Основы Фарм БТ (Прищеп) Flashcards
БТ
БТ - это технологические процессы с использованием биотехнологических систем — живых организмов и компонентов живой клетки
БТ - это использование культур клеток, бактерий, животных, растений, метаболизм и биологические возможности которых обеспечивают выработку специфических веществ. В фармацевтической промышленности БТ охватывает разработку вакцин, синтез гормонов, ферментов,
интерферонов, антибиотиков, аминокислот, витаминов, алкалоидов, полисахаридов и других биологически активных веществ (БАВ).
1917 — введен термин БТ;
Пенициллин произведен в промышленном масштабе
В 1943 г
Установлена структура инсулина, расшифрована структура ДНК
1944-показано, что генетический материал представляет собой ДНК;
1953-установлена структура инсулина, расшифрована структура ДНК;
1961-1966 - расшифрован генетический код, оказавшийся универсальным для всех организмов;
1953-1976 - расшифрована структура ДНК, ее функции в сохранении и передаче организмом наследственной информации, способность ДНК организовываться в гены;
1963-осуществлён синтез биополимеров по установленной структуре;
1970 - выделена первая рестрикционная эндонуклеаза;
—осуществлён синтез ДНК;
1972 - синтезирован полноразмерный ген транспортной РНК;
1975 - получены моноклональные антитела;
1976 - разработаны методы определения нуклеотидной последовательности ДНК;
1978 - фирма «Genentech» выпустила человеческий инсулин, полученный с помощью Е. соli;
1981 - синтезированы фрагменты нуклеиновых кислот;
1982 - разрешена к применению в Европе первая вакцина для жи-
вотных, полученная по технологии рекомбинантных ДНК;
Расшифрован геном
1990-официально начаты работы над проектом «геном человека»; 1994-1995 - опубликованы подробные генетические и физические карты хромосом человека;
1997 - клонировано млекопитающее из дифференцированной соматической клетки;
2003 - расшифрован геном (набор генов, присущий организму) человека, содержащий приблизительно 30 тысяч генов и три миллиарда «букв» молекул ДНК.
Прокариоты
В прокариотической бактериальной клетке хромосомная ДНК находится непосредственно в цитоплазме, клетка окружена ригидной клеточной стенкой. В клетке нет субклеточных цитоплазматических орга-нелл (рис. 3). В оптимальных условиях прокариотическая клетка может делиться каждые 20 мин и таким образом давать жизнь более 10 млрд клеток менее чем за сутки.
Эукариоты
В эукариотической клетке (рис. 4) имеется ядро, отделенное от цитоплазмы ядерной мембраной, хромосомная ДНК находится в ядре. В цитоплазме содержатся различные субклеточные органеляы: мембраны, окружающие ядро, митохондрии, образующие лабиринт эндоплазмати-ческого ретикулума (ЭПР), где синтезируются липиды и мембранные белки. Мембраны формируют стопки уплощенных пузырьков, составляющих аппарат Гольджи, который участвует в синтезе и транспорте различных органических молекул. Мембраны окружают лизосомы (суб-
клеточные структуры диаметром 0,20-0,5 мкм), содержащие гидроли-тические ферменты, необходимые для внутриклеточного пищеварения.
*
Мембраны, таким образом, защищают от действия этих ферментов бел-ки и нуклеиновые кислоты самой клетки. Мембраны также окружают пероксисомы, содержащие окислительные ферменты, производящие и разрушающие опасные высокореакционоспособные перекиси (пероксиды). Обмен между внутриклеточными, окруженными мембранами струк-\турами и внеклеточной средой происходит с помощью эндоцитоза.
Бактерии
Различают две группы бактерий - эубактерии, населяющие почву, воду и другие организмы, и архебактерии, встречающиеся в таких средах обитания, как болота, океанские глубины, очень соленые воды и горячие кислые источники.
Классификация Исходя из температурного режима, который предпочитают
Исходя из температурного режима, который предпочитают те или иные микроорганизмы, их подразделяют на термофилы (от 45 до 90 °С и выше), мезофилы (от 10 до 47 °С) и психрофилы или психротрофы (от -5 до 35 °С). Микроорганизмы, активно размножающиеся лишь в определенном диапазоне температур, - полезный инструмент для решения различных биотехнологических задач.
Полимеры
Простые органические молекулы, такие, как аминокислоты или нуклеотиды, ассоциируют с образованием больших полимеров. Две аминокислоты соединяются пептидной связью, два нуклеотида — фос-фодиэфирной. Последовательное повторение этих реакций ведет к образованию линейных полимеров, называемых соответственно полипептидами и полинуклеотидами. Полипептиды или белки и полинуклеоти-ды в форме ДНК и РНК считаются наиболее важными компонентами.
Мономеры
белки, - это всего лишь 20 аминокислот, а молекулы ДНК и РНК построены только из четырех типов полинуклеотидов. Клетка содержит оба типа полинук-леотидов - ДНК и РНК; в ходе эволюции они специализировались и работают сообща, выполняя каждый свою функцию. Структура полинуклеотидов хорошо приспособлена для хранения и передачи информации. Химические различия между двумя типами полинуклеотидов делают их приспособленными для решения разных задач. Например, ДНК - хранилище генетической информации, так как ее молекула более стабильна, чем молекула РНК. Частично это обусловлено тем, что при наличии в РНК двух гидроксильных групп этот полинуклеотид в большей степени подвержен гидролизу.
ДНК
ДНК - длинная двухцепочечная полимерная молекула. В этой скрученной двойным жгутом гигантской молекуле «записаны» все признаки организма. Последовательность мономерных единиц (дезоксирибонуклеотидов) в одной ее цепи соответствует (комплементарна)
последовательности дезоксирибонуклеотидов в другой.
Принцип комплементарности
Принцип комплементарности обеспечивает идентичность исходных и новосинтезированных молекул ДНК, образующихся при удвоении (репликции).
Механизм комплементарного матричного копирования занимает центральное место в процессах переноса информации в биологических системах. Генетическая информация каждой клетки закодирована в последовательности оснований ее полинуклеотидов, и эта информация
передается из поколения в поколение благодаря комплементарное™ спаривания оснований.
Гены
Индивидуальными генетическими элементами со строго специфичной нуклеотидной последовательностью, кодирующими функциональные белки или РНК, являются гены. Гены находятся в ядре клетки, в хромосомах. В некоторых генах всего 800 пар нуклеотидов, в других -около миллиона. У человека 80-90 тыс. генов. Одни гены, называемые структурными, кодируют белки, другие - только молекулы РНК.
Кодирование
Информация, содержащаяся в генах, которые кодируют белки, расшифровывается в ходе двух последовательных процессов: синтеза РНК, носящего название транскрипции и синтеза белка - трансляции. Сначала на определенном участке ДНК, как на матрице, синтезируется мРНК (информационная, матричная РНК) — в клетках животных этот процесс осуществляется в ядре. Затем, перенеся информацию из ядра в цитоплазму, в ходе согласованной работы многокомпонентной системы при участии тРНК (транспортных РНК), мРНК, ферментов и различных белковых факторов осуществляется синтез белковой молекулы. Все эти процессы обеспечивают правильный перевод зашифрованной в ДНК генетической информации с языка нуклеотидов на язык аминокислот.
Структура ДНК
Аминокислотная последовательность белковой молекулы однозначно задает ее структуру и функции. Нуклеотиды как субъединицы ДНК, РНК выступают также в качестве переносчиков энергии.
Структура ДНК (рис. 5) - это линейный полимер. Его мономерные единицы (нуклеотиды) состоят из азотистого основания, пятиуглерод-ного сахара (пентозы) и фосфатной группы. Фосфатная группа присоединена к 5’-атому углерода моносахаридного остатка, органическое основание - к 1’-атому. Каждому нуклеотиду присвоено название, соответствующее названию входящего в его состав уникального основания. Основания в ДНК двух типов - пуриновые (аденин — А и гуанин — С) и пиримидиновые (цитозин - С, тимин - Т, урацил - U).
Изомеры
Нуклеотиды существовуют в двух оптических изомерах - L и D. Все без исключения живые организмы для построения своих нуклеотидов используют только D-формы.
Присутствие даже малого количества L-формы нуклеотидов ингибирует или полностью блокирует работу ферментов синтеза ДНК.
Состав ДНК и РНК
В ДНК моносахарид представлен 2’-дезоксирибозой, содержащей одну гидроксильную группу, в РНК - рибозой, имеющей две гидро-ксильные группы. Нуклеотиды соединены друг с другом фосфодиэфир-ными связями, при этом фосфатная группа 5’- углеродного атома одного нуклеотида связана с 3’-ОН группой дезоксирибозы соседнего нуклеотида. На одном конце полинуклеотидной цепи находится 3’-ОН группа, на другом 5’-фосфатная группа.
Цепи ДНК
Нативная ДНК состоит из двух полимерных цепей, образующих спираль. Навитые одна на другую полинуклеотидные цепи удерживаются вместе водородными связями, образующимися между комплементарными основаниями противоположных цепей. При этом аденин образует пару только с тимином, гуанин - с цитозином. Пара оснований А-Т стабилизируется двумя водородными связями, пара
С-С - тремя. Длина двухцепочечной ДНК обычно измеряется числом пар комплементарных нуклеотидов. Например, ДНК хромосомы 1 человека представляет собой одну двойную спираль длиной 263 миллиона пар нуклеотидов.
Сахарофосфатный состав молекулы, состоящий из фосфатных групп и дезоксирибозных остатков, соединенных 5’—З’-фосфодиэфирными связями, образует «боковины винтовой лестницы», а пары А-Т и С-С - «ее ступеньки». Цепи молекулы ДНК антипаралельны: одна из них имеет направление 3’—5’, другая 5’—>3’. Нуклеотиды считают парами потому, что в молекуле ДНК две цепочки и их нуклеотиды соединены попарно поперечными связями.
Требования к Носителю генетической информации
Носитель генетической информации должен удовлетворять двум требованиям — воспроизводиться (реплицироваться) с высокой точностью и детерминировать (кодировать)
синтез белковых молекул. Согласно принципу комплементарности, каждая цепь ДНК может служить матрицей для образования новой комплементарной цепи. Когда клетке необходимо разделиться, непосредственно перед этим она копирует молекулу ДНК в своих рибосомах. При этом две нити ДНК расходятся и на каждой из них, как на матрице, собирается дочерняя нить, в точности повторяющая ту, что была соединена с данной нитью в родительской клетке. В итоге появляются две идентичные дочерние хромосомы, которые при делении распределяются по разным клеткам. Так происходит передача наследственных признаков от родителей потомкам у всех клеточных организмов, имеющих ядро. Следовательно, после каждого раунда репликации образуются две дочерние молекулы, каждая из которых имеет такую же нуклеотидную последовательность, как исходная молекула ДНК. Нуклеотидная последовательность структурного
гена однозначно задает аминокислотную последовательность кодируемого ею белка. Следовательно, каждая цепь ДНК служит матрицей при синтезе новой комплементарной цепи, а последовательность оснований в синтезируемой (растущей) цепи задается последовательностью комплементарных оснований цепи-матрицы.
Ферменты для синтеза
Синтез ДНК у про- и эукариот осуществляется при участии множества различных ферментов. Основную роль играет ДНК-полимераза, которая последовательно присоединяет звенья растущей полинуклеотидной цепи в соответствии с принципом комплементарности и катализирует образование фосфодиэфирных связей.
разделения ДНК
Для разделения ДНК разработаны специальные гели на основе агарозы (полисахарид, выделяемый из морских водорослей). Предложена модификация гельэлектрофореза в агарозном геле, названная пульс-электрофорез, пульс-электрофорез, позволяющая разделять большие молекулы ДНК.
Определение последовательности
Определены последовательности нуклеотидов генов многих млекопитающих, включая гены, кодирующие гемоглобин, инсулин, цитохром С. Объём информации о ДНК столь велик (многие миллионы нуклеотидов), что для хранения и анализа имеющихся данных необходимы мощные компьютеры.
Для определения того, какие гены активны в данном типе клеток (идентификация специфических последовательностей), используют метод, именуемый ДНК-футпринтинг. Фрагменты ДНК метят Р , затем расщепляют нуклеазами, разделяют на геле и выявляют на радиоавтографе. Если водный раствор ДНК нагреть до 100 °С и сильно защело-чить (рН 13), то комплементарные пары оснований, удерживающие две цепи двойной спирали вместе, разрушаются и ДНК быстро диссоциирует на две цепи. Этот процесс, называемый
денатурацией ДНК, ранее считался необратимым. Но если комплементарные цепи ДНК выдержать при температуре 65 °С, они легко спариваются, восстанавливая структуру двойной спирали, - процесс получил название ренатурации.
Функции белков
Подавляющее большинство генов содержит в закодированном виде информацию о синтезе белков. Полипептидам присуща большая универсальность, они состоят из аминокислот с химически разнообразными боковыми цепочками и способны принимать разные пространственные формы, которые насыщены реакционноспособными участками. Свойства полипептидов делают их идеально подходящими для выполнения разнообразных структурных и функциональных задач. Белки участвуют практически во всех процессах, протекающих в живых системах, они служат
катализаторами биохимических реакций, осуществляют транспорт внутри и между клетками, регулируют проницаемость клеточных мембран, из них строятся различные структурные элементы. Белки - не только основной строительный материал живого организма, многие из них - ферменты, управляющие процессами в клетке. Белки участвуют в осуществлении двигательных функций, обеспечивают защиту от инфекций и токсинов, регулируют синтез остальных генных продуктов.
Строение аминокислот
Все аминокислоты имеют сходное химическое строение: к центральному атому углерода присоединен атом водорода, аминогруппа, карбоксильная группа и боковая цепь. Существует 20 разных боковых групп и соответственно 20 аминокислот: например, в аминокислоте аланин боковой цепью является метильная группа (табл. 1).
Пептидная связь образуется между карбоксильной группой одной аминокислоты и аминогруппой другой. Первая аминокислота белковой молекулы имеет свободную аминогруппу (N-конец), последняя - свободную карбоксильную группу (С-конец).
Строение белков
Длина белковых молекул варьирует от 40 до 1000 аминокислотных остатков; в зависимости от их последовательности и аминокислотного состава молекулы белков принимают разную форму (конфигурацию, конформацию). Многие функционально активные белки состоят из двух и более полипептидных цепей, как идентичных, так и несколько различающихся. Белки, выполняющие ключевые функции, представляют собой сложные белковые комплексы,
состоящие из множества разных полипептидных цепей - субъединиц.
Перенос генетической информации
С помощью генетического кода полинуклеотидная последовательность определяет последовательность аминокислот в белке; различные триплеты нуклеотидов кодируют специфические аминокислоты.
Важное «передаточное звено» при переводе генетической информации с языка нуклеотидов на язык аминокислот - РНК (рибонуклеиновые кислоты), которые синтезируются на определенных участках ДНК, как на матрицах, в соответствии с их нуклеотидной последовательностью.
Молекулы РНК несут информацию, они обладают химической индивидуальностью, влияющей на их поведение. Молекула РНК обладает двумя важными свойствами: закодированная в её нуклеотидной последовательности информация передаётся в процессе репликации, а уникальная пространственная
структура определяет характер взаимодействия с другими молекулами и реакцию на внешние условия. Оба этих свойства - информационное и функциональное - являются необходимыми предпосылками эволюционного процесса. Нуклеотидная последовательность молекулы РНК аналогична наследственной информации, или генотипу организма. Пространственная укладка аналогична фенотипу - совокупности признаков организма, подверженного действию естественного отбора.
Отличия РНК от ДНК
РНК (рис. 5) — линейная полинуклеотидная молекула, отличающаяся от ДНК по двум параметрам:
1. Моносахаридом в РНК является рибоза, содержащая не одну а две гидроксильные группы;
2. Одним из четырех оснований в РНК является урацил, занимающий место тимина.
Существование РНК в виде одной нити
Существование РНК в виде одной нити обусловлено:
отсутствием у всех клеточных организмов фермента для катализа реакции образования РНК на матрице РНК; такой фермент есть лишь у некоторых вирусов, гены которых «записаны» в виде двухнитчатой РНК, остальные организмы могут синтезировать молекулы РНК только на ДНК-матрице; из-за отсутствия метильной группы у урацила связь между аде-нином и урацилом малоустойчива и «удержание» второй (комплементарной) нити для РНК является проблемным. По причине однонитчатости РНК, в отличие от ДНК, не закручивается в спираль, а образует структуры в виде «шпилек», «петель». Спаривание оснований в молекуле РНК происходит таким же образом, как и в ДНК, за исключением того, что вместо пары А-Т, образуется А-U Комплементарные основания, как и в ДНК, соединены между собой водородными связями.
Существуют три основных типа РНК:
информационная (мРНК);
рибосомная (рРНК);
транспортная (тРНК).
Правильность транскрипции
Правильность транскрипции, т.е. ее начало и завершение в нужных сайтах (специфических участках), обеспечивают специфические нук- -леотидные последовательности в ДНК, а также белковые факторы. Транскрипция на ДНК осуществляется в клеточном ядре. Молекулы мРНК переносят информацию из ядра в цитоплазму, где она используется при трансляции белков, аминокислотные последовательности которых закодированы в последовательностях нуклеотидов мРНК (т.е., в конечном счете, в ДНК). мРНК связана с рибосомами, в которых осуществляется соединение аминокислот с образованием белков.
Рибосомы
Рибосомы - нуклеотидные частицы, в состав которых входит высокополимерная РНК и структурный белок. Биохимическая роль рибосом - синтез белка. Именно на рибосомах происходит соединение отдельных аминокислот в полипептиды, завершающееся образованием белков.
РНК-полимеразы у прокариот и эукариот
У большинства прокариот транскрипция всех РНК осуществляется с участием одной и той же РНК-полимеразы. У эукариот мРНК, рРНК, тРНК транскрибируются разными РНК-полимеразами.
С генетической точки зрения ген
С генетической точки зрения ген представляет собой специфическую нуклеотидную последовательность, траскрибируемую в РНК. Большинство транскрибируемых последовательностей ДНК составляют структурные гены, на которых синтезируется мРНК. Конечным продуктом структурного гена является белок. У прокариот структурный ген представляет собой непрерывный участок молекулы ДНК. У эукариот большинство структурных генов состоит из нескольких дискретных (отдельных) кодирующих областей — экзонов, разделенных
некоди-рующими областями - нитронами. По завершении транскрипции эука-риотического структурного гена интроны вырезаются ферментами из первичного продукта транскрипции, экзоны сшиваются друг с другом «торец в торец» (сплайсинг) с образованием мРНК. Обычно длина экзонов составляет от 150 до 200 нуклеотидов, длина интронов варьирует от 40 до 10000 нуклеотидов.
РНК в клетке %
В активно функционирующей клетке примерно 3-5% суммарной РНК приходится на долю мРНК, 90% — на долю рРНК, 4% — на долю тРНК. мРНК может быть представлена десятками различных типов молекул; рРНК - двумя типами, которые объединяются в рибосомы.
Помимо тысяч рибосом в клетке, активно синтезирующей белки, содержится до 60 различных видов тРНК.
рРНК
Более крупная рРНК образует с белками рибонуклеотидный комплекс, называемый большой рибосомной субъединицей. рРНК меньшего размера — комплекс, называемый малой ри-босомальной субъединицей. При синтезе белков субъединицы объединяются с образованием рибосомы. рРНК принадлежит роль главного катализатора в процессе синтеза белка, она составляет более 60% массы рибосомы. В эволюционном аспекте рРНК представляет собой основной компонент рибосомы.
тРНК
тРНК - это линейная одноце-почечная молекула длиной от 75 до 93 нуклеотидов, имеющая несколько взаимно комплементарных участков, спаривающихся между собой. С помощью специфических ферментов (аминоацил-тРНК-синтетаз) к 3’-концу тРНК присоединяется соответствующая аминокислота. Для каждой из 20-ти аминокислот, из которых состоят все белки, существует, по крайней мере, одна специфическая тРНК. На другом конце молекул тРНК расположена последовательность из трех нуклеотидов, называемая антикодоном, она распознает специфический кадок в мРНК и
определяет, какая аминокислота будет присоединена к растущей полипептидной цепи.
Синтез белка что участвует
Трансляция (синтез белка) осуществляется при участии мРНК, разных тРНК, «нагруженных» соответствующими аминокислотами, рибосом и множества белковых факторов, обеспечивающих инициацию, элонгацию, терминацию синтеза полипептидной цепи.
Нуклеотидная последовательность, в которой закодировано более одного белка, называется опероном. Оперон находится под контролем единственного промотора, и при его транскрипции образуется одна длинная молекула мРНК, кодирующая несколько белков.
Синтез мРНК и соответственно синтез белка строго регулируется, так как у клетки недостаточно ресурсов для одновременной транскрипции и трансляции всех структурных генов. Про- и эукариоты постоянно синтезируют только те мРНК, которые необходимы для выполнения
основных клеточных функций. Экспрессия остальных структурных генов осуществляется под строгим контролем регуляторных систем, запускающих транскрипцию только в случае возникновения потребности в определенных белках. За включение и выключение транскрипции отвечают дополнительные факторы транскрипции, которые связываются с соответствующими участками ДНК.
Стадии синтеза белка
При синтезе белковых молекул первичной стадией образования полипептидной цепи белка является процесс активации аминокислот с помощью аденозинтрифосфата. Процесс активации идет при участии ферментов, в результате чего образуются аминоациладенилаты.
Затем под действием фермента аминоацил-тРНК-синтетазы (для каждой из 20 аминокислот имеется свой особый фермент) «активированная» аминокислота соединяется с тРНК.
Далее комплекс аминоацил-тРНК переносится на рибосомы, где происходит синтез полипептида.
Пептидная связь образуется между карбоксильной группой одной аминокислоты и аминогруппой другой. Первая аминокислота белковой молекулы имеет свободную аминогруппу (N-конец), последняя - свободную карбоксильную группу (С-конец).
Сформировавшиеся белки освобождаются из рибосом, а рибосомы после этого могут присоединять новые комплексы аминоацил-тРНК и синтезировать новые белковые молекулы. Рибосомы связаны с мРНК, которая определяет последовательность чередования аминокислот в полипептидных цепочках. Таким образом, целостность и функциональная активность рибосом в клетках - одно из необходимых условий синтеза белковых молекул.
Технология рекомбинантных ДНК
Технология рекомбинантных ДНК (также молекулярное клонирование, или генная инженерия) - это совокупность экспериментальных процедур, позволяющих осуществлять перенос генетического материала (ДНК) из одного организма в другой. В настоящее время можно вырезать отдельные участки ДНК, получать нуклеотиды на ДНК-синтезаторах (приборах для автоматического химического синтеза ДНК) практически в неограниченном
количестве, определять последовательность нуклеотидов (разделяя, секвенируя их) сотнями в сутки, изменять выделенный ген, вводить его вновь в геном культивируемых клеток или эмбриона животного, где этот измененный ген начинает функционировать. Эксперименты с рекомбинантными ДНК используют крупномасштабно в промышленном производстве БАВ.
Эксперименты по клонированию включают следующие этапы:
- Рестриктазное расщепление из организма-донора нужных генов нативной ДНК (клонируемая ДНК, встраиваемая ДНК, ДНК-мишень, чужеродная ДНК).
2.Быстрая расшифровка всех нуклеотидов в очищенном фрагменте ДНК, позволяющая определить точные границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую геном. - Обработка рестрикционными эндонуклеазами вектора для клонирования, который может
реплицироваться в клетке-хозяине.
4. Сшивание ДНК-лигазой двух фрагментов ДНК с образованием новой рекомбинантной молекулы - конструкция «клонирующий вектор - встроенная ДНК».
5. Введение этой конструкции в клетку хозяина (реципиента), где она реплицируется и передается потомкам. Этот процесс называется трансформацией. После трансформации бактериальная клетка воспроизводит фрагмент клонируемой ДНК миллионами идентичных клеток.
6. Идентификация и отбор клеток, несущих рекомбинантную ДНК (трансформированные клетки).
7. Получение специфичного белкового продукта, синтезированного клетками-хозяевами (рис. 6).
Ферменты рестрикции
Конструирование рекомбинантных молекул осуществляется с помощью ряда ферментов — обязательного и незаменимого инструмента практически всех этапов этого сложного процесса, прежде всего ферментов рестрикции (рестрицирующих эндонуклеаз,
рестриктаз). Рест-риктазы являются составной частью системы рестрикции — модификации прокариотических клеток. Эта система связана с защитой клеток от проникновения чужеродной ДНК. Система модификации осуществляет метилирование собственной ДНК в сайтах ее узнавания немедленно после репликации; чужеродную ДНК, проникающую в клетку, бактерии гидролизуют с помощью рестриктаз.
В настоящее время используется свыше 400 различных рестриктаз. Эти ферменты синтезируют самые разнообразные микроорганизмы. Для их культивирования необходимы оптимальные условия (температура, состав и рН среды, концентрация кислорода и т.д.). С целью повышения продуктивности и стандартизации процесса получения этих ферментов клонируют гены рестрицирующих эндонуклеаз в Е. соli.
Классы рестриктаз
Различают три основных класса рестриктаз. Рестриктазы класса I разрывают молекулы ДНК в произвольных точках, рестриктазы I и III классов обладают метилирующей и эндонуклеазной активностью. Ферменты II класса, которые и используются в генной инженерии, состоят из двух отдельных белков: рестрикционной эндонуклеазы и модифицирующей метилазы.
Механизм работы рестриктаз
Рестриктазы узнают и расщепляют специфические нуклеотидные последовательности в двухцепочечной молекуле ДНК. При молекулярном клонировании важно, чтобы расщепление донорной и векторной ДНК происходило в строго определенных участках (сайтах). Каждый фермент рестрицирующих эндонуклеаз «опознает» в ДНК специфическую последовательность из 4-6 нуклеотидов. Многие рестрицирующие эндонуклеазы вносят разрывы в две цепи ДНК со смещением на несколько нуклеотидов, располагаясь наискось друг от друга. Б результате образуются одноцепочечные комплементарные концы с «хвостами» из 4-х нуклеотидов в каждом («липкие» концы). Кроме рестриктаз, расщепляющих нуклеотидную цепь с образованием липких концов, существуют рестриктазы, вносящие разрывы в цепи строго друг против друга с образованием ДНК с «тупыми концами».
Одних ферментов рестрикции при молекулярном клонировании недостаточно, так как водородные связи между теми четырьмя основаниями, которые образуют липкие концы, не столь прочны, чтобы удержать два объединившихся фрагмента ДНК. Для устранения разрыва в сахарофосфатном остове молекулы служит фермент ДНК-лигаза, катализирующий образование фосфодиэфирных связей между концами по-линуклеотидных цепей, которые удерживаются вместе при спаривании липких концов. ДНК-лигаза сшивает и тупые концы.
Таким образом, одна часть рекомбинантной молекулы ДНК несет нужный ген, который предполагается клонировать, другая — содержит информацию, необходимую для репликации в клетке рекомбинантной ДНК. Кроме того, при ДНК-рестрикции образуются разнообразные фрагменты и после их лигирования (соединения фосфодиэфирной связью) с векторной ДНК появляется множество различных комбинаций фрагментов, например, объединяющих между собой фрагменты донорной ДНК и векторные ДНК. Для уменьшения количества последних рестрицированную векторную ДНК обрабатывают щелочной фосфатазой.
Для введения рекомбинантной ДНК применяют два основных вектора:
Для введения рекомбинантной ДНК применяют два основных вектора:
1) Плазмиды.
2) Бактериофаги.
Плазмиды представляют собой внехромосомный генетический элемент в виде кольцевых молекул ДНК, содержащих 1-3% генома бактериальной клетки. Плазмиды есть у всех бактерий. Одни из них содержат информацию, обеспечивающую их собственный перенос из одной клетки в другую (Р-плазмиды), другие - несут гены устойчивости к антибиотикам (R-плазмиды) или специфические наборы генов, ответственных за утилизацию метаболитов (плазмиды деградации). Каждая плазмида содержит сайт начала репликации, без которого репликация плазмиды в клетке-хозяине невозможна. Если две или более плазмиды не могут сосуществовать в одной и той же клетке — они принадлежат к одной группе несовместимости. Плазмиды, относящиеся к разным группам несовместимости, беспрепятственно существуют в одной клетке независимо от числа копий. У некоторых микроорганизмов в одной клетке обнаружено до 10 разных плазмид, каждая из которых выполняла свои функции и относилась к своей группе несовместимости. Репликация плазмид идет независимо от репликации хромосом. Количество копий определяется регуляторной системой клетки.
Таким образом, плазмиды обладают свойствами, позволяющими использовать их в качестве вектора для переноса клонируемой ДНК. Бактериальный клон, содержащий такую плазмиду, можно сравнить с фабрикой по производству этого фрагмента.
Создание плазмид
Плазмидные векторы, как правило, создают методом генной инженерии, так как природные (немодифицированные) плазмиды лишены ряда обязательных для «высококачественного вектора» свойств:
•небольшого размера, так как эффективность переноса экзогенной ДНК в Е. соli снижается при длине плазмиды более 15 тысяч пар нуклеотидов;
•наличия сайта рестрикции, в который осуществлена вставка;
•наличия одного или более селективных генетических маркеров для идентификации реципиентных клеток, несущих рекомби-нантную ДНК.
Вводят плазмиды в соматические клетки с помощью химических реагентов, повышающих проницаемость клеточной оболочки. В частности, чтобы обеспечить проникновение в клетки плазмидной ДНК, их обрабатывают ледяным раствором кальция хлорида, затем выдерживают при 42 °С в течение 1,5 мин. Эта обработка приводит к локальному разрушению клеточной стенки. Максимальная частота трансформации - 10 , т.е. на каждую тысячу клеток приходится одна трансформированная. Частота трансформации не бывает 100%-й, затем используют схемы отбора, позволяющие идентифицировать трансформированные клетки.
В качестве маркеров плазмида может содержать гены, определяющие устойчивость бактерии к антибиотикам. Вставка чужеродного (до-норного) гена в маркерный ген приводит к инактивации последнего. Это позволяет отличать трансформированные клетки, получившие векторную плазмиду (утратившие устойчивость к антибиотику), от клеток, получивших рекомбинантную молекулу (сохранивших устойчивость к одному, но утративших устойчивость к другому антибиотику). Этот прием называется инактивацией маркера вставки.
Для отбора трансформированных клеток, содержащих рекомбинантную ДНК (гибридную плазмиду), проводят тестирование на рези-стентность к определенным антибиотикам. Например, клетки, несущие гибридную плазмиду, устойчивы к ампициллину, но чувствительны к тетрациклину (в маркерный ген которого и внедрена донорная ДНК).
Создание геномной библиотеки
Процесс разделения геномной ДНК на клонируемые элементы и введения этих элементов в клетки-хозяева называется созданием геномной библиотеки (банка клонов, банка генов).
Все системы клонирования должны отвечать двум основным требованиям
Все системы клонирования должны отвечать двум основным требованиям:
1)Наличию нескольких сайтов для клонирования;
2) Возможности достаточно простой идентификации клеток с ре-комбинантными ДНК.
Клетка-хозяин
Для всех рутинных процедур молекулярного клонирования широко используется Е. соli в качестве клетки-хозяина. Клетки, способные поглощать чужеродную ДНК, называются компетентными; компетентность Е.соli повышают, используя специальные условия культивирования. Для получения больших количеств чужеродных белков с помощью рекомбинантных штаммов Е. соli была сконструирована плазмида, содержащая сильный промотор, селективный маркерный ген и короткий участок с несколькими уникальными сайтами для рестрицирующих ферментов - полилинкер.
Электропорация
Эффективными методами трансформации Е. соН плазмидами является электропорация (воздействие на клеточные мембраны электрическим током для увеличения их проницаемости). Для введения клонированных генов в соматические клетки также применяют микроинъекции и микроукалывания или слияние с клеткой нагруженных ДНК мембранных везикул (липосом).
-носитель
Использование бактериофагов в качестве носителей генетической информации основано на том, что рекомбинантный ген встраивается в геном вируса и в последующем реплицируется с генами вируса при размножении в инфицированной клетке-хозяина. С этой целью применяют бактериофаг ^.-вирус с двухцепочечной ДНК, которая после проникновения в клетку смыкается в кольцо. Бактериофаг М-13 - вирус нитевидной формы с кольцевой замкнутой ДНК, которая в клетке превращается в двухцепочечную и реплицируется в клетках-потомках. В поисках эукариотических систем экспрессии, для получения биологически активных белков, созданы бакмиды - экспрессирующие векторы на основе бакуловирусов для Е. соН и клеток насекомых. Выход рекомбинантных бакуловирусов в такой системе повысился до 99%. Клетки насекомого, инфицированные бакуловирусами, синтезировали гетероло-гичный белок. Векторы на основе фага удобны для создания клонеток (банка генов), но не для тонких манипуляций с фрагментом ДНК. Для детального изучения и преобразования фрагменты ДНК переклонируют в плазмиды.
Кроме указанных векторов в генной инженерии применяют косми-ды - плазмиды, несущие соs-участок (комплементарные липкие концы) ДНК фага X. Наличие соs-участка позволяет производить упаковку ДНК в головку фага in vitro, что обеспечивает возможность их введения в клетку путем инфекции, а не трансформации. Фазмиды - гибриды между фагами и плазмидами - способны развиваться как фаг и как плаз-мида. Уступая космидам по клонирующей емкости, фазмиды дают возможность отказаться от переклонирования генов из фаговых в плазмид-ные векторы.
для получения любого белкового продукта необходимо
Таким образом, для получения любого белкового продукта необходимо обеспечить правильную транскрипцию кодирующего его гена и трансляцию соответствующей мРНК. Для инициации транскрипции (синтеза РНК) в нужном сайте необходим промотор, для ее остановки -терминирующий кодон.
Для синтеза разнообразных белков, кодируемых клонированными генами, интенсивно используют обычные дрожжи S. сегеvisiае; генетика этих одноклеточных организмов хорошо изучена. Рекомбинантные белки, синтезированные в системах экспрессии S. сегеvisiае, применяют в качестве вакцин и лекарственных препаратов Придавать новые свойства существующим белкам, создавать уникальные ферменты возможно, производя специфические изменения с помощью плазмид или ПЦР. Клонированные гены позволяют получать белки, содержащие нужные аминокислоты в заданных сайтах. Внесение специфических изменений в кодирующие последовательности ДНК, приводящие к определенным изменениям в аминокислотных последовательностях, называется направленным мутагенезом.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА
Основу промышленного производства продуктов биосинтеза составляет единая биотехнологическая система (БТС), которая включает основные компоненты, взаимодействующие между собой в определенном режиме посредством соответствующей аппаратуры.
К определяющим факторам биотехнологического процесса относят: вид используемого биотехнологического процесса; субстрат с его биохимическими и биофизическими характеристиками;
аппаратурное оформление, включая систему контроля управления;
технологический режим; соответствие требованиям gmp.
Для получения коммерческих препаратов с помощью рекомбинантных микроорганизмов необходимо сотрудничество специалистов двух областей — молекулярных биологов и биотехнологов. Задача молекулярных биологов - идентификация, изучение свойств, модификация нужных генов, создание эффективных систем их экспрессии в клетках микроорганизмов, используемых для промышленного синтеза соответствующего продукта. Задача биотехнологов - обеспечить условия оптимального роста рекомбинантного микроорганизма с целью получения целевого продукта с наибольшим выходом.
Основные технологические стадии
биотехнологического процесса включают:
- Приготовление и стерилизацию питательных сред;
- Приготовление посевного материала;
- Культивирование;
- Обработку культуральной жидкости;
5.Выделение и очистку биопрепарата; - Получение готовой продукции.
Состав питательной среды
Состав питательной среды должен быть оптимальным, так как это определяет размножение, рост микроорганизмов и синтез различных БАВ. Питательные среды могут быть сложными, включающими до 50 компонентов и более, и достаточно простыми, содержащими не более 5 компонентов.
Назначение питательных сред:
поддержание оптимальных для
роста клеток физико-химических условий (рН, еН, рО2, рСО2, и т.д.);
обеспечение клеток питательными веществами для синтеза биомассы и других продуктов жизнедеятельности. Понятие «среда для культивирования» включает не только определенный качественный и количественный состав компонентов или отдельных элементов, необходимых для конструктивного и энергетического обмена организма (источники азота, углерода, фосфора, ряда микроэлементов, витамины, ростовые вещества), но и физико-химические и физиологические факторы (кислотность, окислительно-восстановительный потенциал, температура, аэрация и др.). Все эти факторы играют существенную роль в развитии микроорганизмов и в проявлении ими отдельных физиологических и биохимических функций. Обычно изменение одного из этих факторов среды влечет изменение других. Значительного повышения выхода нужного продукта, образуемого
микроорганизмами, достигают, используя методы математического расчета соотношения компонентов субстрата и их свойства. Питательные среды принято делить на две группы:
1) среды, требующие внесения 5-20% природных сывороток (из крови человека или эмбриональных экстрактов крупного рогатого скота);
2) синтетические химические среды определённого состава.
Качественная характеристика компонентов питательной среды
Основу питательных сред составляют смеси аминокислот, пуринов, пиримидинов, участвующих в синтезе белков и нуклеиновых кислот.
Сыворотки (эмбриональная сыворотка крови, лошадиная сыворотка или очищенный экстракт куриных эмбрионов), их высокомолекулярные фракции (а-, Р-глобулины) предохраняют клетки от повреждения и стимулируют синтез ДНК. Синтез последних индуцируют
и ростовые факторы (митогены) - вещества пептидной природы. В качестве источника углерода и энергии используется глюкоза или ее комбинации с аспарагиновой или молочной кислотами. Для развития микроорганизмов необходимы витамины жиро- и водорастворимые. Жизнедеятельность микроорганизмов невозможна без наличия в цитоплазме клеток и окружающей среде неорганических соединений, содержащих такие элементы, как фосфор, калий, кальций, магний, сера, железо, марганец, цинк, медь, молибден и др. Микро- и макроэлементы входят в состав ферментов, участвуют в поддержании необходимого осмотического давления и значения рН, буферной ёмкости (фосфатно-бикарбонатные буферы) или регулируют гидрофильность цитоплазмы клетки.
Фосфор входит в состав важнейших соединений клетки - нуклеопротеидов, нуклеиновых кислот, полифосфатов,
фосфолипидов.
Соединения серы участвуют в энергетических процессах клетки, входят в состав многих физиологически активных соединений (белок и простетические группы (-SН) некоторых ферментов и коэнзима А). Без серы невозможен полноценный синтез белка, нарушаются процессы обмена. Обычно источником серы служат неорганические сульфаты, поэтому для включения серы в состав белков или витаминов сульфат должен быть восстановлен с помощью ферментов (сульфитредуктазы, сульфурилазы, пирофосфатазы). Наиболее важным серосодержащим компонентом клетки является аминокислота цистеин.
Калий в организме выполняет, прежде всего, каталитическую роль, выступая в качестве активатора некоторых ферментов (амилазы, инвертазы), способствуя увеличению гидратации цитоплазмы клетки.
Ионы кальция регулируют активную кислотность (рН среды),
