий, восстанавливает микрофлору кишечника, нормализует деятельность ЖКТ, обладает иммунорегулирующими свойствами. Назначают при дисбактериозе у детей и взрослых. Выпускается в виде таблеток", во флаконах, пакетах и ампулах. Бификол сухой (Bificolum siccum) представляет собой микробную массу живых антагонистически активных штаммов Bifidobacterium bifi-dum и Е. coli. Применяется для лечения больных хроническими колитами разной этиологии на фоне дисбактериоза у детей и взрослых. Форма выпуска — флаконы и таблетки. Бифилиз (Bifilys) в 1 мл содержит 5 млн живых бифидобактерий, органические кислоты, легкоусвояемый белок, лизоцим. Показан при острых кишечных заболеваниях вируснобактериальной природы. Бифилонг сухой (Bifilong siccum) представляет собой микробную массу живых антагонистически активных двух штаммов Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium longum. В виде лиофилизата выпускается в ампулах и флаконах. Применяется для лечения острых и хронических заболеваний кишечника, профилактики и лечения дисбактериоза у детей и взрослых. Биовестин — экологически чистая эмульсия живых бифидумбакте-рий (активнее сухого бифидумбактерина). Назначают при диатезах и иммунодефицитах с первых дней жизни. Лактобактерин в порошке (Lactobacterinum in pulvis) — сухая микробная масса живых антагонистически активных двух штаммов Lacto-bacterium acidophilus. Форма выпуска - ампулы. Аципол сухой содержит штаммы Lactobacterium acidophilus и полисахарида кефирных грибков. Рекомендован детям с первых дней жизни и взрослым для коррекции дисбиотических изменений в кишечнике. Линекс (Ыпех) содержит Lactobacterium acidophilus, Bifidobacterium bifidum, E. faecalis. Поддерживает физиологическое равновесие кишечной микрофлоры. Колибактерин сухой - лиофилизированная микробная масса живых бактерий Е. coli. Применяется для лечения детей и взрослых, страдающих хроническим колитом. Форма выпуска — флаконы, ампулы и таблетки. Споробактерин сухой - микробная масса живых бактерий Bacillus subtilis. Применяется для лечения хирургических инфекций мягких тканей, остеомиелита, дисбактериозов. Выпускается в виде лиофилизиро-ванной массы в ампулах. Энтерол 250 (Enterol-250) применяется в качестве активного компонента, содержит лиофилизированные дрожжи Sacchoromyces boulardii, механизм действия которых принципиально отличается от механизма действия других бактериальных препаратов. Sacchoromyces boulardii, обладают генетически обусловленной устойчивостью к антибиотикам и поэтому при проведении антибактериальной терапии сохраняют свою активность. Они не колонизируют пищеварительный тракт, клетки дрожжей элиминируются с калом в течение нескольких дней после завершения курса терапии. Таким образом, Sacchoromyces boulardii действуют как «временная» кишечная микрофлора, способная сохранять или восстановливать равновесие экосистемы кишечника. Концентрат «Наринэ» - лиофилизированная в среде культивирования микробная масса живого штамма Lactobacillus acidophilus новорожденных детей Армении с добавлением защитной среды сахаро-желатино-молочной. Препарат выпускается в виде порошка кремового цвета, кисломолочного вкуса, во флаконах и пакетах. Пребиотики Лактулоза (Lactulose) - синтетический дисахарид. Под влиянием препарата увеличивается количество лактобактерий, что приводит к повышению кислотности в просвете толстого кишечника; наряду с этим увеличивается объем каловых масс и проявляется слабительный эффект без влияния на слизистую оболочку и гладкую мускулатуру кишечника. Лактулоза уменьшает образование и всасывание азотсодержащих токсичных веществ в проксимальном отделе толстого кишечника, не уменьшает абсорбцию витаминов, не вызывает привыкания. Форма выпуска - сироп, состоящий из лактулозы, галактозы, лактозы. Пантотенат кальция. Утилизируется бифидобактериями и способствует увеличению их массы. Памба (парааминобензойная кислота). Способствует росту бифидо-и лактобактерий, кишечных палочек. Хилак-форте - концентрат метаболизма бактерий. Способствует восстановлению нормофлоры. Нормазе (лактулоза) - синтетический дисахарид. Понижает рН в толстом кишечнике, снижает концентрацию гнилостных бактерий, стимулирует перистальтику и рост бифидобактерий. Лизоцим (Lysocim) - мукополисахаридаза, фермент белковой природы. Препарат оказывает бактериолитическое действие, разрушает полисахариды микробной клетки, подавляет рост грамположительных бактерий, стимулирует неспецифическую реактивность организма, оказывает противовоспалительное и муколитическое действие.

Answer 86

Культура клеток, тканей и органов растений представляет собой части растений, выращиваемые в асептических условиях на искусственных питательных средах, и включает: каллусные культуры на гелеобразной (твердой) питательной среде, суспензионные культуры клеток в жидкой питательной среде, культуру протопластов, изолированные органы растений. Первые попытки культивировать изолированные клетки и ткани растений были предприняты в конце XIX в. известными немецкими учеными Г. Габерландтом, X. Фёхтингом и С. Рехингером. Они пытались выращивать in vitro небольшие кусочки тканей растений, помещая их на влажную поверхность фильтра в растворе сахарозы. По аналогии с культурами животного происхождения, где использовались питательные среды природного происхождения (плазма крови, зародышевая жидкость), физиологи растений пытались выращивать клеточную массу, используя соки и экстракты растений. Первые опыты оказались не совсем удачными, поскольку транспорт и превращение питательных веществ у целого растения и изолированных растительных клеток существенно отличается. Лишь к началу 20-х гг. прошлого века ученые отказались от использования природных сред неопределенного состава в пользу синтетических сбалансированных сред. Основой послужили среды, используемые для выращивания целых растений. Описанный период может считаться лишь предысторией метода культуры тканей и клеток растений. Настоящее развитие этого метода началось с работ Филиппа Уайта в США и Роже Готре во Франции. В результате их исследований в 30-х гг. XX столетия было установлено, что изолированные органы, ткани и клетки растений могут расти в культуре in vitro неограниченно долго при пассировании (пересадках) их на свежую питательную среду при определенных условиях. Многие ткани, введенные ими в культуру, существуют в пассированной культуре по настоящее время. Культура клеток и тканей лекарственных растений - сравнительно молодая отрасль науки. Впервые культуру тканей лекарственного растения, а именно барвинка розового, получил Уайт в 1945 г. В 1947 г. в лаборатории Готре была получена культура ткани белены черной и показана ее способность вырабатывать соответствующие алкалоиды. В конце 50-х гг. XX в. был разработан метод массового выращивания клеток и тканей глубинным способом в жидких питательных средах. В СССР первые лаборатории по исследованию культур изолированных тканей и клеток лекарственных растений были открыты на базе Института физиологии растений АН СССР под руководством член-корр. АН СССР Р.Г. Бутенко, в Ленинградском химико-фармацевтическом институте, во Всесоюзном институте лекарственных растений и в Томском медицинском институте (ТМИ). В ТМИ лаборатория была организована при кафедре фармакогнозии и ботаники под руководством профессора Л.Н. Березнеговской. С культурами изолированных тканей и клеток работают по разным направлениям почти во всех странах Европы, в том числе и в России, а также Северной и Южной Америке, Азии, особенно в Китае, Индии, Японии.

Answer 87

Изолированные ткани и клетки растений могут успешно расти только при отсутствии конкуренции с микроорганизмами. Все работы по культивированию растительных объектов необходимо производить в асептических условиях. Если в состав питательной среды входят термолабильные вещества, их фильтруют через мембранные стерилизующие фильтры и добавляют в простерилизованную среду, охлажденную до 30-40 °С. Изолированные фрагменты растения (экспланты), помещаемые на питательную среду, легко поражаются микроорганизмами, поэтому их также необходимо стерилизовать. Предварительно часть растения, из которой будет извлечен эксплант, промывают несколько раз водой очищенной. Затем растительный материал стерилизуют в растворах дезинфицирующих веществ, несколько раз промывают водой и стерильным скальпелем удаляют наружные поврежденные слои клеток. Небольшие кусочки эксплантанта помещают на поверхность питательной среды с гелеобразующим компонентом. Клетки изолированных растительных тканей могут делиться и давать начало длительно растущей недифференцированной массе, называемой каллусом. В настоящее время изолированные клетки и ткани культивируют на многокомпонентных питательных средах, которые отличаются по своему составу в зависимости от вида культуры. В состав всех питательных сред обязательно входят необходимые растению макроэлементы. Лучшей формой азотного питания являются нитраты (калия или аммония), в некоторых случаях дополнительно используются аминокислоты. Кроме азотистых соединений необходимы фосфор, сера, кальций, сульфаты. Отсутствие в питательной среде микроэлементов уже в первом пассаже (пересадке) может уменьшить интенсивность роста тканей на 30-40%, а при последующих - гибель тканей. В зависимости от вида изолированной культуры могут в небольших количествах использоваться: железо, бор, цинк, марганец, медь, алюминий, никель, йод и др. Для успешного роста культур необходимы также источники углерода, поскольку даже зеленеющие, выращиваемые на свету ткани неауто-трофны. Лучшим источником углеводного питания является сахароза, используемая обычно в концентрации 2-5%. Реже используется глюкоза или другие сахара. Большинство тканей, культивируемых in vitro, способны к синтезу всех нужных для их жизнедеятельности витаминов, если все питательные элементы присутствуют в средах. Однако большинство культур синтезируют витамины в субминимальных количествах, поэтому дополнительное внесение витаминов в среду также способствует росту клеток, особенно это относится к витаминам группы В. Чаще используют витамины В1 В2, В6, а также кальция пантотенат, биотин, кислоты: аскорбиновую, никотиновую, фолиевую. Обязательными компонентами питательных сред должны быть фи-тогормоны. К ним относятся ауксины, регулирующие рост и дифферен-цировку клеток и цитокинины, индуцирующие клеточное деление. Природный ауксин в растении представлен в основном в виде (3-индолил-3-уксусной кислоты (ИУК). Для практических целей чаще применяют не ИУК, а синтетические ауксины (а-нафтил-1-уксусная кислота (НУК), 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д), фенилук-сусная кислота (ФУК), фенилмасляная кислота (ФМК) и др.) В отличие от природных ауксинов эти соединения не разрушаются ИУК-оксида-зой в клетках растений. В качестве источников цитокининов в средах используют кинетин, зеатин, 6-бензиламинопурин и др. Действие цитокининов проявляется прежде всего в ускорении клеточных делений, что опосредуется усилением синтеза ДНК, РНК, белков, а также в дифференцировке клеток. В состав некоторых сред входит ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или ее натриевая соль, которые улучшают усвоение клетками железа. На рост и развитие растительных тканей и клеток in vitro большое влияние оказывают физические факторы: свет, температура, аэрация, влажность воздуха. Большинство изолированных культур выращиваются в темноте. При необходимости они могут расти и на свету, образовывая хлорофилл, но при этом проявляют низкую способность к фотосинтезу. В некоторых случаях свет может использоваться как фактор, обеспечивающий морфогенез или активизирующий процесс синтеза биологически активных веществ. Для освещения чаще используют люминесцентные лампы с интенсивностью светового потока 1000-1500 люкс. Оптимальная температура для успешного роста большинства культур составляет 25-27 "С; для индукции их морфогенеза требуются более низкие температуры (18-25 °С). Влажность в помещении, где растут культуры, должна составлять 60-70%. Интенсивная аэрация требуется при культивировании клеток в больших объемах с использованием жидких питательных сред. Аэрацию биомассы клеток осуществляют барботированием стерильным воздухом. При выращивании клеток в малых объемах (колбах) аэрация достигается постоянным перемешиванием суспензий клеток с помощью качалок различной конструкции.

Answer 88

Твердофазный способ культивирования. Каллусные культуры При этом способе культивирования используются так называемые твердые питательные среды, содержащие гелеобразующий компонент, чаще всего агар-агар как наиболее близкий по природе субстрат растительного происхождения. Такая среда имеет вид плотного геля, и каллусные клетки находятся на ее поверхности. Для получения каллусных культур небольшие фрагменты тканей разных органов высших растений помещают на поверхность питательной среды (пробирки, колбы). Через 4-6 недель культивирования экспланта образуется первичный каллус (масса недифференцированных клеток), который необходимо разделить и перенести на свежую питательную среду. Каллусная ткань, выросшая на твердой питательной среде, имеет рыхлую аморфную структуру в виде массы тонкостенных клеток белого или желтоватого цвета. Качественный химический состав каллусной ткани обычно незначительно отличается от соответствующего интактного растения. Твердофазный способ культивирования чаще используется в лабораторных условиях для первичного получения изолированных растительных культур, предварительной оценки культур в качестве возможных продуцентов БАВ, а также для выращивания посевного материала. За 4-6 недель среда истощается, что определяет необходимость производить пересев. В противном случае ткани могут погибнуть. Высшие растения состоят из множества дифференцированных клеток с различными функциями: клетки зеленой ткани листа создают органические вещества в результате фотосинтеза, клетки корня поглощают из почвы минеральные вещества и подают их в другие части растения и т.д. Но все дифференцированные клетки образовались от одной оплодотворенной яйцеклетки материнского растения - зиготы. Эта клетка содержит в себе всю генетическую основу целого растения. Из нее образуются специализированные ткани, различные по химизму происходящих в них процессов, форме и структуре. Клетка (зигота) является родоначальником целого растения, она тотипотентна, т.е. многофункциональна. Кроме зиготы тотипотентность в природных условиях могут проявлять и специализированные клетки. Пример тому - вегетативное размножение черенками, от листа и др. Тотипотентность реализуется также при травмах растений. На раневой поверхности в результате неорганизованной пролиферации клеток происходит образование нароста - каллуса, способствующего заживлению ран (от лат. callus - мозоль, толстая кожа). При образовании каллуса в культуре in vitro происходит неорганизованный рост клеток и их дедифференциация, т.е. потеря первоначальных функций, свойственных ткани или органу, из которых был получен каллус. Клетки как бы обезличиваются, их функции практически одинаковы и существуют за счет питательной среды. Однако при изменении условий культивирования можно вызвать вторичную дифференциацию и получить целое растение. По сравнению с клетками животных и человека растительные клетки обладают большим преимуществом. Они способны в определенных условиях и на соответствующих питательных средах регенерировать целое растение. Решающую роль во вторичном образовании органов (корней и почек) из изолированных клеток и тканей играет соотношение фитогормонов (ауксинов и цито-кининов) и их концентрация в питательной среде. Как бы долго ни выращивались клетки в изолированной культуре, они твердо «помнят» свое происхождение: клетки моркови образуют зародыш целого растения моркови, клетки катарантуса розового — также соответствующее растение и т.д. Культивируемые клетки высших растений - это уникальная клеточная популяция, в которой каждая клетка представляет собой отдельный организм, способный к автономному развитию. При регулярном пассировании способность клеток к делению и росту может поддерживаться очень долго. Есть ткани, которые поддерживаются в культуре in vitro no 60-70 лет. Глубинное суспензионное культивирование Для посева в жидкую питательную среду необходимо получить посевной материал в виде суспензии клеток. Поэтому первичная каллус-ная ткань, которая используется в качестве посевного материала, должна быть более рыхлой и легко фрагментироваться на отдельные клетки. Для отделения крупных агрегатов клеточную массу перед пересевом фильтруют через нейлоновые или металлические сита. При пересевах на 100 мл среды используют 2-3 г свежей каллусной ткани. В лабораторных условиях для культивирования тканей в жидких питательных средах обычно используют колбы емкостью 100-500 мл с небольшим объемом питательной среды. Сосуды с суспензией клеток помещают на качалки с частотой вращения 100—120 об/мин. В таких условиях обеспечивается аэрация тканей и нарастающая масса клеточных агрегатов распадается на отдельные фрагменты. Необходимо отметить, что растительные клетки растут и размножаются значительно медленнее, чем клетки животных или микроорганизмов, время их удвоения составляет 1—3 суток. Поэтому даже при суспензионном культивировании стационарная фаза роста клеток, при которой культура достигает максимума сухой биомассы, наблюдается обычно через 2-3 недели. Истощение питательной среды и накопление продуктов жизнедеятельности клеток определяют необходимость обновления культуральной среды или пересева культуры на свежую питательную среду. В промышленных условиях используется метод непрерывного культивирования в ферментерах (биореакторах) различной конструкции,имеющих конструктивные особенности, которые учитывают специфику растительных клеток. Метод основан на поддержании баланса между разбавлением.среды и удалением части суспензии. Если в культуральную систему периодически добавлять свежую среду, то деление клеток может поддерживаться неограниченно долго. Это послужило основой для создания систем, позволяющих осуществлять непрерывное культивирование. Культуральные системы, функционирующие непрерывно, разделяют на полупроточные и проточные. При полупроточном режиме выращивания через определенные интервалы времени производится отбор . части суспензии и разбавление оставшейся части суспензии свежей средой. Культивирование в ферментерах такого типа может продолжаться несколько месяцев. Проточный режим культивирования позволяет осуществлять непрерывное снабжение культуральной системы свежей питательной средой с одновременным удалением равного объема клеточной суспензии. В таком режиме автоматизированные ферментеры могут функционировать в течение нескольких лет. Глубинное культивирование в ферментерах имеет ряд преимуществ по сравнению с твердофазным статическим способом: —автоматически поддерживаются все необходимые параметры: температура, рН среды, степень аэрации, скорость работы мешалки и пр.; —постоянный контроль содержания в культуральной среде основных элементов питания; —культуральная система периодически пополняется свежей питательной средой; —постоянно осуществляется микробиологический контроль с целью предотвращения инфицирования и гибели культур; — контроль активности роста и деления клеток; — контроль образования БАВ. Необходимо отметить, что для получения БАВ может использоваться не только биомасса клеток, но и культуральная среда. В некоторых случаях получаются штаммы и клеточные линии, почти полностью выделяющие БАВ в культуральную среду, что значительно облегчает процесс их выделения из такого специфического вида сырья. Культура протопластов Протопласт - это клетка, лишенная оболочки. Такая «голая» клетка потенциально способна восстанавливать новую оболочку, делиться, образовывать клеточные агрегаты, из которых можно получить клеточную культуру с новыми свойствами, а затем новое растение - регене-рант. Отсутствие клеточной стенки облегчает проведение различных генетических манипуляций, связанных с реконструированием генома, а также дает возможность получать популяции гибридных клеток в результате слияния протопластов. Существует два способа разрушения клеточной оболочки - механи-. ческий и ферментативный. Последний менее травматичен для клеток и чаще используется. Для получения протопластов растительный материал (например, суспензия клеток мезофилла листа или суспензия культуры изолированных клеток) обрабатывается препаратами пектиназ и целлюлаз или более сложными смесями ферментов. Для получения суспензии клеток целого растения предпочтительнее использовать листья стерильных растений, культивируемых in vitro, поскольку при получении «голых» протопластов также необходимо соблюдать стерильность. После разрушения клеточных стенок суспензию протопластов очищают от остатков клеток и тканей фильтрованием, смесь ферментов удаляют центрифугированием с последующим промыванием в культу-ральной среде. После очистки протопласты ресуспендируют в питательной (культуральной) среде. Изолированные протопласты широко используются в качестве модельных систем в физиологических, цитологических, фитопатологических и других экспериментах, а также генно-инженерных манипуляциях. В настоящее время разработаны способы получения новых гибридов в результате слияния изолированных протопластов различных растений. Поскольку поверхности протопластов имеют отрицательный заряд, то для их соединения необходимо его нейтрализовать. Для индукции слияния протопласты обрабатывают полиэтиленгликолем. Частота слияния протопластов может быть увеличена добавлением декстрана, поливинола или под влиянием электрического поля. После слияния происходит регенерация клеточной стенки. Она образуется менее чем за сутки, после чего клетки начинают делиться. При слиянии протопластов разных родительских растений образуются новые клетки, из которых через культуру каллуса можно регенерировать новое растение с заданными свойствами. В результате слияния протопластов возникают два вида новых клеток: —гомокарионы (гомокариоциды), состоящие из клеток одного родителя; —гетерокарионы (гетерокариоциды), состоящие из клеток обоих родителей. Больший интерес представляют гетерокарионы, которые после слияния отбирают микроскопически. Для отбора исходные протопласты окрашивают флуоресцентными красителями различных цветов. Если происходит слияние протопластов мезофилла листа (зеленые) и культуры изолированных клеток (бесцветные), то получаются гетерокарионы, состоящие из бесхлорофилльных и хлорофиллосодержащих зон, что позволяет вести отбор без предварительного окрашивания. В результате объединения растительных геномов (ядер и цитоплазмы) формируются новые комбинации генов, которые практически невозможно получить обычными методами селекции. Метод позволяет скрещивать представителей разных видов и родов растений и широко используется при выведении новых сортов пищевых, декоративных, технических, а также лекарственных растений. Слиянием протопластов получен гибрид томата и картофеля - «то-мофель», гибриды некоторых лекарственных растений: дурмана индейского и белладонны, скополии гималайской и белладонны, гибрид двух видов дурмана, содержащий на 25% больше тропановых алкалоидов, чем родительское растение. Микроклональное размножение (культура органов растений) Культуры клеток и тканей для массового размножения растений и оздоровления посадочного материала, в том числе лекарственных растений, нашли широкое применение в растениеводстве. Этот метод, названный микроклональным размножением, позволяет от одной меристемы получить (регенерировать) достаточно большое количество новых растений, в том числе и в культуре in vitro. Обязательным условием для микроклонального размножения является идентичность полученного растительного материала исходному материнскому растению. Для обеспечения максимальной генетической стабильности клонируемого материала в качестве исходного экспланта используют молодые слабодифференцированные ткани, в частности кончики молодых стеблей и корней, пазушные почки, зародыши, части молодых проростков и другие меристематические ткани. Культуры клеток, полученные из меристематических тканей, дают возможность получить безвирусные клоны. Распределение вирусов в различных частях растения неравномерное, а меристема, как правило, их лишена. Восстановление целого растения с помощью изолированных культур может происходить разными путями. Прямая регенерация - это получение растений «в пробирке» непосредственно из верхушечных побегов, пазушных почек и т.д. Косвенная регенерация - получение целых растений из меристематических тканей, но с промежуточной стадией каллуса. В обоих случаях дифференциация и органогенез управляется фитогормонами. Выросшее в пробирке растение переносится в грунт. Следует подчеркнуть, что такой своеобразный способ вегетативного размножения основан на свойстве тотипотентности растительных клеток. Это по сути - клонирование растений. В отличие от клонирования животных, которое очень активно обсуждается лишь последнее десятилетие, метод микроклонального размножения растений используется уже более 40 лет. Впервые этот метод успешно применил французский исследователь Ж. Морель в 1960 г. для размножения орхидеи. Из одного безвирусного экспланта ему удалось в течение года получить около 4 млн новых растений, свободных от вирусной инфекции. Метод кло-нального микроразмножения может использоваться для создания элитного и суперэлитного посадочного материала. Основное преимущество метода микроклонального размножения, по сравнению с другими классическими методами, - значительно более высокий коэффициент размножения. Если обычным способом (черенками, луковицами, корневищами и т.д.) от одного растения можно получить от 2—3 до 100 растений в год, то методом микроклонального размножения их число можно увеличить от нескольких тысяч до миллиона. К настоящему времени показана возможность клонировать «в пробирке» около тысячи видов растений. Более чем у ста видов этот метод имеет коммерческое значение. Среди них - декоративные, плодово-ягодные, овощные, древесные, а также некоторые лекарственные растения. Метод культуры тканей и клеток успешно используется для выведения новых сортов, в том числе и высокопродуктивных лекарственных растений. Для создания нового сорта классическим способом в грунте требовалось 10—30 лет. Благодаря методу культуры тканей этот период можно сократить до нескольких месяцев, поскольку сезонность значения не имеет.

Answer 89

Природные запасы лекарственных растений уменьшаются, а синтез БАВ либо не осуществлен, либо нерентабелен. Поэтому технология получения биомассы на основе культуры клеток приобретает большое значение для производства лекарственных средств. Преимущества использования клеточных культур заключаются в следующем: решается проблема дефицита исходного сырья, особенно ценных исчезающих видов, не поддающихся плантационному культивированию; возможно получение фитомассы, полностью свободной от гербицидов, пестицидов, тяжелых металлов и др.; имеется возможность получения новых веществ, не синтезируемых соответствующим целевым растением; возможно управление биосинтезом целевых продуктов за счет условий культивирования, состава питательной среды и другими способами; имеется возможность индустриализации и удешевления производства некоторых БАВ, синтез которых пока не разработан или очень дорог. Вместе с тем, развитие производства БАВ из изолированных клеточных культур в промышленных масштабах сдерживается рядом причин. Некоторые культуры изолированных клеток и тканей либо не синтезируют БАВ, характерные для соответствующего целого растения, либо вырабатывают их значительно меньше. В сравнении с микроорганизмами растительные клетки растут значительно медленнее, время их удвоения в среднем в 20 раз больше, чем клеток микроорганизмов. Вследствие длительности производства высок риск инфекций и гибели культур. Кроме того, большие объемы суспензионных культур растительных клеток состоят как из единичных клеток, так и агрегатов различного размера, которые не идентичны, что усложняет процесс производства БАВ. Вторичные метаболиты многих растительных культур не выделяются в питательную среду, что создает трудности их экстрагирования. Из-за больших размеров растительные клетки очень чувствительны к перемешиванию и снабжению кислородом. Себестоимость производства лекарственных средств на основе культуры изолированных растительных клеток достаточно высока. Промышленный выпуск такой продукции рентабелен лишь для особо ценных БАВ, стоимость которых на мировом рынке очень высока, сырье мало доступно, синтез пока не осуществлен и продуктивность культур достаточно высока. В настоящее время получено более 30 видов различных изолированных клеточных культур лекарственных растений, продуцирующих БАВ либо на уровне соответствующего интактного растения, либо в большем количестве. Первый отечественный биопродукт из культуры изолированных клеток — настойка «Биоженьшень» — разработан в лаборатории культуры тканей Института физиологии растений РАН, под руководством Р.Г. Бутенко. Препарат получен на основе высокопродуктивного клеточного штамма культуры клеток женьшеня и используется для изготовления лосьонов, кремов, а также тонизирующих напитков. Комплекс гинзенозидов (сапонинов женьшеня), выделяемый из культуры тканей, предлагается в качестве противоэпилептического средства. Культивируемые in vitro клетки раувольфии змеиной являются перспективным источником гипотензивных и противоаритмических ин-дольных алкалоидов. Методами клеточной селекции с использованием химических мутагенов и оптимизации условий выращивания получен высокопродуктивный штамм, накапливающий противоаритмический алкалоид аймалин, содержание которого составляет около 50% от суммы алкалоидов, синтезируемых культурой. Получены изолированные клеточные культуры из различных видов барбариса, а также василисника малого. Суспензионная клеточная культура василисника малого продуцирует берберин - растительный антибиотик и противоопухолевое средство, при этом более 80% синтезируемых тканями алкалоидов секретируются в культуральную жидкость. В Японии налажено биотехнологическое производство противоопухолевого алкалоида берберина из культуры клеток коптиса японского, а также производство нафтохинонового пигмента шиконина - природного антибиотика широкого спектра действия из культуры клеток Воробейника. На основе шиконина российские ученые разработали мазь «Эритромин», которая обладает антимикробной активностью в отношении антибиотико-резистентных микроорганизмов, многих патогенных бактерий, а также грибов. Перспектива использования культуры тканей тиса обыкновенного связана с возможностью получения таксола — вещества, обладающего противоопухолевой активностью. Для лечения одного больного в течение года требуется 120—130 г сухой коры нативного растения, сырьевые запасы которого истощаются. Национальный институт рака США выделил около 1 млн долларов для разработки экономически целесообразного способа получения таксола из культуры клеток. Активно продолжаются работы с культурой клеток барвинка розового, продуцирующего противораковые алкалоиды. Стоимость субстанции Винкристина на мировом рынке достигает 30 тыс. долларов за 1 кг, Винбластина - около 20 тыс. за кг. В Германии разработали способ получения кислоты розмариновой из культуры клеток каллуса. Кислота розмариновая - вещество, обладающее противоопухолевой активностью, и природный антибиотик широкого спектра действия. Из культуры клеток табака получен убихи-нон 10. На основе убихинона получают препарат для лечения инсультов и купирования спаечных процессов.

Answer 90

Еще сравнительно недавно ни у кого не возникало сомнений, что окружающая среда - земля, воздух, вода - всегда будут эффективно перерабатывать бытовые, промышленные, сельскохозяйственные отходы. Человечество столкнулось с двумя фундаментальными проблемами - переработкой отходов, постоянно образующихся в огромном количестве, и разрушением токсических соединений, десятилетиями накапливающихся в воде, почве, на свалках. Отходы сжигают, обрабатывают химикатами, но это лишь усугубляет загрязнение окружающей среды и, к тому же, дорого обходится. Разные страны пытаются решить эти проблемы законодательным путем, однако успеха здесь нет. В условиях НТП экосфера испытывает мощное антропогенное воздействие, в результате нарушается природная гармония, сложившаяся тысячелетиями, происходят заметные сдвиги в экосистемах, приводящие к исчезновению целых видов животных и растений, возникают новые формы микроорганизмов, нарушаются иммунные реакции человека. В настоящее время проходят проверку многие технологические, в том числе биотехнологические приемы, с помощью которых возможно перерабатывать большие количества отходов и токсических веществ. Правительства многих стран поощряют предприятия, перерабатывающие отходы производства, повторно использующие содержащиеся в них полезные вещества. Термин «биодеградация» относится к процессу разрушения загрязняющих веществ, попавших в окружающую среду, с помощью живых микроорганизмов. Термин «биомасса» - к совокупности веществ и материалов, побочных продуктов пищевой, перерабатывающей промышленности, ранее считавшихся отходами, ставших сырьем для производства ряда экономически важных продуктов. В середине 1960-х гг. были обнаружены почвенные микроорганизмы, способные деградировать ксенобиотики (гербициды, пестициды, хладагенты, органические растворители и т.д.). Основную группу почвенных микроорганизмов, разрушающую ксенобиотики, составляют бактерии рода Pseudomonas, разные штаммы которых способны расщеплять более 100 органических соединений. В биодеградации сложной органической молекулы обычно участвуют несколько разных ферментов. Гены, кодирующие такие энзимы, могут иметь хромосомную локализацию, но чаще всего входят в состав крупных плазмид, иногда локализуются и в хромосомной, и в плазмид-ной ДНК. Бактерии, разрушающие негалогенированные ароматические соединения, как правило, превращают их в катехол или протокатехоат. Затем, в ходе нескольких реакций окислительного расщепления, - в ацетил-СоА и сукцинат или пируват и ацетальдегид, последние метаболизиру-ют практически все микроорганизмы. Галогенированные ароматические соединения, основные компоненты большинства пестицидов, гербицидов, с помощью этих же ферментов разрушаются до катехола, протокатехоата, гидрохинона или их га-логенированных производных; причем скорость их деградации обратно пропорциональна числу атомов галогена в исходном соединении. Дега-логенирование (отщепление замещенного атома галогена от органической молекулы) необходимо для детоксикации соединения. Дегалоге-нирование осуществляется по ходу неспецифической диоксигеназной реакции замещением галогена в бензольном кольце на гидроксильную группу. 11.1. Метаболические пути биодеградации ксенобиотиков, созданных методом генной инженерии Ряд микроорганизмов обладает природной способностью к деградации различных ксенобиотиков, однако: —ни один из них не может разрушать все органические соединения; —некоторые органические соединения при высокой концентрации подавляют функционирование или рост микроорганизмов, их деградирующих; —большинство очагов загрязнения содержат смесь химикатов; микроорганизм, способный разрушать один или несколько компонентов этих смесей, может инактивироваться другими компонентами; —многие неполярные соединения адсорбируются частицами почвы и становятся менее доступными; —биодеградация органических соединений происходит довольно медленно. Часть этих проблем решает конъюгированный перенос плазмид в один рецепиентный штамм. Если две плазмиды содержат гомологичные участки, между ними может произойти рекомбинация с образованием гибридной плазмиды, которая имеет больший размер и обладает свойствами исходных плазмид. Если две плазмиды не содержат гомологичных участков и относятся к разным группам несовместимости, они могут сосуществовать в одной бактерии. В 1970 г. был создан первый бактериальный штамм, обладающий более широкими катаболическими возможностями. Он расщеплял большинство углеводов нефти и был назван «супербациллой». Для его получения использовали плазмиды, каждая из которых кодировала фермент, расщепляющий определенный класс углеводородов (рис. 22). Конъюгацией была перенесена плазмида САМ в штамм, несущий плазмиду ОСТ. Эти плазмиды несовместимы (не могут существовать в одной клетке в виде отдельных плазмид), но в результате произошедшей между ними рекомбинации образовалась одна плазмида, объединяющая их функции. Затем плазмиду NAH перенесли в штамм, несущий плазмиду XVL; эти плазмиды совместимы и могут сосуществовать в одной клетке-хозяине. Наконец, гибридную плазмиду перенесли в штамм, несущий плазмиды NAH и XVL. В результате этих манипуляций получили штамм, растущий на неочищенной нефти лучше исходных штаммов, взятых по отдельности или вместе. Этот штамм не использовали для ликвидации нефтяных загрязнений, но он сыграл важную роль в становлении биотехнологической промышленности. Изобретатель «супербациллы» получил патент США, описывающий структуру данного штамма и возможности его применения. Это был первый патент на создание генетически модифицированного микроорганизма. Большинство разрушающих ксенобиотики бактерий, модифицированных переносом плазмид, являются мезофилами. Вода загрязненных рек, озер обычно имеет низкий диапазон температур, поэтому была создана бактерия, обладающая более широкими катаболическими возможностями, способная расти и развиваться при более низких температурах. Для этой цели плазмиду TOL (детерминирует разрушение толуола) методом конъюгации перенесли в психрофильный штамм Pseudomonas putida, утилизирующий салицилат при температуре О °С. Трансформированный штамм содержал введенную в него плазмиду TOL и собственную плазмиду SAL, детерминирующую при О °С разрушение сали-цилата и толуола как источников углерода. Психрофильный штамм не-трасформированного типа не мог расти при любой температуре, если единственным источником углерода был толуол. Эта работа показала принципиальную возможность создания психрофильных штаммов бактерий, эффективно разрушающих ксенобиотики в природных условиях. Объединение разных метаболических путей в одном микроорганизме с помощью конъюгации - это лишь один из способов создания бактерий с новыми свойствами. Можно расширить их катаболические возможности, модифицируя гены, кодирующие ферменты того или иного метаболического пути. Совершенствование того или иного катаболиче-ского пути реально с помощью технологии рекомбинантных ДНК, традиционного мутагенеза и соответствующих методов отбора. Одним из наиболее распространенных веществ, загрязняющих почву и воздух, является трихлорэтилен, широко использующийся в качестве растворителя и обезвоживающего средства. Трихлорэтилен длительное время остается в окружающей среде, считается канцерогенном; к тому же, анаэробные почвенные бактерии дегалогенируют его, превращая в еще более токсичное соединение — винил хлорид. Некоторые штаммы P. putida, разрушающие такие ароматические соединения, как толуол, разрушают и трихлорэтилен. Генетическими исследованиями установлено, что для полной детоксикации трихлорэ-тилена не нужны все ферменты расщепления ксилола и толуола, достаточно лишь толуолдиоксигеназы, которая в норме катализирует реакцию окисления толуола до цис-толуолдигидродиола. Образование функциональной толуолдиоксигеназы кодируется четырьмя генами; их выделили и экспрессировали в Е. coli под контролем сильного промотора, который активируется изопропил-B-D-тиогалакто-пиранозидом, в результате трихлорэтилен разлагается до безвредных соединений. Исходная скорость деградации трихлорэтилена в Е. coli ниже, чем Р. putida, но она более длительно сохраняется в Е. coli.

Answer 91

Крахмал - основной резервный полисахарид растений, представляющий смесь гомополимеров D-глюкозы как линейных (амилоза), так и разветвленных (амилопектин). Крахмал широко используют в пищевой промышленности и пивоварении, при этом его сначала гидролизу-ют до низкомолекулярных компонентов, затем превращают в другие соединения, преимущественно во фруктозу и этанол. Основные ферменты, необходимые для гидролиза крахмала и дальнейших превращений, - а-амилаза, глюкоамилаза и глюкозоизомераза, стоимость которых составляет около 30% общей стоимости ферментов, применяемых в настоящее время в промышленности. Промышленное производство фруктозы и этанола из крахмала - многоэтапный процесс, включающий ферментнативные и неферментативные стадии (рис. 23). 1. Желирование молотого зерна (содержание крахмала примерно 40%) проводится паром под давлением, в результате разрушаются крахмальные зерна и храхмал становится доступен для последующего ферментативного гидролиза. Полученный продукт имеет желеобразную консистенцию. 2.Ожижение желированного крахмала заключается в его охлаждении до 50-60 °С и добавлении а-амилазы, под влиянием которой гидро-лизуются доступные а-1,4-связи с образованием низкомолекулярных полисахаридов. Высокая температура повышает эффективность проникновения фермента в желированный крахмал и увеличивает скорость гидролиза. 3. Осахаривание (полный гидролиз) низкомолекулярных полисахаридов (как линейных, так и разветвленных) происходит под действием глюкоамилазы. Конечным продуктом такой переработки является глюкоза, из которой с помощью дрожжевой ферментации получают этанол или при участии глюкозоизомеразы - фруктозу, а-амилазу можно выделить из многих микроорганизмов, для промышленных целей ее обычно получают из Bacillus amyloliquefaciens, глюкоамилазу также синтезируют многие микроорганизмы, но обычно ее получают из грибов Aspergillus niger. Стоимость производства этанола и фруктозы из молотого зерна, в основном, определяется стоимостью ферментов, используемых однократно. Поэтому разработка недорогого широкомасштабного производства этих ферментов существенно снижает стоимость конечных продуктов; для этих целей используют: • разновидности а-амилазы (встречающиеся в природе или созданные методом генной инженерии), обладающие более высокой активностью, позволяющие проводить ожижение при 80-90 °С, это ускоряет гидролиз желированного крахмала, экономит энергию, расходуемую на охлаждение до температуры, при которой идет гидролиз; • модифицированные гены а-амилазы и глюкоамилазы, чтобы контролируемые ими ферменты имели одинаковые оптимумы температуры и рН, позволяющие совместить этапы ожижения и осахаривания; • клонированные бактериальные гены, кодирующие ферменты -термостабильные, обладающие высокой каталитической активностью, устойчивые к действию этанола. Сбраживание субстрата при промышленном производстве этанола осуществляется в основном S. cerevisiae, но более рационально использовать Zymomonas mobilis, грамотрицательную палочку, сбраживающую глюкозу, фруктозу, сахарозу с относительно большим выходом этанола. Для расширения спектра утилизируемых Z. mobilis субстратов, были выделены и экспрессировны в Z. mobilis чужеродные гены (ферментов, гидролизующих лактозу, крахмал, целлюлозу, ксилозу, целлобиозу, пентозу), в частности ген глюкозо/ксилозоизомеразы и ксилулокиназы -ферментов, необходимых для утилизации ксилозы. На следующем этапе в Z. mobilis имплантировали плазмиду, несущую два оперона, один из которых кодировал два фермента, метаболизирующих пентозу. Затем эти два оперона встраивали в челночный вектор Е. coli - Z. Mobilis, которые трансформировали Z. mobilis. Трансформированные клетки утилизировали ксилозу и перерабатывали пентозы до этанола, причем продуценты эффективно росли, используя в качестве источника углерода побочные продукты деревообрабатывающей и целлюлозно-бумажной промышленности. При переработке растительного материала образуется большое количество лигноцеллюлозных отходов, годовое производство их огромно, поэтому идет интенсивный поиск эффективных способов ферментативного расщепления. Комплекс лигноцеллюлозы подвержен совместному действию целлюлолитических микроорганизмов только после предварительной обработки сильной кислотой или щелочью, или высокой температурой под давлением, что существенно сказывается на стоимости конечного продукта. Целлюлазные гены (эндо- и экзоглюканаза, (3-глюгазидаза, целло-биогидролаза, целлобиза) клонировали и экспрессировали в Е. coli или другие микроорганизмы и получали новые штаммы с полезными свойствами. Так, S. cerevisiae и Z. mobilis, эффективно преобразующие в этанол простые сахара, после введения им целлюлозных генов могли превращать целлюлозу непосредственно в этанол. Целлюлазы возможно использовать для промышленной биопереработки бумажных отходов в этанол. Для этого отходы частично расщепляли целлюлазами при 45 °С, затем, не удаляя целлюлаз, проводят ферментацию высвободившейся глюкозы S. cerevisiae при 37 °С. Этот подход позволяет получить 400 л этанола из 1 т бумажных отходов, используя его в качестве топлива, экономя, примерно, 16% бензина. Созданы штаммы Lactobacillus plantarum, способствующие более эффективному образованию силоса из сельскохозяйственных культур, которые содержат много крахмала, например люцерны. Белок одноклеточных организмов (БОО) - этот термин принят для белковых продуктов, синтезируемых монокультурой Methylophilus methylotrophus (в качестве основного субстрата эти бактерии используют метан) на некоторых видах биомассы (целлюлозные отходы, продукты переработки нефти). Предполагалось, что БОО можно использовать в качестве пищевых добавок или корма для скота благодаря высокому содержанию метионина, лизина, витаминов, микроэлементов. Производство БОО оказалось экономически нецелесообразным по причинам высокой стоимости получаемых продуктов, сомнительного вкусового качества и токсичности. Для того чтобы разработать экономичный процесс производства БОО из отходов, необходимо изучить кинетику роста, метаболизма, возможность генетического манипулирования и безопасность многих микроорганизмов.

Answer 92

Продукция биопредприятий на всех этапах — от исследования и лабораторных испытаний до производства и упаковки конечного продукта— требует строгих правил к качеству, чистоте, безопасности лекарственных препаратов. Производство стерильных препаратов особо точно регулируется национальными руководствами и Правилами производства и контроля качества лекарственных средств good manufacturing practice for medicinal products (GMP) ГОСТ Р 52249-2004. Предприятия медицинской и микробиологической промышленности классифицируют согласно международному стандарту ИСО 14694-1 «Классификация чистых помещений и чистых зон загрязнениями», 1998 (от ИОС-1 до ИОС-9 - класс чистоты ПДК). Этой классификации соответствует российский стандарт ГОСТ Р 50766-95 «Чистые помещения. Классификация, Методы аттестации. Основные требования». Стандарт отличается только тем, что вместо ИСО указано обозначение Р (российский), в скобках - класс чистоты по американскому стандарту. Каждое биопроизводство должно обеспечить защиту: —сырья, промежуточных и конечных продуктов от любого загрязнения; —персонала от субстанций, с которыми они работают; —окружающей среды от веществ, которые при отсутствии соответствующих мер и контроля могут потоком воздуха выйти наружу с биопредприятия. При неосторожной работе с рекомбинантными штаммами не исключено их попадание в окружающую среду, где они могут вызвать неконтролируемые мутации не только у микроорганизмов, но и у других видов живых существ. Это требует от персонала, занятого в разработке и реализации биотехнологических процессов с использованием приемов генной инженерии, большей отвественности и производственной дисциплины. Перед окончательным удалением из установки все рекомбинантные микроорганизмы должны быть инактивированы в соответствии с определенными инструкциями. Отработанную культуральную среду тщательно проверяют на наличие в ней жизнеспособных микроорганизмов, чтобы исключить их попадание в окружающую среду. Серьезные экологические проблемы возникают в связи с защитой водоемов от сточных вод, образующихся в больших объемах при биотехнологическом процессе. Основа очистки сточных вод и защиты от них водоемов - дорогостоящие специальные очистные сооружения, а также замкнутые системы водооборота. Перед спуском вточных вод в очистные сооружения отработанные нативные растворы подвергают предварительно УФ-облучению с одновременным введением окислителя, что позволяет разрушить высокомолекулярные органические соединения с образованием низкомолекулярных веществ, поддающихся биологическому окислению в системе очистных сооружений. В «часы пик» предпочтительно эпизодическое использование коммерческих препаратов - генно-инженерных штаммов-деструкторов, например бактерий рода Pseudomonas, в плазмидах которых имеются гены окислительных ферментов. Постоянное присутствие штаммов-деструкторов в промышленных стоках считается малоэффективным по причине малой стабильности плазмид. Затем идут следующие этапы очистки: • первичная обработка (удаление легко отделяющихся загрязнений - крупных, легко осаждающихся частиц, масляных плёнок); • вторичная обработка (удаление суспендированных твёрдых частиц, как правило, органической природы; для этой цели используют биологическое окисление - аэрацию); • третичная обработка (полное отделение всех оставшихся примесей методами электродиализа, обратного осмоса, фильтрации, адсорбции). Используют биологические фильтры, но предпочтительны биологические окислительные пруды с природным комплексом микроорганизмов (активный ил), напоминающие естественные водные экосистемы, где в процессе, фотосинтеза водоросли выделяют кислород, поддерживая аэробный режим, который необходим для бактерий, утилизирующих органические загрязняющие вещества. При этом чётко отслеживается баланс роста и продуктивности бактерий различных групп. Важной задачей защиты окружающей среды является сокращение выбросов вредных веществ в атмосферу. Ее решение связано с глубокой очисткой дымовых газов с исключением рассеивания в атмосфере конечного продукта. Рациональное решение проблемы защиты окружающей среды должно базироваться на современных принципах разработки биотехнологических производств, основанных на безотходной или малоотходной технологии. Это наиболее прогрессивный путь решения экологических проблем, в том числе в области медицинской биотехнологии.

Answer 93

1. Синтетический двухцепочечный олигонуклеотид с одним тупым концом и одним липким концом. После пришивания адаптера тупым концом к ДНК-мишени последнюю можно встраивать в подходящий вектор, используя приобретенный ею липкий конец. 2. Синтетический одноцепочечный олигонуклеотид, у которого после самогибридизации появляются липкие концы и внутренний сайт для рестрицирующей эндонуклеазы. Когда адаптор встраивают в клонирующий вектор, у вектора появляется новый сайт рестрикции.

Answer 94

. Пуриновое основание, комплементарное тимину и урацилу. Одно из азотистых оснований, входящих в состав ДНК и РНК.

Answer 95

. 1. Вещество, стимулирующее транскрипцию специфического гена и оперона. 2. Белок, связывающийся с опероном и ускоряющий транскрипцию; используется также название «активаторный белок».

Answer 96

. Белок мышечных волокон; входит в состав актомиозина -основного сократительного мышечного белка.