Культивирование Flashcards
Трансфекция
– это процедура, в ходе которой происходит введение
чужеродных нуклеиновых кислот в клетки с целью их генетической
модификации
Профиль гликозилирования
Гликозилирование — это присоединение углеводов к остову белка посредством ферментативной реакции
Необходимые вещества для роста клетки
- Источник углерода, обычно глюкоза
- Аминокислоты, основной материал для синтеза белков
- Неорганические соли для поддержания осмотического баланса и буферных свойств
- Микроэлементы и витамины, необходимые для диссимиляционного и ассимиляционного метаболизма
Осмотический баланс клетки
Это способность организмов контролировать концентрацию растворённых веществ внутри и вокруг своих клеток.
Буферные свойства клетки
Это способность поддерживать постоянный уровень рН
Диссимиляционный и ассимиляционный метаболизм клетки
Метаболизм (обмен веществ) состоит из двух процессов:
1. Диссимиляция (энергетический обмен, катаболизм) распад слоных веществ на простые с выделением энергии. По способу диссимиляции выделяют аэробов и анаэробов.
2. Ассимиляция (пластический обмен, анаболизм) совокупность процессов биосинтеза, которые протекают в живом организме. По способу ассимиляции выделяют автотрофов (сами синтезируют орг. в-ва из неорг.) и гетеротрофов (получ орг в-ва с пищей).
Неорганические соли
Одно из главных условий сохранения жизнеспособности клеток - поддержание рН и осмотического давления.
Смесь солей в основе питательной среды выполняет эту функцию.
В большинстве сред, как и в крови, используется бикарбонатный буфер, поддерживающий рН.
В среду добавляют ионы натрия и калия (в виде солей) для обеспечения осмотического баланса клеток.
Но все три иона (натрия, калия, хлора) регулируют мембранный транспорт питательных веществ и макромолекул (в клетку и из клетки), а также поддерживают ионную силу, необходимую для функционирования ферментов или непосредственно участвуют в ферментативных реакциях.
Из-за выделяющегося углекислого газа и лактата в ходе окисления субстратов, культурадьныя среда может стать более кислой.
рН регулируют добавление кислоты или основания или регулированием количества углекислого газа (продуваемого над поверхностью среды. Обычно этим управляет автоматически
контроллер, сравнивающий измеренное значение pH с заданным значением).
Микроэлементы
Замещают сывороточные элементы.
Необходимы для гликозилирования и поддержания функциональности ферментов.
Кальций, медь, магний, марганец, цинк, селен часто поступают в виде соли и играют важную роль в энергетическом и конструктивном обмене. Также являются кофакторами ферментов и регуляторами мембранного транспорта.
При повышенных концентрациях могут быть токсичны.
Реакция Фентона
Пагубное влияние активных форм кислорода (АФК) в культуре клеток
млекопитающих часто связано с наличием свободных ионов переходных металлов.
Накопление свободных гидроксильных радикалов, которые повреждают
разнообразные биомолекулы, катализируется окислительно-восстановительным
циклом ионов меди (Cu) и железа (Fe), известным как реакция Фентона.
В присутствии ионов двухвалентного железа пероксид водорода
разлагается с образованием гидроксильного радикала (HO.):
H2O2 + Fe2+ → Fe3+ + HO- + HO.
Эта реакция (известная как реакция Фентон) приводит к
печальным последствиям для окружающих клеток. Радикал гидроксила
чрезвычайно активен химически и разрушает почти любую
встретившуюся ему молекулу.
(а) редокс-активные переходные металлы катализируют образование дисульфидных связей и впоследствии
вызывают образование АФК через реакцию Фентона; (б) цинк стабилизирует свободные
сульфгидрильные остатки, тем самым препятствуя образованию АФК
Витамины
Наиболее часто для стимулирования роста клеток добавляются витамины группы В. Биотин является кофактором ферментов, участвующих в метаболизме жирных кислот и
усиливает рост клеток, синтез белка. Холин, фолиевая кислота, никотинамид, пантотенат, пиридоксаль, рибофлавин и тиамин также необходимы для роста клеток.
Антибиотики
используются для
контроля роста бактериальных и грибковых загрязнений, а также действуют как
агенты селекции, используемые для отбора и создания генетически
модифицированных клеток. Селективные антибиотики для создания стабильных
клеточных линий или других рекомбинантных культур следует выбирать на основе
гена устойчивости к антибиотикам или селектируемого маркера.
Частое использование
антибиотиков для культивирования клеток не рекомендуется, поскольку антибиотики
могут маскировать заражение микоплазмой и устойчивыми к антибиотику
бактериями, рост которых ингибируется, но они не умирают. Также необходимо
определять остаточную концентрацию антибиотиков для доказательства того, что в
выпускаемом препарате их содержание находится в допустимых значениях.
Антибиотики следует использовать только в крайнем случае и только для
кратковременного применения, после чего удалить их из среды.
Аминокислоты
поступают в ростовую среду и/или образуются в результате
биосинтеза клетками.
Они необходимы для роста клеток, используются для
синтеза белков, участвуют в энергетическом обмене. В результате катаболизма
аминокислот клетка может окислять соединения для последующего образования
промежуточных продуктов цикла ТСА, которые используются в центральных
метаболических путях.
Избыточное поступление аминокислот приводит к образованию побочных
продуктов, в частности аммония. Аммоний образуется в основном при распаде
глутамина, но также и других аминокислот. При накоплении аммонии оказывает
негативное влияние на качественные характеристики продукции, a также на рост
клеток.
Питательные среды можно разделить на две категории: незаменимые и
заменимые. Все составы сред содержат десять незаменимых аминокислот, тк клетки
не могут их синтезировать. Дефицит незаменимых аминокислот может привести к
немедленному прекращению роста и потере жизнеспособности в результате апоптоза.
(обычно цистеин, глутамин и
тирозин) снижает метаболическую нагрузку на клетки.
L-глутамин — незаменимая аминокислота, необходимая практически всем
клеткам млекопитающих.
Цикл ТСА
Цикл трикарбоновых кислот — это ключевой этап дыхания всех клеток, использующих кислород, центр пересечения множества метаболических путей в организме, промежуточный этап между гликолизом и электронтранспортной цепью.
Кроме значительной энергетической роли циклу отводится также и существенная пластическая функция, то есть это важный источник молекул-предшественников, из которых в ходе других биохимических превращений синтезируются такие важные для жизнедеятельности клетки соединения, как аминокислоты, углеводы, жирные кислоты и др.
Цикл Кребса - это сложная серия химических реакций, которые производят углекислый газ и аденозинтрифосфат (АТФ), соединение, богатое энергией. Этот цикл внутри человеческого организма происходит во всех клетках, которые используют кислород в процессе дыхания.
Углеводы
Углеводы в форме сахара — основной источник энергии при культивировании
клеток. Гликометаболизм является основным источником АТФ для клеток, поэтому производство белка сильно зависит от эффективности метаболизма сахаров.
В случае клеток млекопитающих основным используемым углеводом является глюкоза, в некоторых составах для определенных целей используют также галактозу, мальтозу, фруктозу и другие сахара. Углеводы могут
включаться в состав среды и добавляются во время культивирования в качестве
отдельной добавки или как часть подпитки.
Количество глюкозы в составах клеточных культур колеблется от 1 г/л (5,5 мМ)
до 10 г/л (55 мМ). Во время культивирования клеток необходимо поддерживать
минимальную концентрацию глюкозы на уровне 2–3 г/л, но избыток глюкозы также
ингибирует рост и снижает титр белка. Многие классические среды содержат
примерно 5,5 мМ D-глюкозы, что приблизительно соответствует нормальному уровню сахара в крови in vivo.
Высокие уровни глюкозы ингибируют окислительный метаболизм, что
приводит к образованию лактата. Это вызывает преждевременный клеточный стресс.
При низких уровнях глюкозы, клетки специально используют глюкозу
для удовлетворения энергетических потребностей, а не для гликозилирования
ПФП
Пентозофосфатный путь (ПФП) представляет собой альтернативный путь
окисления глюкозы, который регенерирует НАДФН, способствующий окислительновосстановительному балансу в цитоплазме и образованию сахаров С5, которые
участвуют в реакциях биосинтеза, в частности в биосинтезе нуклеотидов. Потоки
ПФП увеличиваются во время стационарной фазы по сравнению с экспоненциальной
фазой в 5–6 раз. Так в перфузионном режиме доля глюкозы, поступающей в ПФП,
оценивалась в 20–40%, в периодическом же режиме доля ПФП намного ниже.
эффект Крэбтри
Эффект Крэбтри работает путем подавления дыхания путем ферментации, в зависимости от субстрата . Образование этанола в Крэбтри-положительных дрожжах в строго аэробных условиях сначала считалось вызванным неспособностью этих организмов увеличивать скорость дыхания выше определенного значения.
Гликозилирование антител
Гликозилирование антител во многом зависит от концентрации различных
углеводов в среде, поскольку они действуют как предшественники пула нуклеотидных
производных сахаров, необходимого для гликозилирования. Различные концентрации
глюкозы могут оказывать существенное влияние на гетерогенность гликанов, что
особенно важно в процессах с подпиткой, когда для достижения заранее
определенного клинического результата необходимо последовательное
гликозилирование продукта.
Стратегия полной замены глюкозы другими сахарами, конечно, позволяет добиться коррекции профиля гликозилирования и снижения продукции лактата, но также приводит к снижению плотности клеток и титра белка.
В условиях, когда доступно
более одного источника углерода, клетки
отдают приоритет субстрату с самой высокой скоростью транспорта из-за конкуренции мембранных переносчиков.
Метаболизм лактата
Регенерация NAD+ из NADH, необходима для продолжения работы гликолиза.
Окисление глицеральдегид-3-фосфата до пирувата инициируется глицеральдеги-3-
фосфатдегидрогеназой (G3PD), в результате генерируется АТФ и NADH, а зависит это
окисление от наличия цитоплазматического NAD+ . NAD+ не перемещается между
митохондриями и цитоплазмой, а количество цитоплазматического NAD+ ограничено.
В условиях высокого содержания глюкозы в клетке будет накапливаться
глицеральдегид-3-фосфат, если только цитоплазматический NADH не подвергается
постоянному повторному окислению.
Клетки окисляют цитоплазматический NADH комбинацией трех путей:
аспартатно-малатного челнока, глицерин-фосфатного челнока и во время превращения пирувата в лактат. Последний путь активен как минимум на начальных стадиях роста
Глицерин-фосфатный челнок
Цитоплазматическая глицерин-3-фосфатдегидрогеназа (цГФД) переносит пару электронов от NADH к дигидроксиацетонфосфату (ДГАП), образуя глицерин-3-фосфат (Г3Ф) и регенерируя NAD+, необходимый для выработки энергии посредством гликолиза.
Аспартат-малатный челнок
Более сложным и более эффективным челночным механизмом является малат-аспартатный челнок. Он переносит восстановленные эквиваленты
цитоплазматического NADH, образующегося при окислении G3P, в матрикс
митохондрий в виде малата. При этом он регенерирует NAD+, который может использоваться G3PD для поддержания гликолиза. Эта система частично управляется глутамином.
Лактатдегидрогеназа
ЛДГ может повторно окислять цитоплазматический NADH, превращая пируват в лактат. Это расточительный процесс, ведущий к метаболическому тупику. NADH, который не был окислен аспартат: малатным или глицерол: фосфатным челноком, окисляется ЛДГ через окисление пирувата.
Накопление лактата в системах клеточных культур свидетельствует о том, что челноки неспособны повторно окислять весь NAD+ , необходимый для поддержки катаболизма G3P.
Лактатный сдвиг
Высокая концентрация лактата приводит к пагубным последствиям для роста и
продуктивности клеток. Одним из ключевых изменений, которые могут (должны)
произойти в ходе производственного цикла, является переход от продукции лактат к
его потреблению, хотя бывает и одновременное потребление глюкозы и лактата.
Важно отметить связь между потребления лактата и увеличением продуктивности,
следовательно метаболический сдвиг от производства лактата к его потреблению
может считаться маркером метаболической эффективности.
В потреблении лактата участвуют два ключевых белка: монокарбоксилатный
транспортер (MCT), через который лактат входит в клетку и выходит из нее в
совместном транспорте с Н+, и лактатдегидрогеназа (LDH), которая превращает лактат в пируват. Вторая идея основывается на том, что контроль над любым из этих белков позволяет управлять метаболизмом лактата. Регуляция MCT происходит на экспрессионном уровне, а активность МКТ полностью контролируется концентрацией лактата и Н+. Вначале концентрация лактата вне клетки низкая, поэтому весь лактат, вырабатываемый клеткой, экспортируется.
Подкисление цитозоля, происходящее в результате гликолиза, также выводит лактат из клетки, создавая градиент рН через
плазматическую мембрану.
Добавление основания в среду повышает pH среды и позволяет лактату
достигать таких высоких концентраций в культуральной среде. Для того чтобы
началось потребление лактата, должно произойти одно из двух событий: либо
концентрация H+ внутри клетки должна упасть, и приток протонов по градиенту
концентрации будет переносить лактат вместе с ним, либо концентрация
внутриклеточного лактата должна упасть ниже концентрации внеклеточного лактата
настолько, чтобы он смог преодолеть градиент pH
Подпитка для культуры
Фактически, большая часть биологических препаратов на основе клеток CHO
производится с использованием периодического процесса с подпиткой. Поскольку базальные среды могут не содержать все специфические питательные вещества и факторы роста, необходимые для поддержания роста на протяжении всего процесса, в ходе культивирования к средам обычно регулярно добавляют подпитки, чтобы обеспечить клетки дополнительными питательными вещества, факторами роста,
регуляторами метаболизма. Состав добавок обычно более сложен, чем базальной
среды, и многие из них включают дополнительные аминокислоты, витамины,
микроэлементы и другие добавки, которых нет в питательных средах.
Основные факторы, определяющие оптимальную подпитку культуры,
включают:
1. не допустить токсического эффекта;
2. поддержание желаемых посттрансляционных модификаций белков;
3. повышение жизнеспособности клеток и предотвращение апоптоза;
4. увеличение продолжительности жизни культуры;
5. способствование аккумуляции продукта, а не просто концентрации клеток;
6. способствование аккумуляции высококачественного продукта, а не
просто количества продукта.
Основные побочные продукты и их токсический эффект
Высокие концентрации побочных продуктов метаболизма наносят ущерб росту клеток и
синтезу антител. Наиболее известными из них являются лактат и аммоний, однако
было выявлено и множество других.
Измерение состава среды с помощью различных анализаторов метаболитов в
ходе всего процесса позволяет проводить количественный анализ и динамику
ключевых метаболитов и субстратов, присутствующих в питательной среде, что
позволяет получать данные о том, какие пути и реакции активны в клетке при
заданных условиях культивирования.
Индикаторы клеточных процессов
Глюкоза
- Основной источник
энергии для жизнедеятельности клетки.
- Субстрат для гликозилирования.
- В процессе жизнедеятельности
клетки потребляют глюкозу.
- Скорость потребления зависит от
концентрации клеток, активности метаболизма
Продукт метаболизма: Лактат CO2, H2O
Норма: Обычно 2-10 г/л
Лактат
- Дополнительный источник
энергии для жизнедеятельности клетки.
- Субстрат для гликозилирования
- В высоких концентрациях ингибирует клеточный рост
Продукт метаболизма: CO2, H2O
Норма: ≤5,5 г/л
Глутамин
- Предшественник азотистых
оснований в ДНК, входит в состав белков.
- Составляет до 25% от всех аминокислот в белке.
- Деградация глутамина приводит
к образованию аммония и глутамата
Продукт метаболизма: Глутамат, NH4 +
Норма: ≤10 ммоль/л
Глутамат
- Способен входить в TCA, следовательно может служить дополнительным источником энергии в клетке.
- Способен превращаться в аминокислоты
Продукт метаболизма: CO2, H2O
Норма: ≤10 ммоль/л
Ионы натрия и калия
Na+ Поддержание
осмотического давления
K+ Катализатор при обмене
углеводов и белков
Изменение в концентрациях натрия и калия вызывает изменение осмоляльности
культуральной жидкости. При увеличении концентрации клеток в культуральной жидкости содержание натрия постепенно
увеличивается, а калия снижается (действие натрий-калиевого насоса).
В норме отношение Na+ к K+ примерно 20:1
NH4+
- Является побочным продуктом азотистого
обмена
- В высоких концентрациях ингибирует клеточный рост. При увеличении концентрации клеток в культуральной жидкости постепенно увеличивается
содержание аммония. Влияет на
внутриклеточный рН, снижает скорость роста клеток, максимальную плотность клеток, продуктивность рекомбинантных
белков, может изменить профиль
гликозилирования, увеличивает скорость потребления глюкозы.
Большое количество аммония находится внутри клеток, поэтому при их гибели часто
увеличивается концентрация аммония в среде
Норма: ≤4 ммоль/л
На поздних стадиях культивирования его
концентрация увеличивается также за счет
гибели клеток и может достигать 10 ммоль/л
Осмоляльность, мОсм/кг.
- Свидетельствует о содержании осмотически активных частиц в
культуральной жидкости.
- Изменение осмоляльности
связано с добавлением питательных добавок, щелочи, сахаров
В норме: 270 до 330 мОсм/кг, на поздних
стадиях культивирования осмо вырастает
до 450–550 мОсм/кг
Лактат
Глюкоза служит основным источником углерода. Лактат является одним из
основных токсичных метаболитов, обнаруживаемых в центральном метаболизме.
Лактат подавляет рост клеток, индуцирует апоптоз и снижает титр рекомбинантных
терапевтических продуктов, что связано с понижением рН, а добавляемая щелочь, для
восстановления рН, приводит к нежелательному повышению осмоляльности.
Метаболизм лактата клеточноспецифичен, и получаемое количество сильно
зависит от состава среды, стадии культивирования и генетическими особенностями клеточной линии. В биореакторе чистое производство лактата обычно наблюдается в ходе фазы экспоненциального роста. Для уменьшения производства лактата используется несколько вспомогательных стратегий. Классическим методом является
ограничение количества глюкозы в культуральной среде. Однако слишком низкая концентрация глюкозы затормозит рост клеток, а также снизит титр антител. На
практике концентрация глюкозы часто поддерживается на уровне 1-6 г/л. Другой
вариант - использование вместо глюкозы альтернативные источники, но это чревато
замедлением роста и понижением продуктивности даже при больших концентрациях этих углеводов.
Аммоний
Основной источник его образования - метаболизм глутамина.
Даже малые концентрации аммиака могут иметь токсический эффект. Высокие концентрации аммония приводят к таким последствиям, как ингибирование роста клеток, ухудшение продуктивности рекомбинантного белка, изменения профиля гликозилирования.
Некоторые линии клеток, в том числе клетки CHO, производят глутаминсинтетазу (ГС) - фермент, который катализирует синтез глутамина из глутамата и аммиака. Если эндогенная активность глутаминсинтетазы достаточно высокая, чтобы клетки пролиферировались в безглутаминовой среде, то можно заменить глутамин глутамато, что поможет уменьшить концентрацию аммония в результате синтеза глутамина из аммония и глутамата. Также существуют линии CHO, лишенные глутаминсинтетазы и для них необходимо наличие глутамина в среде.
Осмоляльность
Осмолярность определяется суммой содержания ионов на в 1л растворителя и
выражается в миллиосмолях на литр (мОсм/л). Осмометры же обычно измеряют
осмоляльность, выражающаяся в миллиосмолях на килограмм (мОсм/кг).
Осмолярность и осмоляльность часто приравниваются. Осмоль — это количество
молей вещества, которое способствует осмотическому давлению раствора. В
осмометре для измерения осмоляльности обычно используется депрессия точки
замерзания.
Внесение подпиток, добавок, в том числе гидрокарбоната натрия, изменяет
конечную осмолярность среды, что может негативно сказаться на росте клеток в
культуре. Желательно проверять осмоляльность ростовой среды после добавления подпиток, а также проверять осмоляльность среды и подпиток после приготовления.
Осмоляльность связана как с регуляцией пролиферации клеток, так и с
продуктивностью рекомбинантных белков. Оптимальная осмоляльность для
большинства линий клеток млекопитающих должна находиться в диапазоне от 260 до
330 мОсм/кг. Более высокое или более низкое осмотическое давление нарушает
целостность клеточной мембраны и, соответственно, вызывает разрушение клеток.
Гликозилирование
MAb представляют собой сложные белки и требуют правильную сборку и
посттрансляционные модификации. Хотя биологическая активность белков
закодирована в их аминокислотных последовательностях, на нее существенно влияют посттрансляционные модификации, такие как дезамидирование, образование
дисульфидной связи и гликозилирование. Последнее является самой распространенной посттрансляционной модификацией (около 50% всех белков нашего организма гликозилировано).
Гликаны сперва синтезируются в виде предшественника на мембранах эндоплазматического ретикулума и там же прикрепляются к строго определенной аминокислотной последовательности уже синтезированного белка.
После этого начальный гликопротеин переносится в аппарат Гольджи, где он может остаться как есть либо претерпеть дальнейшие изменения с удалением ”лишних” сахаридов и достройки до новой сахарной структуры.
Этим занимается огромное количество ферментов гликозидаз, которые строго
специфичны к тому, какой моносахарид, куда и каким образом они присоединяют.
Получившиеся гликоконъюгаты либо секретируются наружу, либо остаются
связанными с клеточной мембраной и становятся компонентом гликокаликса,
формируя структурно-функциональный рельеф клетки.
Вариации профиля гликозилирования влияют на различные биологические процессы, такие как передача сигнала, сворачивание белка, иммунный ответ. Поэтому гликозилирование считается критическим показателем качества
Факторы, влияющие на гликозилирование
На возможность постройки гликана будет влиять доступность ферментов,
материала (пула моносахаридов), кофакторов ферментов, времени прохождения в тельцах Гольджи и тд. Одни лишь эти факторы — достаточно непредсказуемы и зависят от генетического статуса клетки (генотипа и мутаций экспрессии генов), от уровня экспрессии генов и от клеточного гомеостаза в данный момент времени.
Всё это взаимосвязано и может регулироваться как внутренними стимулами клетки, так и факторами среды. Такая пластичность — настоящее испытание для биоразработки.
Сейчас даже нет исчерпывающих данных обо всех условиях, обеспечивающих
появление того или иного гликана, не говоря уже о предсказании и нацеленном синтезе желаемых структур.
На гликановый профиль могут влиять рН, DO, pCO2, концентрация и
соотношения сахаров, специфические добавки к средам и накопление побочных
продуктов. Как правило, эти переменные влияют на биосинтетический механизм
внутри клеток, вызывая изменения активности гликозилирующих ферментов или доступность критических метаболических предшественников. Было показано, что компоненты среды клеточной культуры являются основными параметрами,
ответственными за модуляцию профилей гликозилирования рекомбинантных белков.
Иммуноглобулины
Иммуноглобулины — одна из самых больших фракций белков крови, напрямую
связанная с иммунитетом. Углеводная часть иммуноглобулинов G влияет как на их
стабильность, так и на биологические функции. Так через вариабельный Fab-фрагмент антитела идет специфическое распознавание патогенного участка антигена, а взаимодействие иммунных клеток с Fc-фрагментом сигнализирует иммунной системе о дальнейших действиях. Оба эти фрагмента несут углеводные модификации, и это влияет на особенности иммунного ответа.
Цикл клеточного роста
эукариотических клеток
Фаза G1 (фаза роста 1) — клетки
индуцируют рост, сначала вырабатывая РНК и белки, а содержание ДНК не меняется.
S-фаза (фаза синтеза) — синтез ДНК
протекает с репликацией ДНК, клетки имеют
переменное количество ДНК.
Фаза G2 (фаза роста 2) — клетки завершают синтез ДНК и продолжают расти, готовяться к митозу, сохраняя при этом количество ДНК, вдвое превышающее исходное.
М-фаза (митоз) — деление ядра и цитоплазмы с образованием двух дочерних
клеток.
Фазы роста клеток
С точки зрения процесса культивирование рост клеток можно разделить на стадии:
1. латентная фаза (лаг-фаза)
2. фаза экспоненциального роста (лог-фаза).
3. стационарная фаза
4. фаза гибели
- В ходе латентной фазы культура приспосабливается к новой среде, прежде
чем начнется пролиферация. Слишком низкая начальная концентрация биомассы
может удлинить латентную фазу, особенно в случае бессывороточного культивирования. - Затем культивирование переходит в фазу экспоненциального роста. Она
характеризуется ростом с высокими скоростями и с высоким потреблением глюкозы и аминокислот, что приводит к накоплению лактата и аммония. Эта фаза может иметь различную продолжительность в зависимости от клеток и условий роста. Может быть довольно короткой в случае клеточных культур животного происхождения, тогда как микробные культуры могут расти экспоненциально в течение длительного периода, если нет ограничений, выраженных, например, в наличии питательных веществ или
кислорода. Параметры биореактора также влияют продолжительность
экспоненциальной фазы роста, что важно учитывать в производстве. Характерной чертой фазы роста является низкая продукция mAb. Переход от фазы роста к
стационарной фазе определяет максимальную плотность жизнеспособных клеток (VCD), тогда как переход от стационарной фазы к фазе гибели определяет долговечность культуры.
Лучшее понимание основных механизмов, вызывающих эти переходы, может
быть использовано для разработки процессов культивирования, в которых клетки растут до более высоких плотностей или остаются жизнеспособными в течение более длительного периода времени, что и то, и другое приведет к увеличению объемной продуктивности моноклональных антител. На этапе масштабирования нужно
обеспечить генетическую и фенотипическую стабильность и высокую жизнеспособность, для этого поддерживают клетки на экспоненциальной фазе роста. - После этого наступает период уменьшения скорости роста, когда новые
клетки образуются параллельно с гибелью старых, увеличения количества клеток
практически не происходит, но клетки еще нуждаются в источниках энергии для
поддержания своей жизнедеятельности и синтеза белков.
Стационарная фаза характеризуется сравнительно низким потреблением
источников углерода и азота и сниженной гликолитической активностью. Напротив,
потоки цикла ТСА увеличиваются во время этой фазы, при этом уже потребление
лактата из внеклеточной среды во многом обеспечивает пул ацетил-КоА. Было
показано, что высокая активность TCA и пентозофосфатного пути связана с пиковой
выработкой моноклональных антител. Именно поэтому стационарная фаза
наиболее интересная с точки зрения синтеза рекомбинантных белков. Параметры
биореактора также влияют продолжительность стационарной фазы роста. - Последняя фаза является фазой гибели. К гибели клеток приводит ряд факторов, важнейшим из которых является исчерпание
запасов энергии в клетке и накопление токсический продуктов метаболизма. Наблюдается резкое экспоненциальное уменьшение числа жизнеспособных клеток.
В процессе биопроизводства важной целью является поддержание культуры в состоянии максимальной продуктивности с высокой
жизнеспособности клеток, высокой пиковой плотностью. В случае образования продукта значительный прирост продуктивности может быть получен за счет удлинения стационарной фазы. Однако при
проектировании процесса культивирования всегда следует учитывать его последствия для процесса выделения целевого продукта. Очень поздний сбор может привести к проблемам в процессе выделения целевого продукта и/или ухудшить качество продукта.
Гибель клеток
Гибель клеток уменьшает общий выход продукта и усложняет этапы очистки.
Клеточная гибель бывает двух типов: непредсказуемая и запрограммированная.
Наиболее часто клетки погибает посредством некроза и апоптоза.
Цель биопроизводства состоит в ингибировании, замедлении наступления
гибели клеток, и поддержании высокой жизнеспособности клеточных линий (обычно
выше 90-95%) в течение продолжительного времени для максимального увеличения
продуктивности, а также облегчения очистки в процессе выделения целевого продукта, так как культура клеток с высокой жизнеспособностью образует гораздо
меньше клеточного дебриса, что упрощает процесс очистки.
Некроз
Некроз является внезапной гибелью, вызываемой неблагоприятными условиями,
которые наносят физическое повреждение клетке (экстремальных скачки значений
рН температуры, давления).
Омертвевшая клетка теряет способность поддерживать осмотическое давление в
клеточной мембране, что приводит к разбуханию клетки с последующей потерей
целостности мембраны.
Апоптоз
Апоптоз является запрограммированной, генетически регулируемой гибелью. Примерами явлений, которые могут вызвать
апоптоз, являются нехватка питательных веществ, нехватка кислорода, аккумулирование токсичных метаболитов.
Апоптические клетки обычно можно
наблюдать на последних стадиях
периодического культивирования.
При апоптозе происходит активация
каспаз, которые расщепляют ядерные белки, белки плазматической мембраны и
митохондриальные белки, что в итоге приводит к гибели клеток. Фрагменты белков, нуклеиновых кислот собираются в везикулы — апоптозные тельца. В живом
организме эти везикулы легко перевариваются фагоцитами и удаляются без воспалительной реакции. Однако при культивировании клеток в лабораторных и
производственных условиях фагоциты отсутствуют и апоптозные тельца остаются в
культуральной среде, пока не будут удалены в ходе процессов очистки при выделении
целевого продукта. Со временем везикулы могут перейти на вторую стадию апоптоза,
когда происходит нарушение целостности мембраны и происходит высвобождение
содержимого, которое может негативно сказываться на других, здоровых клетка.
Некроптоз
Некроптоз представляет собой запрограммированную высокоиммуногенную
гибель клеток, похожую на некроз с точки зрения морфологических признаков, но
клетки умирают контролируемым образом.
Выбор клеточной линии
Выбор подходящего хозяина для биологического синтеза химических
соединений или белков является решающим фактором в производстве. Микробные
культуры подходят для производства небольших молекул, таких как ферменты и
прочие небольшие пептиды. Производство больших и сложных белков, таких как
моноклональные антитела, затруднено из-за отсутствия у них механизма
гликозилирования. Клетки млекопитающих обладают рядом преимуществ, наиболее
важным из которых является их способность продуцировать белки со сложными
посттрансляционными модификациями (ПТМ), которые аналогичны тем,
которые продуцируются у человека. Это дает системам экспрессии клеток
млекопитающих преимущество, несмотря на их медленный рост и высокие требования
к среде.
Наиболее часто используемыми клеточными линиями млекопитающих являются
HEK (клетки эмбриональной почки человека) и CHO. Клетки CHO являются
предпочтительным выбором в фармацевтических исследованиях и разработках.
В истории производства моноклональных антител клетки CHO использовались в
лабораторных целях еще с 1919 года и были наиболее часто используемыми клетками
млекопитающих.
Клеточный банк
Одним из важных преимуществ использования серийно культивируемых клеток для биотехнологического производства является возможность иметь
охарактеризованный источник для каждой производственной серии, т.е. иметь банк
клеток. Также, к сожалению, клетки млекопитающих уязвимы к генетическим
вариациям, если их постоянно поддерживать путем серийного пассажа, этого можно
избежать путем криоконсервировации и хранения в клеточном банке в стабильном
состоянии при сверхнизких температурах до тех пор, пока они не потребуются.
Термин «банк клеток» относится к хранению клеток с определенным геномом для
продления их жизнеспособности, чистоты и генетической стабильности.
Производители могут создавать свои собственные банки клеток или получать их из внешних источников.
Различные типы банков клеток классифицируются в зависимости от их статуса. Обычно это исследовательский
банк клеток (ИБК), главный банк клеток (master cell bank, MCB, ГБК) и рабочий
банк (working cell bank, WCB, РБК).
Процесс начинается с ИБК — криоконсервированной моноклональной
клеточной линии, которая еще не полностью охарактеризована. Они служат ценным
ресурсом в ряде научных областей, включая биотехнологию и фармацевтическую
промышленность. Если эти клетки в ходе исследований будут сочтены пригодными
для использования, их можно будет использовать в качестве основы главного банка клеток.
Как правило, сначала создается ГБК, обычно непосредственно из исходного клона или из предварительного банка клеток, полученного из исходного клона.
Для инженерных продуктов клетки в ГБК уже
трансформированы. В некоторых случаях существует необходимость создания
отдельных банков клеток - для вектора экспрессии и клеток хозяина. Главный банк
клеток используется для получения всех рабочих банков клеток. Исходной точкой для
оценки возраста клеток в процессе производства служит момент оттаивания
криопробирок с ГБК.
По мере необходимости из главного банка отбирают очередную пробирку,
размораживают, культивируют находящиеся там клетки и получают рабочий банк -
также сотни пробирок, которые хранятся в другом месте и являются основой для
производства. Полученную культуру после взятия из места хранения в главный банк
клеток не возвращается. Именно РБК, как правило, используется непосредственно для
нужд производственного процесса, храниться, как правило, в резервуаре с жидким азотом при температуре –70 °C или ниже.
Свежеприготовленный РБК должен быть соответствующим образом квалифицирован путем установления его характеристик и проведения испытаний.
Допускается использование одноуровневого банка, состоящего только из ГБК и не содержащего РБК, например, если для производства препарата каждый год
требуется относительно небольшое число контейнеров с клетками.
ГБК и РБК могут отличаться друг от друга по ряду параметров, например, компонентами культуральной среды и условиями культивирования. Кроме того, условия культивирования, используемые при приготовлении ГБК и РБК, могут отличаться от используемых в процессе производства. Если изменения процесса культивирования клеток не оказывают неблагоприятного воздействия на качество препарата, повторное клонирование клеток или повторное создание ГБК или РБК не
требуется. Необходимо убедиться, что охарактеризованный банк обеспечивает
получение продукта постоянного качества.
Также в отдельную категорию можно отнести послепроизводственные клетки
(ПК) - клетки, культивированные до 10 или более удвоений популяции свыше
максимального уровня удвоения, используемого для производства (производство однократного сбора продукта), или клетки, культивированные в период, который превышает используемую продолжительность культивирования на одну треть (производство многократного сбора продукта. В связи с этим создается
послепроизводственный банк клеток (ПБК).
Клетки различных уровней, особенно ГБК, необходимо исследовать на наличие
посторонних агентов (вирусных, бактериальных, грибковых, микоплазменных, а также клеток других клеточных линий). Особое внимание следует обращать на вирусы, которые часто контаминируют те виды животных, от которых получена линия клеток.
Для каждого ГБК производители должны проводить испытания клеточного
субстрата на подлинность и чистоту однократно, а также однократное испытание
стабильности в ходе культивирования клеток для каждого подлежащего регистрации
лекарственного препарата. Кроме того, испытания на чистоту и подлинность, следует проводить однократно для каждого РБК.
ГБК и РБК также обязательно тестируются на генетическую стабильность в
течение определенного количества поколений клеток, чтобы обеспечить нужные
параметры клеточной линии при производстве. Для этого клетки выращивают в культуральной среде, периодически пересевая и секвенируя кДНК целевого гена.
Контаминация
Последствия контаминации
- Получение продукта неизвестного качества;
- Потеря клеточного материала или продукта целиком;
- Невоспроизводимые или неверные данные экспериментов;
- Потеря времени и денег;
Визуально исследуйте среду на наличие макроскопических признаков микробной контаминации. К ним относятся необычные сдвиги рН, DO, помутнение или наличие частиц, нехарактерного запаха. С помощью микроскопа проверьте среду на наличие признаков микробного загрязнения, а также морфологию клеток.
Виды контаминации
Микоплазмы
Грибы
Дрожжи
Вирусы
Бактерии
Микоплазмы
Особенности:
1. Не имеют клеточной стенки.
2. Размеры от 0.15 до 1.5 мкм.
3. Из-за малого размера обнаружение в растворах затруднено.
4. Микоплазмы не вызывают помутнения питательной среды.
5. Проходят через обычные фильтры диаметром 0.22 благодаря
строению плазматических мембран и малыми размерами.
6. Не изменяют pH среды.
7. Микоплазмы растут в основном в связи с мембранами клеток млекопитающих.
8. Могут сосуществовать с клетками эукариот, не снижая их жизнеспособность.
9. Могут вызывать изменения характеристик роста клеток, ингибировать метаболизма, нарушать синтез нуклеиновых кислот, а также могут изменять скорость трансфекции и восприимчивость к вирусам.
10. Устойчивы к широкому спектру применяемых антибиотиков.
Наиболее вероятным источником микоплазменной контаминации на предприятии является зараженная клеточная культура, что подчеркивает
необходимость тщательного скрининга всех новых клеточных линий и соответствующих протоколов карантина и хранения всех поступающих клеточных культур. Микоплазмы и другие микробы распространяются аэрозольно-капельным
путем при выполнении обычных процедур культивирования клеток, включая
пипетирование и дозирование жидкостей среды.
Микоплазмы крадут необходимые питательные вещества и вызывают различные формы повреждения клеток, что, в свою очередь, может привести к значительным ошибкам в результатах лабораторных исследований. Считается, что в настоящее время большое количество клеточных линий заражено микоплазмой. Основная проблема заключается в том, что, несмотря на сильное микробное загрязнение
(обычно 10 в 7 степени – 10 в 8 степени клеток/мл) клеточные культуры часто выглядят нормальными как при макроскопическом, так и при микроскопическом осмотре. Микоплазму обычно выявляют методом флуоресцентного окрашивания ДНК.
Грибы
Особенности:
1. Образуют споры.
2. Некоторые формы продуцируют микотоксины, оказывающие токсическое воздействия на клетки млекопитающих.
3. Грибы образуют тонкий нитевидный мицелий, а иногда и более плотные скопления спор. Их легко наблюдать под микроскопом с малым увеличением, на поздних стадиях можно увидеть без увеличения.
4. Время удвоения гораздо выше бактериального
5. На ранних стадиях заражения грибы обычно не вызывают изменений pH среды.
К грибам относятся дрожжи
Дрожжи
Группа одноклеточных грибов, утративших мицелиальное строение в связи с переходом к обитанию в жидких и полужидких, богатых органическими веществами субстратах.
Особенности:
1. Типичные размеры дрожжевых клеток составляют 3—7 мкм в диаметре, некоторые виды способны вырастать до 40 мкм.
2. В аэробных условиях круг усваиваемых субстратов широк: углеводы, а также жиры, углеводороды, ароматические и одноуглеродные соединения, спирты, органические кислоты.
3. На ранних стадиях заражения дрожжи обычно не вызывают изменений pH в среде, но по мере их увеличения среда для становится мутной, а pH может стать более кислым.
Дрожжи под микроскопом будут выглядеть как округлые или почкующиеся частицы
Вирусы
Особенности:
1. Это неклеточные инфекционные агенты, которые могут воспроизводиться только внутри живых клеток. Вирусы поражают все
типы организмов, от растений и животных до бактерий и архей.
2. Размеры большинства исследованных вирусов составляют 200–300 нм, из-за чего не видны под обычным микроскопом.
3. Часто не оказывают заметное влияние на клеточный рост, однако некоторые инфекции могут быстро убить культуру.
4. Полное отсутствие основного и энергетического обмена и отсутствием аппарата трансляции (синтеза белка).
Такая контаминация может быть результатом загрязнения исходных клеточных линий или случайной контаминации вирусом в процесса производства и может иметь серьезные клинические последствия.
Разработано 3 основных взаимодополняющих подхода к контролю
потенциальной вирусной контаминации биотехнологических продуктов:
1. отбор и испытание исходной клеточных линий и другого сырья, включая компоненты среды, на отсутствие контаминации вирусами.
2. испытания продукта на соответствующих этапах процесса производства на отсутствие контаминации инфекционными вирусами.
3. удаление и инактивация вирусов на более поздних этапах производства;
По сравнению с другими инфекциями вирусные контаминанты в культурах
клеток представляют более серьезную угрозу из-за сложности их обнаружения и
отсутствия методов лечения пораженных культур клеток. Более того, вирусы обладают способностью интегрировать свой геном в клетку-хозяина, что приводит к постоянному производству новых вирусных частиц. Это потенциальный риск для здоровья операторов и может стать источником горизонтальной передачи вируса в другие клеточные линии.
К сожалению, общие тесты для системной оценки вирусных контаминантов довольно сложны и ненаправлены. Первым признаком проблемы может быть снижение количества жизнеспособных клеток или снижение производства. Методы массового параллельного секвенирования позволяют обнаруживать даже неизвестные вирусы на очень низких уровнях, что позволяет далее применить более специфичные методы ПЦР. Электронная микроскопия позволяет получать изображения с высоким
разрешением, обеспечивая тем самым немедленный обзор фактического статуса
клеточной инфекции и формы вирусов. Наблюдаемая морфология и размер позволяют провести немедленную предварительную классификацию вирусного типа.
Общая структура ретровируса.
Ретровирус представляет собой частицу с
оболочкой диаметром около 100 нм, которая состоит из гликопротеина, инкапсулированного липидами, полученными из плазматической мембраны клеток-хозяев во время процесса
почкования. Геном ретровируса состоит из двух идентичных одноцепочечных молекул
РНК. Группоспецифические антигены (gag) являются основными компонентами вирусного капсида, а обратная транскриптаза (pol) необходима для синтеза вирусной ДНК.
Вирусная фильтрация и инактивация
Очистка полупродукта от вирусов осуществляется с помощью удерживающей
вирус фильтрации, инактивация оболочечных вирусов с помощью низкого pH и/или обработки детергентом, а также с помощью стадий хроматографии. Один этап
очистки обычно не считается надежным в отношении удаления широкого спектра
различных вирусов.
Существует несколько методов инактивация вирусов. Наиболее распространенные из них:
- методы с применением низкого уровня pH. Особенно часто применяются к
моноклональным антителам (mAbs)
- методы с применением растворителя или ПАВ. Они обычно используются
для полисахаридов.
Реже используются такие методы инактивации вирусов, как пастеризация,
применение парообразного теплоносителя и прочее.
Метод вирусной инактивации с применением низкого pH
В данном методе на процесс инактивации влияют такие характеристики, как pH,
длительность воздействия, температура, содержание белка и растворителя или буфера.
Необратимая денатурация и эффективное уничтожение многих вирусов возможны при
pH не выше 5,0–5,5. Однако для эффективной инактивации ряда вирусов необходим уровень pH в диапазоне 3,5–4. Стоит учитывать, что при длительном воздействии pH в этом диапазоне также может произойти инактивация или повреждение продукта, в частности белков или ферментов. По сравнению с другими белками иммуноглобулины (включая моноклональные антитела IgG и IgM) обычно менее восприимчивы к pH 3,5–
5,5. Инфекционная вирусная нагрузка снижается до эффективного минимума при
выдерживании в условиях инактивации в течение достаточно длительного времени.
Обработка растворителем/ПАВ для инактивации вирусов
Методы с растворителем или ПАВ чаще всего используются для инактивации
вирусов в оболочке. Применяемые реагенты оказывают незначительное влияние на
лабильность терапевтических белков или антител, тогда как некоторые методы с
применением низкого pH могут вызывать их денатурацию или изменение структуры.
При использовании методов инактивации с растворителем/ПАВ необходимо учесть,
что все добавленные растворители должны быть удалены из будущего лекарственного
вещества, что не требуется для методов с низким pH.
Однако частицы вирусов необходимо будет удалить физическим способом.
Физическая фильтрация вируса с помощью нанофильтров является одним из наиболее
эффективных методов, которая удаляет как вирусы с оболочкой, так и вирусы без
оболочки.
Бактерии
Особенности:
1. Одноклеточные микроскопические организмы. Типичные размеры бактериальных клеток в среднем составляют 0,5—5 мкм.
2. Могут образовывать споры.
3. В большинстве случаев бактериальная контаминация происходит в течение 12–24 часов и, как правило, заметна невооруженным глазом.
4. Обычно приводят к резкому снижению pH и DO. Типичная клеточная культура животного происхождения со средней концентрацией биомассы может поглотить весь имеющийся кислород в течение часа, если не добавлять новый, бактериальные культуры могут потребить его в течение
нескольких секунд, что может служить индикатором контаминации.
Резкое падение значений DO и pH наблюдается, когда бактериальная
нагрузка превышает возможности управления процессом биореактора.
- Пример резкого падение DO примерно через 3 часа после контаминации 2л биореактора. Несмотря на максимальный поток кислорода DO не увеличивается.
Пространство между клетками млекопитающих под микроскопом будет
выглядеть зернистым и может мерцать от движения бактерий. Кроме того, зараженная культура может помутнеть и на поверхности ростового сосуда может образоваться небольшая пленка, которая рассеивается при перемещении сосуда.
Для предотвращения перекрестного загрязнения культур не следует использовать одни и те же бутыли со средой и реагентами при работе с различными
культурами клеток, в БББ не стоит одновременно работать с несколькими клеточными линиями. Кроме того, пипетки, имевшие контакт с флаконами и колбами, не следует повторно использовать для отбора среды из соответствующих емкостей.
Стерилизация
Стерилизация - совокупность физических и химических способов полного освобождения объектов внешней среды от вегетативных и покоящихся (споровых) форм микроорганизмов.
Асептика может включать влажную уборку помещений, обработку их ультрафиолетовыми лучами, антисептическими средствами, использование стерильных инструментов, сред, технологической одежды, подачу стерильного воздуха и пр. Следовательно, комплекс мер, обеспечивающих асептику
биотехнологических процессов, включает: механическую, физическую и химическую
защиту биообъекта и среды его обитания, а при необходимости – и конечный продукт.
К механической защите относятся: удаление механических примесей, например, из
воздуха, культиваторов, герметизация оборудования, изоляция узлов и соединений; к физической – обработка воздуха и поверхностей приборов и аппаратов ультрафиолетовым светом, кипячение, стерилизация паром под давлением, обработка ультразауком; к химической – обработка поверхностей химическими антисептиками.
Химическая стерилизация
Химическая дезинфекция обычно является предпочтительным методом
обеззараживания поверхностей и мебели. Аэрозоли перекиси водорода, диоксида
хлора, глутаральдегида, параформальдегида, оксида этилена и надуксусной кислоты используются в некоторых лабораториях для обеззараживания боксов биобезопасности или инкубаторов.
- Спирт является одним из наиболее широко используемых дезинфицирующих средств.
- Они бактерицидны и фунгицидны, но не спороцидны; некоторые оболочечные вирусы также уничтожаются.
- Бактерицидная сила спирта прогрессивно возрастает с увеличением молекулярной массы спирта.
- Этиловый спирт в концентрации от 50 до 90% эффективен против вегетативных или неспорообразующих клеток.
- Метиловый спирт менее бактерициден по сравнению с этиловым спиртом, кроме того, он очень ядовит. Высшие спирты — пропиловый, бутиловый, амиловый и др. — более бактерицидны, чем этиловый спирт.
Механизм действия спиртов
- Спирты проявляют свою противомикробную активность, денатурируя
белки микробных клеток.
- Спирты также являются растворителями липидов и, следовательно, могут повреждать липидные комплексы в клеточной мембране.
- Они также действуют как обезвоживающий агент.
Физическая стерилизация
- Автоклавирование
Самый надежный способ стерилизации - автоклавирование. Стерилизующее
действие автоклава обусловлено контактом насыщенного пара под давлением с более
холодными объектами, что приводит к конденсации пара в воду и сопровождается
выделением тепла, повышающего температуру стерилизуемого объекта. Но жидкость при этом не начинает кипеть. В зависимости от стерилизуемых материалов
температура насыщенного пара устанавливается от 110° до 138°С, давление от 0,4 до 2,5 атмосфер, экспозиция от 30 до 60 минут. Простые питательные среды,
физиологический раствор, дистиллированную воду, стеклянную посуду, одежду стерилизуют при режиме 1 атмосфера (121°С) 15- 30 минут. Чувствительные температуре материалы, а также сахара, витамины, аминокислоты и некоторые другие соединения стерилизуют при более низком давлении (0,4-0,5 атм.). - Стерилизация растворов фильтрованием
Стерилизация веществ, не подлежащие автоклавированию, к которым относятся
растворы белков, витаминов, сахаров и некоторых других, осуществляется через
стерилизующие фильтры с размером пор 0,22 мкм (или менее). Эти фильтры
задерживают бактерии, грибы, но не все вирусы и микоплазмы.
Выделяют: - глубинные фильтры.
- мембранные фильтры.
Глубинные фильтры состоят из относительно толстого фильтрующего материала и обычно имеют номинальный размер пор >1 мкм. Благодаря объему они улавливают большое количество частиц внутри своей пористой структуры. Мембранные фильтры обычно состоят из полимеров, прошедших химическую обработку, в результате чего образуются высокопористые тонкие пленки с микроскопическими порами. Мембранные фильтры обычно имеют абсолютный размер пор <1 мкм.
Характеристика мембранного фильтра
- Химическая совместимость: Материал фильтра должен быть совместим с
химической природой фильтруемых жидкостей и растворенных веществ, чтобы
избежать структурных повреждений.
- Смачиваемость: Гидрофильные мембраны легко смачиваются водой и предпочтительны для фильтрации водных растворов. Гидрофобные мембраны
рекомендуются для фильтрации газов и вентиляции.
- Размер пор:
o 0,1 мкм: удаление микоплазмы
o 0,20–0,22 мкм: удаление бактерий и спор
o 0,45 мкм: осветление водных растворов и органических растворителей.
o 0,8 мкм: удаление крупных частиц.
Гидрофобные и гидрофильные фильтры
Одним из наиболее важных факторов, которые следует учитывать, является
смачиваемость мембраны. Тест на смачиваемость — это процедура, используемая для демонстрации того, является ли мембрана гидрофильной или гидрофобной. При контакте с поверхностью капля жидкости растекается по поверхности или остается сферической. Угол между жидкостью и поверхностью – контактный угол.
Контактный угол <90° указывает на то, что поверхность гидрофильна, а угол >90°
указывает на то, что поверхность гидрофобна.
1) Гидрофобные мембранные фильтры
Когда гидрофобная мембрана вступает в контакт с водой, поверхностное натяжение вытесняет воду из пор и мембрана становится барьером для потока воды. Из-за своей способности отталкивать воду и противостоять смачиванию водой
гидрофобные мембранные фильтры обычно используются в качестве вентиляционных
фильтров, для газоотвода.
2) Гидрофильные мембранные фильтры
После смачивания гидрофильная мембрана не пропускает воздух или другие газы в больших количествах, если только они не применяются под давлением. Они
включают осветление образцов, стерилизация.
Материал мембраны
Мембраны из поливинилидендифторида
(PVDF). Обладают очень низким связыванием с белками, широкую химическую совместимость и
наоборот. Подходит для фильтрации биологических растворов.
Мембраны из полиэфирсульфона (PES). Устойчивы к кислотным и щелочным растворам. Обычно используются в качестве альтернативы целлюлозным мембранам и обеспечивают быстрый поток, высокую фильтрующую способность и низкое связывание белков, оставаясь при этом бактерицидными. Подходит для
фильтрации биологических растворов.
Мембраны из нейлона и полиамида. Нейлоновая фильтрующая мембрана имеет внутреннюю опору из инертного полиэстера, что придает ей дополнительную прочность и стабильность. Используются для фильтрации водных и органических растворов для использования в ВЭЖХ и других аналитических методах. Могут иметь высокую степень связывания с белками и малыми молекулами и не рекомендуются для стерилизации биологических образцов.
Мембраны из политетрафторэтилена
(PTFE). Обладают высокой прочностью и широкой химической совместимостью и обычно используются для очистки водных растворов, органических растворителей и агрессивных жидкостей. Гидрофобные
мембраны из PTFE используются для фильтрации газов (задерживают частицы до 0,1 микрона).
Мембраны из ацетата целлюлозы (CA).
Гидрофильная мембрана с низким уровнем
связывания. Подходят для фильтрации биологических жидкостей, имеют очень низкую степень связывания с белками.
Мембраны из смешанных эфиров целлюлозы (MCE). Не имеют отдельного опорного слоя, хрупки. Мембраны MCE демонстрируют большее связывание с белками, чем мембраны CA. Однако мембраны MCE имеют тенденцию иметь более однородную пористую структуру и более высокую скорость потока фильтрации.
Для фильтрации питательных сред, подпиток чаще используют мембранные фильтры
CA и PES, для фильтрация газов и вентиляции - мембранный фильтр из PTFE.
Стерилизация УФ облучением
Ультрафиолетовый компонент солнечного света является главной причиной
гибели микробов в наружном воздухе. Смертность микроорганизмов на открытом
воздухе достигает 90–99 %, но зависит от вида микроорганизма. Споры и некоторые
виды бактерий окружающей среды имеют стойкость к воздействию солнечного света
и могут переносить длительное облучение светом без особого вреда своему организму.
Искусственные источники ультрафиолетового излучения (УФИ) используют гораздо более сконцентрированные лучи, оказывая на микроорганизмы как летальное, так и
мутагенное воздействие.
Биофизическое действие УФ излучения на генетический или функциональный
аппарат бактерий выглядит следующим образом: излучение вызывает
деструктивномодифицирующее повреждение ДНК, нарушает клеточное дыхание и синтез ДНК, что приводит к прекращению размножения и лизису микробных клеток.
Сила проникновения ультрафиолетовых лучей невелика, тонкий слой стекла
достаточен для того, чтобы не пропустить их. Если микроорганизмы и частицы пыли
расположены в один слой, при многослойном расположении верхние защищают нижележащие, защитная оболочка вокруг бактерильной клетки препятствует достижению антимикробного действия.
Типы биореакторов
Существует две основные конструкции биореакторов:
- с мешком на качающейся
платформы
- с мешком или стеклянным корпусом со встроенной магнитной мешалкой.
Первым одноразовым биореактором является волновой биореактор.
Используемое в нем качающееся движение усиливает массоперенос на границе раздела
воздух-жидкость и обеспечивает перемешивание.
Другим распространенным биореактором является биореактора с мешалкой.
Лабораторные реактора имеют высокую степень управляемости параметрами процесса, имитируя среду крупномасштабного биореактора. Пробирки, микротитровальные планшеты и встряхиваемые колбы, широко используемые при разработке процессов, лишены этой важной характеристики.
Несмотря на многообразие конструкций биореакторов, все они должны обеспечить максимально гомогенную среду и удовлетворить потребности клеток в
питании для достижения надежного и максимального роста и продуктивности клеток в стерильных условиях. Поэтому биореакторы должны иметь:
- подвод к каждой клетке в достаточном количестве всех питательных веществ;
- отвод от клеток продуктов метаболизма (как минимум газов);
- поддержание оптимальных рабочих параметров: аэрирования, перемешивания, ph, температуры в каждой точке;
- высокий уровень автоматизации процесса культивирования, техники безопасности и условий труда операторов.
Для выполнения этих требований каждый реактор должен быть снабжен
следующими системами:
- подачи жидкостных потоков в аппарат;
- ввода и вывода газовых потоков;
- аэрирования среды;
- перемешивания;
- возможностью пеногашения;
- термостатирования;
- вывода жидкости из аппарата (как минимум для отбора проб);
- системой контроля и регулирования параметров процесса.
Типы процессов
Режимы работы биореактора.
(A) Периодический - питательные вещества подаются только в начале процесса. После этого последующая подача не производится, а рабочий объем остается постоянным;
(B) Повторяющаяся партия – в этом
полупрерывистом режиме после начальной фазы часть среды циклически пополняется свежей средой без сбора клеток, а рабочий объем, остается постоянным;
(C) Партия с подпиткой – во время культивирования клетки снабжаются свежими питательными веществами;
(D) Перфузия – к культуре непрерывно добавляют свежую среду, а отработанную среду непрерывно удаляют с той же скоростью потока.
Биопроцесс без подпиток (Периодический) (Batch processes)
При периодическом процессе все питательные вещества подаются в начале
выращивания, без добавления их в последующем биопроцессе. В течение всего
биопроцесса не добавляются никакие дополнительные питательные вещества – только контролируются такие параметры, как газы, pH (добавлением кислоты/СО2 и
основания), то есть это закрытая система. Биопроцесс длится до тех пор, пока
питательные вещества не будут израсходованы. Обычно запускаются при
максимальном рабочем объеме. В течение всего времени работы биореактора
питательные вещества постепенно истощаются, а токсичные побочные продукты накапливаются внутри сосуда.
В определенный момент рост клеток прекращается, а доля жизнеспособных
клеток снижается, поскольку питательные вещества расходуются, а токсичные
метаболиты накапливаются. Эта стратегия подходит для быстрых экспериментов,
таких как характеристика штаммов или оптимизация питательной среды.
Продолжительность серийного процесса может составлять около 7 дней.
В начальной лаг-фазе количество живых клеток увеличивается лишь медленно, что приводит к умеренному, но устойчивому поглощению источника углерода. Потребление кислорода увеличивается во время фазы экспоненциального роста, пока не превысит возможное поступление кислорода. Как только источник углерода истощается, начинается стационарная фаза, за которой следует фаза отмирания, во время которой количество живых клеток резко уменьшается.
Преимущества периодической культуры:
- Короткая продолжительность
- Меньше шансов загрязнения, поскольку питательные вещества не добавляются.
- Легче управлять
Недостатки включают в себя:
- Низкий выход продукта
- Низкая концентрация клеток
Биопроцесс с подпиткой (Fed-batch)
Культура с подпиткой представляет собой модифицированную версию культуры периодического действия. В этом случае в культуру подаются питательные
вещества для поддержания их постоянной концентрации. При добавлении свежих
веществ и разбавлении токсичных побочных продуктов клетки дольше сохраняют
жизнеспособность и процесс может работать в течение 2–3 недель.
Стратегии кормления по принципу Fed-batch предполагают хорошее понимание
клеточного метаболизма и скорости окисления клетками питательных веществ.
Можно поддерживать высокие концентрации субстратов, что приводит к увеличению
плотности клеток, однако со временем происходит накопление токсичных
метаболитов, которые начинают подавлять рост и продуктивность клеток.
Биореактор инокулируется при меньшем рабочем объеме, который часто
является минимальным рабочим объемом сосуда. Клетки культивируются без
подпитки в течение короткого времени, пока не будут достигнуты определенные
критерии, позволяющие начать подачу подпиток. Обычно субстрат перекачивают из
флакона или мешка в культуральный сосуд через силиконовую трубку. Оператор
может либо вручную установить подачу в любое время, либо добавлять питательные
вещества при соблюдении определенных условий, например, при достижении
определенной концентрации биомассы или при исчерпании питательных веществ.
Как правило, подпитка начинается в экспоненциальной фазе, чтобы
предотвратить исчерпание источника углерода и других необходимых веществ.
Дополнительно может вноситься добавка глюкоза, когда ее концентрация в среде
низкая. Расчеты по добавлению подпиток основаны на конечном или максимальном
рабочем объеме. Обычно в биореактор периодического действия ежедневно или через день подается от 3 до 5 % от общего рабочего объема емкости.
Организмы остаются в длительной экспоненциальной фазе (толстая серая линия и пунктирная серая линия). Это также означает, что количество потребляемого кислорода увеличивается, поэтому количество растворенного кислорода в среде уменьшается (толстая синяя линия по сравнению с пунктирной синей линией).
Преимущества периодической культуры с подпиткой:
- Увеличивает выход продукта за счет повышения количества клеток и продления их жизнеспособности
- Может использоваться для управления экспрессией генов и активностью ферментов путем смены субстрата.
- Возможность использовать различные стратегии кормления для
достижения максимальной продуктивности
Недостатки:
- Накапливаются ингибирующие агенты и токсины
- Обеспечивает еще одну точку проникновения загрязнений.
- Может привести к высокой плотности мертвых клеток и клеточного мусора, с которыми трудно справиться на последующих этапах
Непрерывный процесс
В настоящее время наблюдается тенденция к переходу на непрерывные процессы, в котором свежая среда непрерывно добавляется к клеточной культуре, а продукт удаляется из нее. Такой подход лучше автоматизируется, дает более высокий титр продукта, кроме того, качество продукции может быть более равномерным, так как клетки постоянно находятся в одних и тех же условиях окружающей среды.
Три наиболее распространенных типа непрерывного процесса:
1. Хемостат: скорость добавления одного субстрата, ограничивающего рост, контролирует размножение клеток.
2. Турбидостат: косвенное измерение количества клеток (мутности или оптической плотности) контролирует добавление и удаление жидкости. Для этого требуется дополнительный датчик, но он осуществляется на основе обратной связи в реальном времени.
3. Перфузия: этот тип режима непрерывного производства основан либо на сохранении клеток в биореакторе, либо на рециркуляции клеток обратно в биореактор. Предоставляется свежая среда, и бесклеточный супернатант удаляется с той же скоростью.
В перфузионном процессе добавление свежей среды и удаление отработанной
среды с одинаковой скоростью позволяет поддерживать постоянный объем культуры в
биореакторе, поэтому максимальный рабочий объем сосуда не ограничивает
количество свежей среды, которое может быть добавлено в культуру на протяжении
всего цикла. Процесс перфузии может длиться три и более недель, в зависимости от максимального значения VCD, выбранного для ограничения скорости потребления
среды.
Для удержания клеток в биореакторе используется один из нескольких
подходов:
- Фильтрация. Фильтры, которые удерживают клетки и пропускают жидкость и небольшие молекулы. Самый простой вариант — спин-фильтр. Спиновые фильтры
относительно дешевы, но имеют некоторые ограничения, например склонность к засорению. Часто используются устройства фильтрации с тангенциальным потоком (TFF) и с переменным тангенциальным потоком
(ATF). В TFF жидкость проходит мимо
пор тангенциально, а не проталкивается
через них ортогонально, что снижает вероятность засорения.
Устройства ATF используют тот же принцип тангенциального потока, но меняют направление потока один раз в каждом цикле, чтобы минимизировать загрязнение и еще больше уменьшить силы сдвига. - Разделение акустических волн. Основано на образовании трехмерной стоячей волны в
жидкости. Клетки захватываются и
агрегируются в узлах волны. Затем
клеточную суспензию очищают по мере
оседания агрегатов. - Сосуд с насадочным слоем. Такой слой
представляет собой пористую сетку из
полиэстера и полипропилена, которая
обеспечивает поверхность роста для
прикрепившихся клеток и удерживает
взвешенные клетки. Иммобилизация клеток в матрице облегчает сбор бесклеточной среды из биореактора.
Как уже отмечалось, процессы периодического с подпиткой, непрерывного и
перфузионного действия требуют хорошего понимания метаболизма клеток, а также
разработанных систем регулирования. Непрерывные и перфузионные культуры
требуют меньшего объема культуры и позволят достичь высокого выхода продукта, но в большей степени подвержены контаминации и сбоям оборудования.
Регулирование параметров биореактора
Клеточный гомеостаз обеспечивается двумя основными механизмами:
- мембранными транспортными системами
- внутриклеточной системой синтеза белков-ферментов, определяющих жизнедеятельность клетки.
Конструкции биореакторов включают в себя инженерные решения для мониторинга и контроля условий культивирования, поскольку они влияют на производительность и качество процесса.
1. ПИД-регулятор
2. Стратегия контроля содержания кислорода
3.
ПИД-регулятор
Пропорционально-интегрально-дифференциальный (ПИД) регулятор жизненно важен для промышленных систем управления. Такие параметры как растворенный кислород (DO), pH, температура чувствительны к настройкам PID. Во многих биореакторах контуры управления расположены каскадно, поэтому переменные регулируются одновременно.
Это надежный механизм управления, который манипулирует входной
переменной на основе сигнала ошибки: разницы между целевым значением (заданным значением) (SP) и измеренным значением (PV). ПИД-регулятор минимизирует эту ошибку, регулируя переменную управления, например мощность, подаваемую на нагреватель, или скорость подачи газов. Постоянно проверяя выходной сигнал и соответствующим образом корректируя входной сигнал, система саморегулируется для поддержания желаемого выходного сигнала.
ПИД-контур включает в себя три параметра: пропорциональный, интегральный и производный. Контур ПИД изменяет свой выходной сигнал для достижения желаемой уставки с минимальной погрешностью и оптимальной скоростью, что делает его важным инструментом в различных инженерных и технологических приложениях.
- ПИД-алгоритм
Первый режим — пропорциональный (P). Выходной сигнал контроллера прямо
пропорционален текущему значению ошибки в режиме P. Пропорциональный компонент формирует основу ПИД-регулирования. Сигнал ошибки представляет собой разницу между желаемым заданным значением и текущим измерением переменной процесса.
Второй режим — это интегральный (I). Учитывает величину ошибки и продолжительность ее сохранения. Он предназначен для реагирования на
накопленные ошибки с течением времени, способствуя устранению остаточной
установившейся ошибки, которая возникает при использовании только P-контроллера.
Третий режим — это производный режим (D). Производная часть ПИД-регулятора связана со скоростью изменения ошибки. Он обеспечивает прогноз будущих ошибок на основе текущей скорости изменений и помогает сократить перерегулирование и время стабилизации.
- Автоматическая настройка ПИД-регулятора
Автоматическая настройка ПИД — это метод, целью которого является
автоматический поиск оптимальных параметров настройки ПИД-регулятора. Это
может быть предпочтительной альтернативой ручной настройке, которая зачастую отнимает много времени и требует большого опыта. Алгоритмы стремятся
минимизировать ошибку между заданным значением и переменной процесса.
Постоянно регулируя параметры, ПИД-регулятор адаптируется к изменениям в
процессе, которые могут быть непредсказуемыми и нелинейными. Автоматическая настройка учитывает эти изменения путем постоянной оптимизации параметров ПИД-регулятора, поддерживая качество управления даже в изменяющихся условиях эксплуатации.
Стратегия контроля содержания кислорода
Кислород служит конечным акцептором электронов при окислительном
фосфорилировании и его недостаток может привести к снижению роста клеток и
увеличению продукции лактата.
С другой стороны, избыточная концентрация кислорода приводит к нежелательному накоплению реактивных форм кислорода (ROS), которые могут вызывать изменения в митохондриальной дыхательной цепи и внутриклеточном редокс-балансе, что в итоге приводит к ингибированию роста клеток и снижению их удельной продуктивности. При разработке процесса культивирования клеток эта двойная природа кислорода может быть серьезной проблемой.
Кислород имеет низкую растворимость в жидкой фазе, это приводит к одной из
основных проблем в культивировании клеток млекопитающих — переносу
достаточного количества кислорода в среду. Первоначально потребность в кислороде
в культуре клеток невелика из-за низкой плотности клеток, со временем концентрация клеток увеличивается и, следовательно, увеличивается потребность в кислороде.
В определенный момент количество O2 в среде может стать лимитирующим фактором роста клеток. Концентрацию растворенного кислорода трудно измерить в культуре. Эта величина указывается в виде процентного содержания растворенного кислорода (DO).
Коэффициент массообмена KLa
Чтобы улучшить доступность растворенного кислорода, необходимо увеличить
скорость переноса кислорода. Это достигается за счет увеличения скорости
перемешивания, подачи газа, доли кислорода в газовой смеси и тд. Для регулирования этих параметров необходимы процессы управления, контроля. Эти процессы, известные как каскады, можно настроить индивидуально, чтобы адаптировать их к конкретному приложению.
Адекватное снабжение кислородом может быть достигнуто, если скорость переноса кислорода (OTR) больше или равна скорости поглощения кислорода (OUR).
KLa (объемный коэффициент массообмена) и OTR (скорость переноса кислорода)
определяют, насколько эффективно кислород переносится из газовых пузырьков в среду биореактора, т.е. сколько кислорода доступно для культивируемой культуры.
OTR=OUR
Показатель OUR может быть рассчитан как произведение концентрации
жизнеспособной биомассы cx и скорости поглощения кислорода клетками qO2.
OTR определяется величиной KLa и разницей между концентрацией кислорода
вводимого газа и концентрацией кислорода в среде.
Существуют различные химические, биологические и физические методы
измерения kLa в биореакторах. При методе статического газовыделения в биореакторе
устанавливают датчик DO. Концентрацию кислорода в среде доводят до нуля путем
вытеснения азотом. Затем датчик DO измеряет процесс насыщения кислородом и
может быть определен kLa.
Ключевые переменные, влияющие на значения kLa
Размер пузырька газа
Когда размер пузырьков газа уменьшается, площадь поверхности и время пребывания газа увеличиваются, в результате чего пузырьки остаются в культуре дольше. Увеличение времени пребывания кислорода улучшает kLa.
Смешивание
В биореакторе перемешивание используется для устранения градиентов
концентрации (газа, питательных веществ, щелочи, кислоты, температуры) и
предотвращения слипания клеток. Время смешивания широко используется для
характеристики эффективности смешивания в биореакторе. Эффективность смешивания является одним из наиболее важных факторов, влияющих как на производительность, так и на масштабирование биореактора.
Быстрое перемешивание важно для обеспечения своевременного
перемешивания вносимых компонентов, чтобы не образовывались локальные области с высоким/низким уровнем pH, питательных веществ, правильное время
перемешивания также обеспечивает адекватную доставку кислорода к клеткам. В
целом, время перемешивания менее 30 с в лабораторных масштабах (≤ 10 л) и менее 2
мин в производственных масштабах (≥ 100 л) считается желательным.
Время перемешивания, Tm, определяется как продолжительность времени,
необходимого для достижения 95% гомогенности в идеально перемешанном сосуде.
Для определения времени перемешивания в реакторе обычно используются два
метода: метод обесцвечивания и метод добавления трейсеров. Наиболее простыми
являются методы обесцвечивания. В реактор заливают воду и 5 мл/ л раствора
крахмала в концентрации 10 г/ л, а также 2 мл/л раствора йодида калия, в результате чего получали темно-синий объемный раствор. Процесс обесцвечивания начинался с быстрого добавления раствора тиосульфата натрия 24,8 г/л. Время перемешивания определялось как период между добавлением тиосульфата и полным обесцвечиванием раствора. В принципе также можно использовать любой краситель.
При использовании другого метода в среду добавляется трассирующий агент,
который отслеживает изменение концентрации до тех пор, пока она не станет
однородной и не стабилизируется. В качестве трейсера может использоваться кислота, основание или концентрация соли, которые способны уменьшить однородность
градиента температуры, pH, электропроводности и других свойств.
Значения kLa обычно увеличиваются по мере увеличения скорости, однако
скорость мешалки пропорциональна силам сдвига, которые могут привести к гибели
клеток. Если бактерии в целом достаточно устойчивы, то животные клетки более
чувствительны к гидромеханическим нагрузкам из-за их относительно большого
размера и отсутствия защитной клеточной стенки. Когда силы сдвига, действующие на
клетки, слишком велики, последствием является гибель клеток.
Скорость воздушного потока
Более высокая доступность кислорода приводит к увеличению kLa. Увеличение
подачи кислорода в биореактор обеспечивает эту доступность. Хотя высокие значения kLa желательны, важно учитывать фактические условия эксплуатации, влияние на жизнеспособность клеток и связанные с этим затраты на процесс. Также большая
скорость подача газов может привести к избыточному пенообразованию, что потребует внесения высокой концентрации пеногасителя.
Во время культивирования клеток мелкие пузырьки сталкиваются и сливаются, образуя более крупные пузырьки, уменьшая площадь поверхности (а) и, следовательно, kLa. Пеногасители используются для
воздействия на поверхностное натяжение, что приводит к уменьшению слияния пузырьков и пенообразования.
Однако этот принцип не всегда приводит к увеличению OTR, поскольку пеногаситель
также снижает подвижность пузырьков, что впоследствии снижает kLa.
Клетки прикрепляются к пузырькам газов, которые поднимаются и лопаются на
поверхности среды. Когда это происходит, возникает сильное гидродинамическое
напряжение и высокий уровень рассеяния энергии. Эти эффекты в совокупности могут
вызвать серьезные повреждения клеток.
Для уменьшения этого эффекта существует несколько подходов подачи
кислорода в культуру. Один из них - микробарботирование. Микропузырьки
представляют собой небольшие пузырьки диаметром менее 100 мкм, которые имеют
меньшую склонность к слиянию и разрыву, что приводит к снижению напряжения
сдвига, оказываемого на клетки. Кроме того, микропузырьки обладают высокой
массопереносной способностью, что приводит к снижению скорости подачи газа и
снижению склонности к пенообразованию.
Проходя через жидкую среду, пузырьки полностью растворяются в среде,
прежде чем достичь верхней газовой части биореактора.
Температура
Повышение температуры приводит к снижению растворимости кислорода, что
приводит к уменьшению движущей силы и снижению OTR. Однако скорость
диффузии кислорода увеличивается с повышением температуры, а вязкость жидкости и поверхностное натяжение уменьшаются.
Характеристики барботера
Значения kLa будут сильно различаться в зависимости от характеристик
барботера, включая количество, размер пор и площадь поверхности, поскольку эти
факторы влияют на размер пузырьков, скорость газа и расход
Барботёр – это устройство для пропускания через слой жидкости пузырьков газа.
Он нужен для насыщения жидкости кислородом или другими газами при интенсивном перемешивании. В биореакторе используются микропористые барботеры, т.к. на выходе при относительно невысокой степени аэрации они дают очень маленькие пузырьки, что обеспечивает хорошую растворимость газа в культуральной жидкости.
Тип перемешивания
Обеспечение гомогенной среды представляет собой реальную проблему в
крупномасштабном производстве. Тот факт, что клетки больше не встряхиваются, а
скорее перемешиваются, является серьезным изменением культивирования. Это резкое изменение в чувствительных клетках млекопитающих приводит к напряжению сдвига и проблемам пенообразования.
В реакторах большого объема требуется механизм для перемешивания среды,
чтобы обеспечить максимальный массоперенос и избежать агрегации клеток. В зависимости от способа перемешивания биореакторы подразделяют на три основные
группы:
1) Реакторы с механическим перемешиванием. Мешалки, разбивая крупные пузырьки воздуха, разносят их по всему реактору. Когда размер пузырьков газа уменьшается, площадь поверхности и время пребывания газа увеличиваются, в
результате чего пузырьки остаются в культуре дольше. Эффективность распределения воздуха зависит от типа мешалки, числа оборотов, физико-химических свойств среды.
При интенсивном перемешивании культуральной среды происходит ее вспенивание, поэтому рабочий объем биореактора не превышает 70% общего объема.
Вращение мешалки приводят к втягиванию культуры с краев и основания сосуда. Обычно скорость мешалки для клеточных культур намного ниже, чем для микробных культур. Размер клеток млекопитающих, а также отсутствие у них жесткой клеточной стенки делают чувствительность к силам сдвига критическим фактором их выживания. Среду в биореакторе можно спроектировать таким образом, чтобы минимизировать силы сдвига.
2) Барботажные колонны, через которые для перемешивания содержимого пропускают воздух. Барботажные колонны более экономичны, так как перемешивание
в них происходит восходящими потоками воздуха равномерно по всему объему. В
барботажных колоннах воздух подают под высоким давлением в нижнюю часть
биореактора. По мере подъема мелкие пузырьки воздуха объединяются, что влечет
неравномерное его распределение. Кроме того, подача воздуха под высоким
давлением приводит к сильному пенообразованию.
3) Эрлифтные реакторы с внутренней или внешней циркуляцией. В таком
биореакторе культуральная среда вместе с клетками непрерывно циркулирует в
реакторе.
Подача газов
Одной из наиболее важных функций биореакторов является непрерывное
снабжение клеток растворенным кислородом посредством процесса, называемого аэрацией. Аэрация в биореакторе обычно происходит, когда:
1. Кислород диффундирует через наложение к границе раздела со средой для культивирования клеток.
2. Кислород из барботеров растворяется в культуре клеток за счет перемешивания.
Аэрация свободного пространства над средой оказывается достаточной при
мелкомасштабном производстве, но при крупномасштабном производстве
предпочтительно применять барботирование. Подача газов через барботер создает устойчивый поток пузырьков, которые могут подниматься через среду и удерживать газ как можно дольше. Подача газа через барботер более эффективна, но может вызвать пенообразование в культурах с высоким содержанием белка в среде. Если
подавления пенообразования за счет подачи газа в свободное пространство над
головой недостаточно, можно добавить пеногаситель, о чем написано ниже.
Также необходимо учитывать, с какой скоростью добавляется газ. Культуры
клеток млекопитающих используют кислород и производят углекислый газ медленнее,
чем микробные клетки. Потребности в кислороде изменяются зависимости от стадии роста культуры.
Если необходим низкий уровень содержания растворенного кислорода, а
собственное потребление кислорода культурой недостаточно для надлежащего его понижения, то во входящий газ добавляется азот для удаления кислорода из культуральной среды. Такой подход иногда требуется на начальной стадии
культивирования в биореакторе, на поздних стадиях, при отсутствии отклонений,
подача азота не требуется.
Разбрызгивание газов также может приводить к гибели клеток: при разрыве
пузырьков они повреждают окружающие клетки. Для ограничения этого эффекта
необходимо оптимизировать размер пузырьков и скорость подачи. Для уменьшения влияния разрыва пузырьков и перемешивания мешалкой можно добавить
поверхностно-активное вещество, например плюроник F-68.
Оптимальная стратегия газового введения для культур клеток CHO включает
комбинацию подачу газов в свободном пространстве и барботер. Смесь воздух/N2 /O2 может автоматически регулироваться параметром pO2, при его наличии,
воздействующим на отдельные регуляторы массового расхода (MFC). CO2 обычно
добавляется в смесь в зависимости от значения pH. Дополнительный регулятор
массового расхода (MFC) для смешанного газа поддерживает постоянный общий
расход газа.
Образование пены
Свободное пространство над поверхностью раствора используется как буферное,
где накапливается пена. Наличие пены в культуре клеток не является плохим
признаком. Легкая пена переносится большинством клеточных линий, но плотная
пена может захватывать клетки и разрушать их путем взрыва пузырьков внутри пены.
Вспенивание может привести так же к переувлажнению фильтров, через которые
воздух выходит из биореактора, снизится скорость потока воздуха из-за свойств
гидрофобного фильтра, и тем самым повысится давления в системе.
Пена возникает в биопроцессах за счет введения газов в культуральную среду и
в дальнейшем стабилизируется белками, вырабатываемыми клетками. Чтобы
предотвратить образование пены, в биореакторах и больших встряхиваемых колбах
обычно используются механические пеноразрушители, ультразвук или, чаще всего, добавление химических пеногасителей.
Пеногасители обычно представляет собой вещество на масляной основе, которое
проникает в мицеллярные структуры разрушают ее, заставляя пену рассеиваться.
Слишком много пеногасителя может быть вредным для клеток. Так некоторые
пеногасители могут влиять на скорость роста как прокариотических так и эукариотических клеток, снижает DO и массовый коэффициент переноса кислорода
(kLa ) в системе.
Стратегия контроля рН
Оптимальный рН требуется для
нормальной работы большинства клеточных ферментов, внешний рН может изменять
внутренний рН телец Гольджи, который влияет на активность ключевых
гликозилирующих ферментов и как следствие изменяет гликановый профиль. Уровень pH поддерживается в естественном диапазоне с помощью подходящих буферов,
обычно это бикарбонатный буфер.
рН выражает степень активности ионов водорода (H+) или гидроксид-ионов
(ОН-) в пересчете на активность ионов водорода. рН определяется как обратный
логарифм активности ионов гидрония (рН = -log [Н3О+]) и измеряется по шкале 0-14.
Необходимое заданное значение рН для среды биореактора обычно находится в
диапазоне 6,4-7,4, а “мертвая зона” составляет ±0,05 – 0,2 рН. Оптимальное значение рН может варьироваться в зависимости от клеточной линии, желаемого продукта и других факторов. Для поддержания этого диапазона среды культивирования включают буферную систему.
Бикарбонатная буферная система (буферы на основе CO2 / бикарбоната
(НСО3)) чаще всего используется из-за ее сходства с естественной системой
поддержания рН организмов. Например, такая система присутствует в крови
млекопитающих для предотвращения пагубных изменений рН в результате колебаний содержания газов, питательных веществ и метаболитов. Бикарбонатная буферизация осуществляется за счет принципа Ле Шателье:
CO2 + H2O <—> H2CO3 <—> H+ + CO3-
В результате диссимиляционого метаболизма клетки выделяют CO2 и лактат в результате чего культуральная среда со временем будет становиться все более кислой. pH можно регулировать добавлением кислоты, CO2 (при
необходимости опустить значение
рН) или основания (при необходимости поднять значение рН). Добавление основания или кислоты требует хорошего
перемешивания, чтобы избежать
локальной высокой концентрации
основания.
Поддержание физиологического
рН в клетках осуществляется за счет активного транспорта протонов водорода. Протонный насос - интегральный
мембранный белок, осуществляющий перемещение протонов через плазматическую мембрану и мембраны внутриклеточных органелл.
При этом рН может поддерживаться на различных уровнях рCO2 при условии,
что количество NaHCO3 в составе среды соответствует потребностям конкретных
биопроцессов, то есть создана достаточная буферная емкость.
Контроль рН в биореакторе опять же зависит от стадии процесса. Для поддержания требуемого значения pH на ранних стадиях роста культуры подается СО2 для понижения рН. По мере уменьшения расхода СО2 до нуля возникает потребность в основании (гидрокарбонат натрия) для повышения рН, поскольку в процессе роста
культуры образуются большое количество кислых продуктов обмена.
Лактат интенсивно образуется в экспоненциальной фазе и накапливается в
биореакторе, приводит к образованию ионов H, что ведет к снижению рН среды. Этот
эффект уравновешивается буферной системой при условии достаточной буферной емкости. Если не нейтрализовать этот эффект, то накопление лактата станет
токсичным для культуры.
Если биопроцесс протекает нормально, то при переходе в стационарную фазу
клеточные культуры начинают потреблять лактат собственного производства в качестве дополнения или замены глюкозы в качестве источника углерода. Такой
лактатный сдвиг обычно рассматривается как желательное. Сдвиг метаболизма
предотвращает накопление лактата и одновременно снижает потребность в подаче глюкозы и соды. Это ключевое событие также связано с увеличением
продолжительности жизни культуры и титров конечного продукта.
Как говорилось в разделе, посвященному метаболизму клетки, лактатному сдвигу может способствовать культивирование при низком pH. В зависимости от типа клеток и клона нижний предел pH в клетках млекопитающих составлял 6,6–6,8.
Снижение этой границы влечет риск ингибирования пролиферации клеток и синтеза белков.
Роль СО2
Поступление, а также удаление газообразных продуктов является необходимым условием успешного культивирования. Клетки используют глюкозу и кислород, преобразуя их в углекислый газ и воду.
Растворенный CO2 влияет на другие параметры, помимо pH. Он оказывает
воздействие на различные метаболические пути, участвующие в росте клеток, в
синтезе и качестве белков. Углекислый газ в повышенных концентрациях может,
например, подавлять рост культур клеток млекопитающих, снижать титр продуктов, а
также изменять профиль гликозилирования. Поэтому важно обеспечить удаление
углекислого газа из жидкой фазы, чтобы избежать ингибирующих эффектов в
процессе культивирования.
Для удаления СО2 из газовой фазы необходимо достаточное количество воздуха, особенно на поздней стадии процесса, когда парциальное давление СО2 (рСО2) в жидкости может повышаться до значений 100-200 мм рт.ст. Высокое парциальное давление СО2 приводит к увеличению концентрации НСО3 -1 в биореакторе и, следовательно, к подкислению среды. В результате увеличивается расход щелочи, из-за чего осмоляльность в культуре может повыситься настолько, что начнет оказывать негативное влияние на жизнеспособность клеток. Было показано, что повышенный уровень осмолярности (460-550 мОсм/кг) снижает плотность и жизнеспособность
жизнеспособных клеток по сравнению с нормальным уровнем (260-320 мОсм/кг). Это
еще более усугубляется в процессах с подпиткой, где подача концентрированных
питательных веществ может привести к осмолярности до 540 мОсм/кг на поздних
этапах культивирования.
Также считается, что повышенный уровень рСО2 в культурах периодического и
периодического с подпиткой типа питания приводит к задержке или полному
отсутствию лактатного сдвига.
Также высокий уровень рСО2 влияет на профиль гликозилирования. Агитация,
размер и скорость движения пузырьков воздуха, перемешивание и разбрызгивание,
отвод газов и другие газы, используемые при выращивании культуры, играют роль в
контроле содержания СО2 в культуре. Пена ограничивает возможность выделения
газов в культуре. Это снижает движущую силу переноса СО2, препятствуя выходу СО2 из культуры.
Температура
Для клеток в биореакторе требуется
определенное заданное значение температуры и механизмы управления для поддержания температуры в соответствующем допустимом
рабочем диапазоне. Температура регулируется с помощью водяной рубашки или нагревательного элемента вокруг биореактора. Датчик температуры считывает фактическое значение температуры культуральной среды, а затем отправляет сигнал контроллеру для внесения изменений в модуль контроля температуры. После чего он нагревает или охлаждает воду или любой теплоноситель, циркулирующий в рубашке вокруг бака биореактора.
Температура питательной среды уравновешивается за счет контакта с температурой рубашки.
Отклонение даже на 1 будем ℃ иметь существенные последствия. Более
высокие температурные отклонения могут оказать существенное влияние на
жизнеспособность клеток, в то время как более низкие температуры замедляют
клеточный метаболизм. Температуру культивирования переключают с 37 ℃ на более низкую температуру в диапазоне от 29 ℃ до 35 ℃ ради уменьшения клеточной гибели и стимулирования синтеза антител на стационарной фазе роста культуры. Низкая
температура оказывает положительное влияние на интегральную плотность клеток,
жизнеспособность клеток и удельную продуктивность клеток.
Температурный шифт
Клетки обычно культивируются при
температуре 37 °C в течение определенного
периода времени. В течение этого времени
демонстрируется высокая скорость роста, что позволяет получить большое количество
клеток, и при этом наблюдается практически
полное отсутствие продукции рекомбинантного белка. После достижения
желаемой плотности клеток температура
изменяется на более низкую - 30-34 °C, что
позволяет добиться максимальной
продуктивности клеток. Вместо снижения
температуры можно добавлять в
культуру химические агенты, такие как
бутират натрия. Обе стратегии успешно
останавливают рост клеток, обычно в фазе G1, одновременно повышая удельную
продуктивность и снижая поглощение питательных веществ и образование отходов.
Тем самым происходит разделение на фазу роста и фазу продукции. Это позволяет более эффективно использовать клеточные ресурсы на каждой фазе, улучшая характеристики роста и повышая выход продукта. Также снижение температуры позволяет избежать экспрессии цитотоксических рекомбинантных
белков во время стационарной фазы, уменьшая негативное влияние на рост и
жизнеспособность клеток.
Давление
Стеклянные культуральные сосуды часто допускают только давление только до
0,5 бар. Поэтому необходимо обеспечивать линию выходящих газов из биореактора и
сохранять выпускной фильтр сухим и регулярно его заменять. В отличие от стеклянных культуральных сосудов, биореакторы из нержавеющей стали рассчитаны на более высокое давление и даже в стандартной конфигурации подходят для давления до 2 бар.
Колебания давления в свободном пространстве биореактора могут нанести вред клеткам и, следовательно, повлиять на титр.
- Нерегулярные колебания давления — неестественное состояние для
нормальной среды обитания клетки.
- Колебания давления могут влиять на размер пузырьков барботирующего газа, поскольку они поднимаются в среде и воздействуют на клетки.
Часто реактора оснащены механизмом контроля давления, а также некоторые механизмы способны активно его контролировать. Стратегия блокировки
подачи газа применяется, если давление повышается в результате неправильного
эксплуатации биореактора, например, из-за закрытия зажима или блокировки
вентиляционного фильтра из-за чрезмерного пенообразовании.
ИНДИКАТОРЫ КЛЕТОЧНЫХ ПРОЦЕССОВ
- pH
- Свидетельствует о pH культуральной жидкости.
Физиологические пределы для клеток СНО: 6,7 -7,4
- Изменение pH связано с формированием кислых или щелочных метаболитов в
процессе обмена веществ в клетке; добавлении добавок с кислым или щелочным рН - рСО2 (Парциальное давление углекислого газа), мм рт ст
- Характеризует содержание углекислого газа в культуральной жидкости относительно других газов.
Оптимальный уровень рСО2 30-80 мм рт. ст., но может существенно отличаться в зависимости от клона CHO.
- Поддержание рН культуральной жидкости
(бикарбонатная буферная система). При защелачивании культуральной жидкости
увеличивается. Углекислый газ - конечный продукт обмена углеводов, липидов, белков, при увеличении плотности и смещения
акцента метаболизма на TCA увеличивается.
- CO2 Sat (Насыщение углекислым газом), %
- Норма для культивирования клеток CHO 5-10%
- Поддержание рН культуральной жидкости
(бикарбонатная буферная система). При защелачивании культуральной жидкости
увеличивается. Углекислый газ - конечный продукт обмена углеводов, липидов, белков, при увеличении плотности и смещения акцента метаболизма на TCA увеличивается. - НСО3- (гидрокарбонат ион), ммоль/л
- Содержание гидрокарбонат ионов
- Поддержание рН культуральной жидкости(бикарбонатная буферная система). Накопление кислых метаболитов (лактат, СО2) вызывает добавление
гидрокарбоната системой для повышения рН. Приводит к повышению осмоляльности. - p02 (парциальное давление кислорода), мм рт ст
- Характеризует содержание кислорода в культуральной жидкости относительно других газов - DO (Насыщение кислородом), %
- Характеризует насыщение культуральной жидкости кислородом, при культивировании около 40%
Функции 5 и 6
Кислород - акцептор электронов в процессе
клеточного дыхания (окисление органических веществ). При увеличении
концентрации клеток увеличивается потребление кислорода для обеспечения
дыхания.
процесс биопроизводства
В общих чертах процесс биопроизводства делится на 4 этапа:
* Создание клеточной линии: клетки подвергаются генетической трансформации для создания продуктивных клонов. Затем они проходят несколько последовательных отборов, основанных на стабильности клонов (по экспрессии), удельной продуктивности клеточного роста и объемной продуктивности. В результате из нескольких сотен или тысяч клонов останется только 1.
* Оптимизация сред и процессов: оцениваются различные составы сред
и подпиток для поддержания стабильного роста клеток с низким образованием
токсичных продуктов и одновременным достижением высокого титра и
требуемого качества. Исследования производят сначала в колбах, потом в
небольших биореакторах, где происходит дальнейшая оптимизация. Это включает в себя установление влияния физических (например, температуры, скорости перемешивания, скорости потока газа) и химических (например, pH, уровней растворенного кислорода и CO2, концентрации субстрата) параметров
на характеристики клеточного роста.
* Пилотная культура: испытания на масштабируемость и воспроизведение стратегии в большем масштабе. Объем культуры увеличивается от встряхиваемой колбы (десятки мл) до биореактора (в
несколько сотен литров).
* Коммерциализация: масштабирование, передача технологии и валидация производственного процесса. Проводится глубокое изучение параметров процесса, влияющих на качество продукции.
Биопроцессы промышленного масштаба требуют использования биореакторов. Задача состоит в том, чтобы расширить производственный процесс от мелкосерийной разработки до лабораторных масштабов, а затем до пилотных и производственных масштабов.
Методы увеличение и уменьшение масштаба (scale-down и scale-up)
Разработка процессов в небольших масштабах является важной отправной
точкой всех биопроцессов, которые затем масштабируются до пилотных и
производственных масштабов. Этот процесс масштабирования часто представляет
собой научную и ограниченную по времени задачу, где используются биореакторы с
разными рабочими объемами и потенциально разными конфигурациями барботера и типом перемешивания. Поэтому рабочие параметры должны быть отрегулированы в каждом масштабе.
Масштабирование (scale-up) осуществляется, когда процесс создается для проверенного и предсказуемого процесса с конечной целью коммерческого
производства в большом масштабе. С другой стороны, крайне важно разработать
процесс в небольших масштабах, который может осуществляться с учетом
массообмена в пилотном или промышленном биореакторе, другими словами, одинаково важно создать хорошие модели увеличения и уменьшения масштаба.
Обратное масштабирование (scale-down) имеет решающее значение для устранения неполадок крупномасштабных процессов, производства меньших количеств продукта и проверки изменений условий процесса. Воспроизведение увеличенной и уменьшенной версии биореактора гарантирует возможность проведения культивирования в различных масштабах и возможность проверки воспроизводимости результатов.
Характеристика процесса масштабирования (scale-up)
Клетки млекопитающих не растут при низкой плотности, поэтому, несмотря на то что процесс масштабирования отнимает довольно много времени, для культуры
клеток млекопитающих в биореакторе этот этап необходим. Масштабирование
биореактора — сложная задача, которая учитывает информацию, собранную в
результате поведения клетки в небольших масштабах. Целью масштабирования
является получение большего количества продукции с эквивалентной
производительностью и качеством.
Процесс масштабирования заключается в постепенном увеличение плотности
клеток в несколько этапов начиная с разморозки криопропирки из банка клеток до тех пор, пока не будет получено достаточно клеток для инокуляции конечного биореактора лабораторного масштаба или промышленного масштаба. Когда
объем культуры и плотность клеток соответствуют заранее определенным критериям, культуру переносят в производственный биореактор, в котором клетки продолжают расти и экспрессировать продукт. Часто для преодоления разрыва между колбами и промышленным биореактором используется промежуточный реактор объемов 10-50л.
Каждый этап может создать свои потенциальные проблемы, связанные с риском контаминации, стабильностью клеточной линии, проблемами роста, потерей продуктивности. Также каждый этап имеет ключевые показатели эффективности
процесса, такие как рост клеток, жизнеспособность и титр, а также соответствующие показатели качества продукта. Успех масштабирования процесса обычно измеряется этими ключевыми показателями процесса, которые соответствуют заранее определенным критериям.
Переход от колб к биореактору
Встряхиваемые колбы и биореакторы являются важными инструментами
биопереработки, но во многих отношениях они сильно различаются.
Емкость колб варьируется от 25 мл до 5 литров, они используются для самых
разных целей, могут быть с перегородками или без, а также могут быть многоразовыми или одноразовыми. Колбы помещают в шейкеры-инкубаторы, где встряхивающие движения отвечают за массоперенос и перемешивание. Рост клеток происходит по стандартной схеме: за задержкой после посева следует фаза экспоненциального роста, после пролиферация клеток значительно снижается или полностью прекращается. Клетки в инокуляте перед засевом/пересевом должны находиться в фазе экспоненциального роста. Поддержание логарифмического роста
позволит максимально увеличить количество здоровых клеток для эксперимента и производства. Это также сохранит оптимальную плотность клеток для дальнейшего роста и будет стимулировать дальнейшую пролиферацию.
Встряхиваемые колбы отлично подходят для скрининга, оптимизации среды. Однако эти инструменты предлагают очень ограниченные возможности мониторинга и контроля. Более того, гидродинамика встряхиваемых культур полностью отличается от гидродинамики в биореакторах.
В зависимости от целей биореакторы можно разделить на три типа:
- лабораторные (0,5 - 10 л).
- пилотные (50 - 200 л).
- промышленные (500 до 5000 л).
Если текущей целью являются разработка процесса, то, как правило, используются настольные биореакторы лабораторного масштаба, так как разработка процессов является дорогостоящим и трудоемким процессом. Лабораторные реактора
были разработаны в качестве уменьшенных моделей систем культивирования
промышленного масштаба, и они позволяют проводить разработку процесса в различных условиях. Однако они, как правило, имеют геометрию, отличающуюся от крупногабаритных реакторов, используемым в производстве, что часто приводит к
иному смешиванию и переносу газа. Хотя эти изменения интуитивно понятны, их
часто трудно предсказать. Следовательно, использование уменьшенных моделей в
качестве точных, надежных и воспроизводимых инструментов разработки процессов может оказаться сложной задачей.
Последним шагом является создание биореакторов промышленного масштаба,
обеспечивающих достаточный рабочий объем для производства большего количества желаемого соединения.
Отличия условий культивирования в колбах и реакторах
- Тип перемешивания
Режим, направление и скорость перемешивания влияют на динамику
жидкости и, следовательно, на теплообмен и массоперенос в культуре, что влияет
на общую производительность.
Перемешивание обеспечивает равномерное распределение питательных
веществ, щелочи, добавок, предотвращает осаждение клеток и обеспечивает хорошее
снабжение кислородом. Во встряхиваемой колбе культуру перемешивают путем
встряхивания, обычно с помощью орбитального движения, тогда как в биореакторах
смешивание достигается путем перемешивания.
Вращение объемной жидкости внутри сосуда происходит за счет вращающихся
центробежных сил во время процесса
встряхивания. Параметры, непосредственно
влияющие на производительность во
встряхиваемых колбах: частота встряхивания n, объем заполнения VL, объем реактора VR, диаметр встряхивания d0, вязкость жидкости 𝜂, растворимость кислорода LO2, сопротивление
массообмену через крышку, сопротивление
массообмену на границе раздела газ–жидкость, поверхностные свойства стенки реактора, конструкция внутреннего корпуса, температура Т, давление р.
- Аэрация
Правильная аэрация влияет на плотность клеток, продуктивность и количество
токсичных продуктов обмена. Скорость переноса кислорода (OTR) и удаление CO2
во встряхиваемых колбах определяется размером и формой колбы, скоростью
перемешивания, объемом заполнения и условиями окружающей среды. В
биореакторах больше механизмов, включая скорость подачи газов, размер
пузырьков, а также тип и расположение перемешивающего устройства. В небольших
биореакторах скорость смешивания жидкостей обычно не является проблемой даже при относительно низких скоростях, а удаление CO2 эффективно благодаря большому соотношению поверхности к объему. - Отсутствие контроля
Процессы культивирования во встряхиваемых колбах никогда не находятся
под полным контролем. Эти системы не позволяют проводить онлайн-измерения
критических параметров процесса, таких как температура, DO, pH поскольку колбы сложно оборудовать датчиками. Прямое управление этими параметрами также невозможно. Например, температуру и кислород можно регулировать только
путем контроля условий окружающей среды в закрытой системе инкубатора. Автоматизированные процессы управления в соответствии с заданными профилями невозможны. Управление биопроцессом в колбах требует большого количества ручной работы по отбору проб, проведению автономных измерений и ручной корректировке параметров. - Низкий выход продукта
Производство биопрепаратов требует использования биореакторов,
обеспечивающих получение большого количества продукта одинакового и
постоянного качества. Качественные показатели продукта в колбах, даже
находящихся в одинаковых условиях, будут отличаться в силу ряда факторов, в
том числе из-за отсутствия постоянного мониторинга и автоматизированной
системы управления.
Проблемы масштабирования биопроцесса
Обычно считается, что клетки млекопитающих трудно масштабировать из-за их чувствительности к физико-химическим условиям. Когда культуру переносят из встряхиваемой колбы в биореактор, условия окружающей среды, в которой находится культура, существенно изменяются. Поэтому наблюдаются серьезные различия между параметрами роста и продуктивности в колбах, реакторах производственного и также лабораторного масштаба. Следовательно, нужно осознавать, что даже небольшое
изменение размера биореактора может оказать каскадное воздействие на многие
другие условия культивирования.
Для обеспечения плавного перехода требуется нечто большее, чем просто
использование более крупных сосудов для клеточных культур. Возможность плавного
масштабирования биореакторов разных размеров помогает обеспечить надлежащее
качество продукции и снизить риски при масштабировании.
При переходе от настольных биореакторов к пилотным биореакторам,
используемым в производстве, биопроцессы, как правило, становятся более
стабильными. Однако более высокие объемы часто сложнее контролировать.
Трудности масштабирования:
Оно не может быть осуществлено напрямую.
Оно не сводится к простому увеличению числа мелких единиц.
Нет абсолютной точности в моделях
Много этапов, каждый из которых создает свои потенциальные проблемы,
связанные с риском контаминации, стабильностью, проблемами роста.
Изменения в аэрации и перемешивании являются наиболее сложными
параметрами.
По мере увеличения плотности клеток в среде биопроизводства увеличивается и
вероятность внесения неоднородности в систему, что может повлиять на качество и
эффективность продукта. Поэтому вместо того, чтобы сразу переходить к
производственному реактору, сначала проводят лабораторные и пилотные испытания для оценки критических параметров процесса, а проектирование биореактора промышленного масштаба основывается на характеристиках биореакторов уменьшенного масштаба. Кроме того, важную роль в процессе масштабирования играет оптимизация технических характеристик уменьшенных биореакторов: времени перемешивания, коэффициента массопереноса кислорода и потребляемой мощности
Scale-Down: моделирование крупномасштабных культур в
лаборатории
Небольшие системы, такие как встряхивающие колбы, использовались для
скрининга большого количества клонов и экспериментальных условий, но эти модели
менее желательны для оптимизации биопроцессов из-за трудности мониторинга и контроля параметров среды.
Обратное масштабирование (scale-down) — это эффективный подход к оценке
воздействия внешних факторов, с которыми клетки столкнуться в биореакторах
производственного масштаба, осуществляемый посредством тщательно
спланированных экспериментов в лабораторном масштабе. Уменьшенная модель процесса часто используется параллельно с крупномасштабным производством.
Результаты обратного масштабирования должны быть репрезентативными и
позволять прогнозировать результаты в производственном
масштабе. Квалифицированная модель масштабирования клеточной культуры,
которая способна воспроизвести производительность крупномасштабного процесса в
небольшом масштабе, предоставляет важную информацию, необходимую для оценки
и решения любых неожиданных проблем с производительностью крупномасштабной
системы.
Обратное масштабирование также может потребоваться, если производственный
процесс не работает должным образом, в качестве практического подхода к
воспроизведению проблем и проверке возможных исправлений в экспериментальных условиях. Обратное масштабирование позволяет оптимизировать процессы и устранять проблемы на этапе разработки, до вывода процесса на полную мощность в
производственной стадии. Также позволяет разработчикам и сотрудникам
производства подобрать параметры, при которых процесс будет работать правильно, а также дает представление о приемлемых диапазонах рабочих параметров, при
которых процесс будет продолжать работать и давать такие же результаты.
Параметры, которые необходимо учитывать при scaledown и scale-up
В крупномасштабных биореакторах могут возникать различные градиенты
из-за недостаточного перемешивания и ограничений массообмена. Растворенный
кислород, градиенты pH или субстрата приводят к неоднородной среде
культивирования. Неоднородности в крупномасштабных биореакторах могут привести к множественным физиологическим реакциям в культивируемых клетках.
Это в свою очередь скажется на росте и продуктивности, которые будут отличны
от данных в лабораторных реакторах. Ключевые проблемы понимания ответов
сложной клеточной системы на неоднородность условий связаны с:
- Ограниченным пониманием динамики реактора. Невозможно составить
карту динамически изменяющихся химических и физических параметров в
крупномасштабном биореакторе. Существующие модели и методы уменьшения масштаба учитывают лишь несколько параметров. Однако клетка будет реагировать на отдельные локальные условия. - Ограниченными техническими средствами для измерения и отбора проб. В настоящее время редко применяются методы отбора проб из крупномасштабного биореактора из различных мест в объемной площади реактора. Также ограничена доступность онлайн датчиков, которые можно свободно разместить в различных местах крупномасштабного биореактора.
- Ограниченным пониманием кинетики клеточных реакций. Реакция и адаптация клеток к локальным условиям происходят в разные временные периоды, например, за счет изменения метаболических потоков.
- Ограниченным пониманием эффектов клеточной истории. Отклик клетки зависит от удельной скорости роста, которая сама по себе зависит от локальных условий окружающей среды, а также истории пережитых динамических изменений
условий окружающей среды.
При запуске процесса в различных масштабах цель состоит в том, чтобы
поддерживать постоянство клеточной среды для достижения сопоставимого роста,
метаболизма, производительности и качества продукции. Клеточная среда
контролируется параметрами процесса. Эти параметры можно разделить на
зависящие от объема, например, рабочий объем, перемешивание, аэрация, и
независимые от объема параметры, например, pH, DO, температура, которые остаются постоянными в разных масштабах биореактора.
Общая стратегия масштабирования и обратного масштабирования заключается в
пропорциональном увеличении параметров, зависящих от объема, при сохранении
параметров, не зависящих от объема, на тех же заданных значениях, которые
используются в мелкомасштабном процессе. При этом некоторые параметры,
зависящие от объема, трудно масштабировать линейно из-за различий в геометрии биореакторов, соотношении поверхности жидкости к объему, режиме газовыделения и возможности регулирования, т. е. применяются нелинейные эффекты.
Сложнее всего увеличивать или уменьшать масштаб регулирования растворенного кислорода, поскольку он достигается за счет множества параметров, таких как перемешивание, тип барботера и скорости потока газа для воздуха, кислорода, азота, каждый из которых в свою очередь по отдельности также влияет на клетки. Контроль DO также влияет на способность удалять CO2, который взаимодействует с контролем pH, а pCO2 влияет еще и на титр и качество целевого белка. Взаимосвязь между параметрами процесса и клеточной средой показана на рисунке.
Перемешивание и аэрация являются двумя важными условиями, которые необходимо правильно масштабировать для достижения сравнимой производительности процесса в разных масштабах.
Для увеличения или уменьшения масштаба биореактора необходимо найти
оптимальные рабочие параметры, понимая и оценивая проектное пространство.
Обычно используют общие стратегии масштабирования, такие как объемный расход газа (vvm), коэффициент массообмена (kLa) и мощность на единицу объема (P/V) для определения параметров, зависящих от масштаба, включая скорость переноса газа и перемешивания
- Постоянное время смешивания
- Постоянная удельная потребляемая мощность (P/V)
- Режим аэрации
Основные параметры, которые необходимо учитывать при scale-down и scale-up
- Скорость переноса кислорода (OTR)
Более высокая скорость переноса кислорода приводит к улучшению процесса. - Коэффициент массообмена (kLa)
Скорость переноса кислорода внутри реактора улучшается с увеличением значения kLa - Растворенный кислород (DO)
Движущая сила переноса кислорода возрастает при высоких значениях DO - Объемный расход газа (vvm)
Более высокая скорость воздушного потока
приводит к увеличению kLa и скорости переноса кислорода - Мощность на единицу объема (P/V)
Более высокое соотношение P/V помогает
улучшить kLa и перемешивание в реакторе, но это также может повредить клетки - Скорость наконечника
Высокая скорость вращения может привести к увеличению напряжения сдвига, приводящего к повреждению клеток и снижению жизнеспособности
Постоянное время смешивания
Одной из основных проблем при масштабировании процессов с периодическим питанием является формирование градиентов концентрации при высокой плотности клеток. Гетерогенные условия возникают при добавлении сырья, входе газа, а также при добавлении любого контролирующего агента, например основания или кислоты.
Возникновение градиентов зависит от глобального и локального энергопотребления в газожидкостной фазе биореактора. В биореакторе перемешивание обычно достигается за счет механического перемешивания крыльчаткой, поэтому выбор конструкции мешалки очень важен и зависит от вязкости жидкости и
чувствительности культуры к механическим сдвигам. Плохое перемешивание в
биореакторах может привести к градиентам pH, питательных веществ и температуры,
а также к плохому контролю рабочих параметров.
Время перемешивания определяется как продолжительность времени, необходимого
для достижения 95% гомогенности в идеально перемешанном сосуде.
Постоянная удельная потребляемая мощность (P/V)
Постоянное время смешивания не является часто используемым критерием
масштабирования, поскольку значение P/V при масштабировании может оказаться
слишком высоким. Удельная потребляемая мощность является наиболее часто
используемым критерием масштабирования. P/V описывает энергию, передаваемую
от мешалки к жидкости, и является хорошим показателем для учета смешивания и
массопереноса.
В типичных биореакторах с перемешиванием для культур клеток
млекопитающих требуется низкая потребляемая мощность, чтобы минимизировать механические повреждения, возникающие в клетках в результате перемешивания.
Однако масштабирование на основе мощности не учитывает геометрию реактора, движение жидкости и схемы потоков жидкости/газа.
Режим аэрации
На втором этапе определяются параметры режима аэрации. Многие параметры,
такие как конфигурация барботеров, потоки газа и содержание кислорода, можно
изменять для обеспечения одинаковой скорости переноса кислорода.
Первое условие режима аэрации очевидно: обеспечение культуры кислородом
должно соответствовать фактическому потреблению кислорода. Второе условие
связано с удалением углекислого газа, который является критическим параметром в
большинстве процессов культивирования клеток. Поэтому скорость перемешивания
газов является ключевым фактором для биореакторов.
KLa (объемный коэффициент массообмена) и OTR (скорость переноса кислорода) определяют, насколько эффективно кислород переносится из газовых пузырьков в среду биореактора, т.е. сколько кислорода доступно для культуры. На объемный коэффициент массообмена (kLa), как писалось в предыдущем разделе,
влияет геометрия реактора, параметры смешивания, размер пузырьков газа, скорость подачи газов, физико-химические свойства жидкости. Чем больше kLa, тем выше аэрационная способность биореактора.
Накопление углекислого газа является постоянной проблемой при культивировании клеток млекопитающих, высокие уровни pCO2 оказывают ингибирующее действие на рост клеток и производство белка. Оптимальный уровень pCO2 варьируется в зависимости от клеточных линий.
Проектное пространство иллюстрирует возможный диапазон потребляемой
мощности (P/V) и аэрации. В этом диапазоне достигается достаточный перенос газов
и смешивание без возникновения чрезмерного пенообразования, высокой
концентрации углекислого газа, а также гидродинамического сдвига. Работа ниже
предела ограничивает перенос кислорода, тем самым лимитирую метаболизм
клеток. При масштабировании процесса важно оставаться в одном и том же
пространстве проектирования. Пространство проектирования для реакторов
большого размера будет меньше, чем для реакторов меньшего размера.
Осветление
В большинстве систем на основе клеток млекопитающих требуемый продукт
клетки выделяют во внешнюю среду. После окончания процесса культивирования в
биореакторе и синтеза требуемого продукта клетками, последний необходимо
изолировать от всех прочих частиц и выделить из системы.
За последние годы биофармацевтическая промышленность перешла к
значительно более высоким титрам и, как следствие, к более высокой плотности
клеток. Однако это также привело к увеличению количества примесей, таких как
клеточный дебрис, белок клеток-хозяина и ДНК. Это влияет на производительность
фильтрации и может привести к переносу примесей на последующие этапы очистки.
Осветление клеточной культуры необходимо для защиты высокочувствительных и
дорогостоящих последующих процессов, таких как диафильтрация, ультрафильтрация
и белковая хроматография. Осветление является сложной задачей, поскольку
культуральная жидкость содержит целые клетки, клеточный мусор из мертвых клеток,
а также целый ряд белков, образующихся в результате клеточной активности. Эти
этапы очистки служат соединяющим звеном между синтезом и очисткой
терапевтических препаратов.
Основными целями процесса осветления культуральной жидкости являются:
1) удаление клеток и дебриса;
2) высокий выход продукта;
3) уменьшение содержания примесей.
Процесс очистки моноклональных антител
Процесс очистки, который в настоящее время используется для производства
почти всех моноклональных антител, включает как минимум 4 различных этапа:
1. Глубинная фильтрация для первоначального осветления клеточной
культуральной жидкости
2. Вирусная фильтрация для удаления случайных и экзогенных вирусов
3. Ультрафильтрация/диафильтрация для концентрирования, замены буфера
и составления рецептуры
4. Стерильная фильтрация для снижения биологической нагрузки и операций
окончательного наполнения.
Способы фильтрации
Размер пор определяет диапазон размеров частиц, которые могут пройти через
фильтр. Точный размер пор будет зависеть от конкретного образца и требуемой
чистоты. В некоторых случаях для получения желаемого результата может
потребоваться несколько этапов фильтрации или использование фильтров с разными
размерами пор.
- Глубинная фильтрация (0,7–100 мкм) используется для удаления клеток и клеточного мусора после сбора из биореактора.
- Микрофильтрация (0,1–10 мкм) может удерживать более мелкие
частицы, в том числе бактерии, дрожжи. Обычно используется для стерилизации
и удаления загрязнений. - Ультрафильтрация (1–100 нм) удерживает макромолекулы, такие
как белки, нуклеиновые кислоты, вирусы и наночастицы. Эти фильтры
используются для концентрирования, обессоливания биомолекул, а также могут
использоваться для удаления белков. - Хроматографические мембраны (до нескольких сотен
нанометров) имеют макропористую структуру, позволяющую очищать не белки
и нуклеиновые кислоты, вирусы - Обратный осмос (менее 1 нанометра) используется для удаления
солей и других небольших молекул из воды и других жидкостей, например, для
приготовления сверхчистой воды. Помимо удаления всех органических
молекул и вирусов, обратный осмос также удаляет большинство минералов,
присутствующих в воде. Осмос возникает, когда полупроницаемая мембрана
разделяет два раствора солей разной концентрации. Вода будет мигрировать из
более слабого раствора в более сильный до тех пор, пока оба раствора не будут
иметь одинаковую концентрацию, поскольку полупроницаемая мембрана
пропускает воду, но не соль. При обратном осмосе два раствора по-прежнему
разделены полупроницаемой мембраной, но для изменения естественного
потока воды применяется давление. Это заставляет воду переходить от более
концентрированного раствора к более слабому.
Осветление методом фильтрации
Первичное осветление обычно осуществляется посредством центрифугирования
и/или глубинной фильтрации. Кроме того, распространенными технологиями очистки
перфузионных биореакторов являются тангенциальная поточная фильтрация (TFF) и
попеременная тангенциальная фильтрация (ATF), которые предназначены для
обеспечения непрерывного сбора секретируемого продукта.
В отличие от глубинной фильтрации, в которой продукт течет перпендикулярно
фильтру, поток продукта в TFF движется параллельно фильтру. Это позволяет
удерживать твердые частицы в растворе и сводит к минимуму образование
«фильтрационной корки», которая засоряет мембрану.
Чтобы соответствовать требованиям промышленного масштаба производства,
процесс осветления должен:
1) быть быстрым для уменьшения распада продукта и устранения проблем
стерильности;
2) быть масштабируемым, экономически и технически осуществимым;
3) быть эффективным с точки зрения удаления твердых примесей и обеспечения
достаточной чистоты для уменьшения нагрузки на последующие этапы;
4) обладать помехоустойчивостью, чтобы обеспечивать стабильность от партии
к партии;
5) давать высокий выход целевых белков;
Выбор первичного этапа осветления может существенно повлиять на
последующие операции фильтрации и очистки.
Сравнение технологий сбора для систем на основе клеток млекопитающих
*Глубинная фильтрация
1. Диатомитовые фильтры с плотно прижатыми друг к другу дисками
- Высокий выход продукта, низкие затраты на
обслуживание, утилизируемые элементы,
некоторая степень связывания примесей
- Малая пропускная способность при
плотностях клеток > 107/мл
- Недиатомитовые фильтры с плотно
прижатыми друг к другу дисками
- Слабое связывание продукта
- Меньшая степень осветления, нежели в
диатомитовой среде - Глубинная фильтрация нового поколения
- Повышенная мощность, улучшенное связывание примесей, потенциальное
снижение вирусной нагрузки
- Более дорогостоящая
*Микрофильтрация
- Фильтрация тангенциальным потоком
при размере пор 0,65 мкм или меньше
- Высокий выход продукта, может быть получен фильтрат с качеством фильтрации 0,2 мкм
- Быстрое засорение, ограниченная
пропускная способность при плотностях клеток>107/мл
*Центрифугирование
- Тарельчатая/ дисковая центрифуга
- Высокая пропускная способность, высокий
выход продукта
- Требуется дополнительная фильтрация
Факторы, влияющие на процесс осветления
- Нагрузка твердыми частицами, плотность клеток
Концентрация твердых частиц является критическим фактором, требующим
оценки при выборе и оптимизации технологий осветления. Чтобы улучшить
продуктивность процесса, обычно прибегают к повышению плотности клеток за счет оптимизации условий культивирования и состава культуральной среды с конечной
целью повышения титра. При увеличении плотности клеток в ходе операций сбора
требуется удалить как можно большее количество массы твердых частиц на единицу
объема. Кроме того, повышенная плотность клеток может привести к увеличению
содержания технологических примесей, таких как белки клеток-хозяев, ДНК и тд.
Центрифугирование считается эффективной технологией сбора с точки зрения
осветления высоких концентраций биомассы или обработки больших объемов. В
процессах осветления на основе фильтрации (например, микрофильтрации и
глубинной фильтрации) твердые частицы накапливаются в порах и на поверхности
фильтра, приводя к засорению последнего. Микрофильтрация и глубинная фильтрация
могут быть эффективными при низких и средних плотностях клеток, ввиду
необходимости очень больших площадей фильтров при высокой плотности клеток - Жизнеспособность клеток
Увеличение продолжительности культивирования, способствующее повышению производства рекомбинантного белка, часто выражается в снижении
жизнеспособности клеток и высвобождении технологических примесей. Усиление
клеточного лизиса содействует образованию более широкого диапазона примесей, что
затрудняет операции сбора. Как следствие, могут потребоваться многочисленные
независимые методы, которые эффективны при различных диапазонах размеров
частиц. В случае процессов центрифугирования уменьшение жизнеспособности клеток может повысить чувствительность клеток к сдвигу и вызвать усиленный клеточный лизис, что приведет к высвобождению примесей, которые затруднят последующие операции фильтрации, поскольку они не могут быть удалены при типичных условиях центрифугирования. - Гранулометрический состав частиц
На гранулометрический состав частиц клеточной культуры влияет целый ряд
факторов. В культуральной жидкости присутствуют живые клетки, мертвые клетки и клеточный дебрис. Распределение по размерам в этих трех популяциях может влиять на эффективность первичного выделения целевого продукта. Поскольку в
современных технологиях фильтрационного сбора в качестве основного механизма
сепарации используется размер частиц, гранулометраческий состав оказывается
важнейшим фактором выбора той или иной технологии.
Центрифугирование
Это распространенный метод, используемый для сбора крупномасштабных сосудов для культивирования клеток, поскольку он сочетает в себе низкие эксплуатационные расходы с несложной разработкой процесса и надежностью эксплуатации. Переходу к центрифугированию способствовала необходимость масштабирования процессов для работы с биореакторами объемом от 10 000 с увеличением плотности клеток и титра.
Существуют различные типы центрифуг, которые используются в биоразработке. Для культивирования клеток млекопитающих наиболее широко распространенными конструкциями являются дисковые центрифуги и центрифуги с трубчатой чашей. Дисковые центрифуги обеспечивают высокую производительность по переработке твердых частиц, но могут иметь более высокие потери при использовании клеточных культур с высокой плотностью. Дисковые центрифуги легко очищаются, что делает их более подходящими для использования в производственных условиях.
Центрифугирование с непрерывной разгрузкой отличается от
центрифугирования с периодической разгрузкой тем, что твердые частицы не
выгружаются периодически, а перемещаются вверх по каналам над стопкой дисков для непрерывной выгрузки через сопла в камеру, имеющую собственный центростремительный насос (более крупный чем для сбора концентрата). Он откачивает поток высококонцентрированных твердых частиц через выпускной трубопровод. Процент твердых веществ в потоке концентрата зависит от скорости его потока, которая контролируется клапаном.
Поток сырья подается в чашу центрифуги, вращающейся с высокой скоростью. Различия в плотности вынуждают клетки перемещаться на периферию чаши, где они накапливаются в пространстве для твердых частиц, в то время как бесклеточный фугат стекает вверх через центростремительный насос и собирается для дальнейшей обработки.
На эффективность осветления процесса центрифугирования влияют параметры
сбора, включая скорость подачи центрифуги, силу перегрузки, геометрию чаши,
рабочее давление, частоту разряда и вспомогательное оборудование, используемое при переносе жидкости клеточной культуры в центрифугу. Характеристики процесса культивирования клеток, такие как пиковая плотность клеток, общая плотность клеток и жизнеспособность культуры во время процесса культивирования и при сборе, также
влияют на эффективность разделения во время центрифугирования.
Хотя центрифугирование выполняется быстро, оно может представлять риск для
клеток. Высокие уровни ускорения могут привести к разрыву клеток и лизису, что
приводит к попаданию органелл и внутриклеточных белков в жидкую
среду. Дополнительный мусор ухудшает чистоту образца, а частицы маленького
размера трудно удалить центрифугой, что увеличивает нагрузку на следующий этап
глубинной фильтрации. Оптимизированный процесс центрифугирования сводит к
минимуму лизис клеток. Часто используются герметичные центрифуги, которые
полностью исключают границу раздела воздух-жидкость, обычно присутствующую в
стандартных негерметичных центрифугах. Этот обеспечивает лучшее сохранение
целостности клеток. Также стоит отметить, что центрифугирование в промышленных
масштабах обеспечивает очистку только около 90%. Поэтому часто требуется второй
этап глубинной фильтрации, чтобы осветлить образец до приемлемого уровня.
Глубинная фильтрация
Процесс фильтрации намного мягче, чем центрифугирование. Клетки не подвергаются высокой скорости или резкому давлению.
Глубинные фильтры обычно состоят как минимум из трех компонентов:
1) целлюлозного волокна или полипропиленового волокна;
2) вспомогательной фильтрующей присадки;
3) связующей смолы, которая обычно бывает положительно заряженной или может быть «функциализирована» одинаково заряженными лигандами (например, четвертичными аминами).
Целлюлозные или полипропиленовые компоненты придают жесткость и базовую
структуру глубинному фильтру, а
диатомитовая часть или перлит увеличивают площадь поверхности, улучшая способность удержания твердых частиц и усиливая характеристики удержания.
Связующая смола повышает
влагостойкость фильтра и может
придать ему зарядовые свойства.
Помимо удаления материала на основе
исключения размера, глубинные фильтры удаляют растворимые примеси путем адсорбции за счет гидрофобных, ионных и других взаимодействий. Их использовали для удаления эндотоксина из воды, 11 и
ДНК из супернатанта клеточной культуры. Дополнительно глубинный фильтр может включать мембранный слой абсолютного фильтра с различными размерами пор, вплоть до 0,22 мкм. Диапазон пор глубинного фильтра может составлять от 0,05 до 10 мкм.
Глубинная фильтрация представляет собой использование пористой среды,
способной удерживать частицы из подвижной фазы за счет сочетания различных
взаимодействий в толще фильтрующего матрикса, а не только на поверхности, как в
мембранных фильтрых, которые, как правило, задерживают частицы за счет
механизма поверхностного просеивания. Используя толщу фильтра и просев твердых
частиц на поверхности, можно сделать глубинную фильтрацию эффективным методом осветления при широком диапазоне гранулометрических составов и повышенном
содержании твердых частиц. Глубинная фильтрация имеет две основные сферы применения: осветление клеточной культуры и осветление промежуточных технологических потоков перед этапами хроматографии.
Процесс первичной глубинной фильтрации очень чувствителен к условиям
клеточной культуры (жизнеспособность, плотность клеток и pH), а ограниченная
способность удержания твердых частиц в случае крупных клеток и большого
количества клеточного дебриса требует использования больших фильтрующих
площадей. Также следует учитывать физические свойства и количество продукта в потоке сырья. Продукты с низкой концентрацией и высоким зарядом могут
адсорбироваться на заряженной среде глубинной фильтрации (глубинные
диатомитовые фильтры или сильно заряженные среды нового поколения) и
существенно уменьшать выход продукта. Таким образом, состав среды глубинной
фильтрации является дополнительным критерием, который может влиять на выбор
глубинного фильтра.
Глубинная фильтрация первоначально использовалась в биопроцессах для
обеспечения дополнительного уровня очистки после центрифугирования. Однако в
настоящее время глубинная фильтрация стала использоваться как самостоятельный
этап очистки.
Глубинные фильтры
■ Состоит из нескольких слоев или одного слоя.
■Улавливает частицы различных размеров, которые могут задерживаться как на
поверхности, так и во всей матрице фильтрующего материала.
Мембранные фильтры
■ Тонкие высокопористые материалы с узким распределением пор по размерам,
обычно задерживают загрязнения, размер которых превышает размер пор на
поверхности мембраны.
■ Мембранные фильтры обычно используются в таких ответственных областях,
как стерилизация и конечная фильтрация, так ка способны удерживать бактериальные
клетки.
Основные механизмы, позволяющие удалять твердые частицы:
Основные механизмы, позволяющие удалять твердые частицы:
1) через адсорбцию клеток, клеточного дебриса и растворимых примесей
посредством электростатических, гидрофобных взаимодействий или взаимодействий смешанного типа
2) путем разделения по размерам или механического просеивания более
крупных частиц.
Достоинства и недостатки глубинной фильтрации
Основными достоинствами глубинной фильтрации являются:
1. высокие скорости фильтрации;
2. удобство реализации;
3. удобство масштабирования;
4. возможность однократного применения.
Глубинная фильтрация имеет ограничения на объем образца, который можно
качественно профильтровать. Во время фильтрации улавливание частиц может
привести к:
* Закупорка фильтра (увеличивает сопротивление потоку)
* Насыщение фильтрующей мембраны
Когда фильтр блокируется, может происходить:
* Снижение скорости фильтрации
* Повышение давления сверх допустимого для системы
* Крупные частицы просачиваются через фильтр, что видно по сильному
повышению оптической плотности
Фильтрацию следует прекратить до того, как:
* Достижение определенного предельного давления
* Фильтр начнет пропускать непрофильтрованную мутную жидкость
Пропускная способность фильтра
Пропускная способность фильтра — это максимальный объем, отфильтрованный непосредственно перед этими моментами. Расширение пропускной способности возможно только за счет увеличения количества фильтров и занимаемой площади. Поэтому при сборе клеточных культур объемом более 4000 л большинство биопроизводителей в целях экономии прибегают к центрифугированию, а глубинная фильтрация часто применяется в качестве этапа вторичного осветления, следующего сразу после цетрифугирования, поскольку способность последнего удалять материал с низким размером частиц ограничена.
Другой вариант – использование двухступенчатой глубинной фильтрации с
первым фильтром с более широкими порами и вторым глубинным фильтром с более
узкими порами. Для лабораторных биореакторов обычно используют два типа
глубинных фильтров без центрифугирования, для крупномасштабных глубинная фильтрация обычно сочетается с центрифугированием.
Производительность глубинной фильтрации
Проведя небольшие и среднемасштабные испытания и лучше поняв
характеристики глубинной фильтрации, можно разработать надежный процесс,
который сможет обеспечить стабильное качество продукции, надежные результаты
для масштабирования и сократить время технологического цикла.
Производительность глубинной фильтрации обычно оценивается по фильтрующей способности, измеряемой в литрах сырья на квадратный метр площади
фильтрования (л/м2) до достижения конечного показателя давления или мутности.
Значение пропускной способности фильтра используется для определения площади
фильтра, необходимой для фильтрации любого объема.
Нагрузочная способность глубинного фильтра может определяться как
скоростью засорения, на которую указывает перепад давления, так и адсорбцией или
способностью удержания твердых частиц, на которые указывает степень осветления
или мутность фильтрата, а также падение скорости фильтрации. Следовательно,
конечными точками испытания будут являться давление (Pmax), превышающие
конкретную уставку, прорыв мутного потока (Tmax) или падение скорости до нуля
(Vmax). Пропускная способность фильтра зависит от конкретной скорости потока и
марки/размера пор глубинного фильтра, который был протестирован.
Метод Vmax
Калибровочный инструмент для поверхностных и мембранных фильтров,
проводимый при постоянном давлении в системе и основан на модели постепенного
забивания пор. По мере процесса происходит постепенное снижение скорости потока до полной остановки.
Значение Vmax – теоретическое максимальное количество продукта, которое
может быть отфильтровано до того, как мембрана будет полностью забита, то есть
скорость фильтрации будет нулевой.
Преимущества:
* Быстро
* Требуется небольшой объем жидкости
* Позволяет проводить многократное тестирование
Ограничения:
* Неприменим к глубинным фильтрам
Методы Pmax Tmax
Pmax Tmax – это количество продукта, которое может быть отфильтровано до
достижения определенного давления на входе или определенной мутности фильтрата.
Следовательно, во время эксперимента постоянно фиксируется давление в системе и мутность фильтрата.
Механическую фильтрующую способность проще измерить исходя из перепада
давления, поскольку пути жидкости оказываются ограничены вследствие накопления частиц на путях потока в среде глубинного фильтра. Мониторинг обоих параметров крайне важен для определения нагрузочной способности глубинного фильтра.
Например, предположим, что один литр необходимо отфильтровать с помощью
фильтра площадью 25 см2. По завершении эксперимента можно было зафиксировать,
что при достижении предельного давления было отфильтровано 0,85 л. Эти данные
затем можно использовать для определения фильтрующей площади, необходимой для
партии объемом 150 л, разделив 0,85 л на площадь фильтра 25 см2 и получив 0,034
л/см2 или 340 л/м2. Так мы получим емкость фильтра, которую уже можно использовать для определения необходимой площади фильтрации и следовательно количества фильтров. Нужно разделить желаемый размер партии (150 л) на емкость
340 л/м2, чтобы получить 0,44 м2 необходимой площади фильтра.
Преимущества:
* Применимо независимо от механизма удержания
* Методы применимы ко всем типам фильтров (глубинные, поверхностные,
мембранные), но чаще всего используется для глубинных.
Недостатки:
* Нет прогнозируемой модели
* Необходимо большой объем фильтруемой среды
* Время тестирования может быть длительным
Хотя каждый продукт и процесс уникальны, в целом справедливы следующие
утверждения:
Более низкие скорости потока на единицу площади фильтра приводят к
более высокой производительности фильтра (л/м2).
Меньший размер пор и более заряженная среда более эффективны при
удалении ДНК.
Морфология клеток, общая плотность клеток и жизнеспособность влияют
на емкость фильтра.
При использовании положительно заряженного фильтрующего материала
для глубинного фильтра изоэлектрическая точка продукта (pI) должна быть выше, чем
pH, чтобы обеспечить максимальную степень извлечения продукта.
Такие факторы, как удерживаемый объем, масштабируемость, эргономика
и простота использования, могут варьироваться в зависимости от конкретного
поставщика, и их также следует учитывать при определении процесса фильтрации.
