Методы Выделения И Очистки Ферментов Курочкина Flashcards
Методы осаждения
Осаждение - это процесс удаления белка его гидратной оболочки белка, путем добавления водоотнимающих средств (ацетон, этанол). При этом растворимость снижается и белок выпадает в осадок. Легче осаждать белки в их изоэлектрической точке, так как в таком состоянии они минимально связываются с водой.
Осаждение белков из раствора происходит по следующему механизму. В растворе белковые молекулы находится в постоянном движении и не взаимодействуют между собой, так как несут на себе электрические заряды и образуют вокруг себя гидратную оболочку. Для выделения белка из раствора, необходимо разрушить гидратную оболочку и изменить заряд белковой молекулы. Этого можно добиться добавлением в раствор веществ, которые влияют на заряд белковых молекул, или
разрушают их гидратную оболочку.
Метод высаливания
Метод высаливания
Высаливание - процесс осаждения белков, путем добавления к раствору белка растворов нейтральных солей, имеющих различную степень насыщения ((NH4)2SO4, Na2SO4). Механизм процесса высаливания следующий: анионы (SO42-) и катионы (Na+,NH4+) вступают во взаимодействие c заряженными функциональными группами белка (NH4+, COO-). В результате взаимодействия молекула белка теряет заряд, ее гидратная оболочка начинает разрушаться, что приводит к слипанию молекул и выпадению осадка.
*
Рисунок 6. Схема процесса высаливания белков из водных растворов.
Осаждение белков органическими растворителями
Осаждение белков с помощью органических растворителей проходит по следующей схеме: по мере увеличения концентрации органического растворителя способность воды к сольватации заряженных гидрофильных молекул фермента снижается. Увеличение концентрации проводят до тех пор, пока не начинается агрегация и осаждение.
Использование органических растворителей может быть опасно. Они легко воспламенимы, их пары обладают токсическим действием.
Использование органических растворителей может повлечь за собой потерю активности целевого продукта.
Температурная кристаллизация
Сущность метода заключается в том, что у некоторых белков, устойчивых к высокотемпературным воздействиям, происходит резкое изменение растворимости при изменении температуры.
Изоэлектрическое осаждение
Количество положительно или отрицательно заряженных функциональных групп в белковой молекуле напрямую зависит от рН раствора, и в изоэлектрической точке становится нулевым. После потери заряда частицы белка слипаются и выпадают в осадок. Для изменения рН раствора используют различные кислоты, щелочи и соли, ионы которых определяют ионную силу раствора. Многие белки имеют близкие по значению изоэлектрические точки, что затрудняет процесс их выделения.
Хроматографические методы
Хроматография – это физико-химический метод разделения веществ, в основе которого лежит распределение компонентов исследуемой смеси между двумя фазами: подвижной и неподвижной. В качестве неподвижной фазы обычно выступает сорбент, в качестве подвижной - жидкость или газ, который попускают через слой сорбента.
Раствор, в котором содержится исследуемые вещества, пропускают через слой неподвижной фазы, предварительно подготовленный загруженный в хроматографическую колонку. Так как молекулы компонентов исследуемой смеси имеют различную молекулярную массу и за счет этого слой неподвижной фазы с разной скоростью. Некоторые из них не задерживаются в колонке, и выходят сразу, вместе с подвижной фазой, другие остаются в слое сорбента, причем те молекулы, которые имеют большую адсорбируемость, остануются в верхней части колонны, а молекулы с меньшей адсорбируемостью - в нижней части колонны. Именно благодаря этим процессам происходит разделение исследуемой смеси на фракции.
Преимуществами хроматографических методов являются:
Гибкость (разделение веществ на основе разных типов взаимодействия между сорбентом и сорбатом);
Продукт концентрируется в ходе взаимодействия сорбента с целевым продуктом, который содержится в многокомпонентной смеси;
Возможность избегания денатурации целевых продуктов прри помощи подбора оптимальных условий для проведения процесса;
Вещества не подвергаются химическим изменениям; Сохраняется конформация белков и ферментов.
Хроматографические методы позволяют разделять сложно-компонентные смеси как органической, так и неорганической природы, очищать вещества от примесей и концентрировать целевой продукт из сильноразбавленных растворов. Поэтому хроматографические методы нашли широкое применение в различных отраслях промышленности: нефтехимической, газовой, пищевой, а так же в медицине. В настоящее время фармацевтические предприятия все чаще используют хроматографические методы для получения высокоочищенных субстанций ферментов.
