Культивирование

Question 1

Трансфекция

Answer 1

– это процедура, в ходе которой происходит введение
чужеродных нуклеиновых кислот в клетки с целью их генетической
модификации

Question 2

Профиль гликозилирования

Answer 2

Гликозилирование — это присоединение углеводов к остову белка посредством ферментативной реакции

Question 3

Необходимые вещества для роста клетки

Answer 3

1. Источник углерода, обычно глюкоза
2. Аминокислоты, основной материал для синтеза белков
3. Неорганические соли для поддержания осмотического баланса и буферных свойств
4. Микроэлементы и витамины, необходимые для диссимиляционного и ассимиляционного метаболизма

Question 4

Осмотический баланс клетки

Answer 4

Это способность организмов контролировать концентрацию растворённых веществ внутри и вокруг своих клеток.

Question 5

Буферные свойства клетки

Answer 5

Это способность поддерживать постоянный уровень рН

Question 6

Диссимиляционный и ассимиляционный метаболизм клетки

Answer 6

Метаболизм (обмен веществ) состоит из двух процессов:
1. Диссимиляция (энергетический обмен, катаболизм) распад слоных веществ на простые с выделением энергии. По способу диссимиляции выделяют аэробов и анаэробов.
2. Ассимиляция (пластический обмен, анаболизм) совокупность процессов биосинтеза, которые протекают в живом организме. По способу ассимиляции выделяют автотрофов (сами синтезируют орг. в-ва из неорг.) и гетеротрофов (получ орг в-ва с пищей).

Question 7

Неорганические соли

Answer 7

Одно из главных условий сохранения жизнеспособности клеток - поддержание рН и осмотического давления.
Смесь солей в основе питательной среды выполняет эту функцию.
В большинстве сред, как и в крови, используется бикарбонатный буфер, поддерживающий рН.
В среду добавляют ионы натрия и калия (в виде солей) для обеспечения осмотического баланса клеток.
Но все три иона (натрия, калия, хлора) регулируют мембранный транспорт питательных веществ и макромолекул (в клетку и из клетки), а также поддерживают ионную силу, необходимую для функционирования ферментов или непосредственно участвуют в ферментативных реакциях.

Из-за выделяющегося углекислого газа и лактата в ходе окисления субстратов, культурадьныя среда может стать более кислой.
рН регулируют добавление кислоты или основания или регулированием количества углекислого газа.

Question 8

Микроэлементы

Answer 8

Замещают сывороточные элементы.
Необходимы для гликозилирования и поддержания функциональности ферментов.

Кальций, медь, магний, марганец, цинк, селен часто поступают в виде соли и играют важную роль в энергетическом и конструктивном обмене. Также являются кофакторами ферментов и регуляторами мембранного транспорта.
При повышенных концентрациях могут быть токсичны.

Question 9

Реакция Фентона

Answer 9

Пагубное влияние активных форм кислорода (АФК) в культуре клеток
млекопитающих часто связано с наличием свободных ионов переходных металлов.
Накопление свободных гидроксильных радикалов, которые повреждают
разнообразные биомолекулы, катализируется окислительно-восстановительным
циклом ионов меди (Cu) и железа (Fe), известным как реакция Фентона.

В присутствии ионов двухвалентного железа пероксид водорода
разлагается с образованием гидроксильного радикала (HO.):
H2O2 + Fe2+ → Fe3+ + HO- + HO.
Эта реакция (известная как реакция Фентон) приводит к
печальным последствиям для окружающих клеток. Радикал гидроксила
чрезвычайно активен химически и разрушает почти любую
встретившуюся ему молекулу.

(а) редокс-активные переходные металлы катализируют образование дисульфидных связей и впоследствии
вызывают образование АФК через реакцию Фентона; (б) цинк стабилизирует свободные
сульфгидрильные остатки, тем самым препятствуя образованию АФК

Question 10

Витамины

Answer 10

Наиболее
часто для стимулирования роста клеток добавляются витамины группы В. Биотин
является кофактором ферментов, участвующих в метаболизме жирных кислот и
усиливает рост клеток, синтез белка. Холин, фолиевая кислота, никотинамид,
пантотенат, пиридоксаль, рибофлавин и тиамин также необходимы для роста клеток.

Question 11

Антибиотики

Answer 11

используются для
контроля роста бактериальных и грибковых загрязнений, а также действуют как
агенты селекции, используемые для отбора и создания генетически
модифицированных клеток. Селективные антибиотики для создания стабильных
клеточных линий или других рекомбинантных культур следует выбирать на основе
гена устойчивости к антибиотикам или селектируемого маркера.

Частое использование
антибиотиков для культивирования клеток не рекомендуется, поскольку антибиотики
могут маскировать заражение микоплазмой и устойчивыми к антибиотику
бактериями, рост которых ингибируется, но они не умирают. Также необходимо
определять остаточную концентрацию антибиотиков для доказательства того, что в
выпускаемом препарате их содержание находится в допустимых значениях.
Антибиотики следует использовать только в крайнем случае и только для
кратковременного применения, после чего удалить их из среды.

Question 12

Аминокислоты

Answer 12

поступают в ростовую среду и/или образуются в результате
биосинтеза клетками.

Они необходимы для роста клеток, используются для
синтеза белков, участвуют в энергетическом обмене. В результате катаболизма
аминокислот клетка может окислять соединения для последующего образования
промежуточных продуктов цикла ТСА, которые используются в центральных
метаболических путях.
Избыточное поступление аминокислот приводит к образованию побочных
продуктов, в частности аммония. Аммоний образуется в основном при распаде
глутамина, но также и других аминокислот. При накоплении аммонии оказывает
негативное влияние на качественные характеристики продукции, a также на рост
клеток.
Питательные среды можно разделить на две категории: незаменимые и
заменимые. Все составы сред содержат десять незаменимых аминокислот, тк клетки
не могут их синтезировать. Дефицит незаменимых аминокислот может привести к
немедленному прекращению роста и потере жизнеспособности в результате апоптоза.

(обычно цистеин, глутамин и
тирозин) снижает метаболическую нагрузку на клетки.

L-глутамин — незаменимая аминокислота, необходимая практически всем
клеткам млекопитающих.

Question 13

Цикл ТСА

Answer 13

Цикл трикарбоновых кислот — это ключевой этап дыхания всех клеток, использующих кислород, центр пересечения множества метаболических путей в организме, промежуточный этап между гликолизом и электронтранспортной цепью.
Кроме значительной энергетической роли циклу отводится также и существенная пластическая функция, то есть это важный источник молекул-предшественников, из которых в ходе других биохимических превращений синтезируются такие важные для жизнедеятельности клетки соединения, как аминокислоты, углеводы, жирные кислоты и др.

Цикл Кребса - это сложная серия химических реакций, которые производят углекислый газ и аденозинтрифосфат (АТФ), соединение, богатое энергией. Этот цикл внутри человеческого организма происходит во всех клетках, которые используют кислород в процессе дыхания.

Question 14

Углеводы

Answer 14

Углеводы в форме сахара — основной источник энергии при культивировании
клеток. Гликометаболизм является основным источником АТФ для клеток, поэтому
производство белка сильно зависит от эффективности метаболизма сахаров.
В случае клеток млекопитающих основным используемым
углеводом является глюкоза, в некоторых составах для определенных целей
используют также галактозу, мальтозу, фруктозу и другие сахара. Углеводы могут
включаться в состав среды и добавляются во время культивирования в качестве
отдельной добавки или как часть подпитки.
Количество глюкозы в составах клеточных культур колеблется от 1 г/л (5,5 мМ)
до 10 г/л (55 мМ). Во время культивирования клеток необходимо поддерживать
минимальную концентрацию глюкозы на уровне 2–3 г/л, но избыток глюкозы также
ингибирует рост и снижает титр белка. Многие классические среды содержат
примерно 5,5 мМ D-глюкозы, что приблизительно соответствует нормальному уровню
сахара в крови in vivo.

высокие уровни глюкозы ингибируют окислительный метаболизм, что
приводит к образованию лактата. Это вызывает преждевременный клеточный стресс.

При низких уровнях глюкозы, клетки специально используют глюкозу
для удовлетворения энергетических потребностей, а не для гликозилирования

Question 15

ПФП

Answer 15

Пентозофосфатный путь (ПФП) представляет собой альтернативный путь
окисления глюкозы, который регенерирует НАДФН, способствующий окислительновосстановительному балансу в цитоплазме и образованию сахаров С5, которые
участвуют в реакциях биосинтеза, в частности в биосинтезе нуклеотидов. Потоки
ПФП увеличиваются во время стационарной фазы по сравнению с экспоненциальной
фазой в 5–6 раз. Так в перфузионном режиме доля глюкозы, поступающей в ПФП,
оценивалась в 20–40%, в периодическом же режиме доля ПФП намного ниже.

Question 16

эффект Крэбтри

Answer 16

Эффект Крэбтри работает путем подавления дыхания путем ферментации, в зависимости от субстрата . Образование этанола в Крэбтри-положительных дрожжах в строго аэробных условиях сначала считалось вызванным неспособностью этих организмов увеличивать скорость дыхания выше определенного значения.

Question 17

Гликозилирование антител

Answer 17

Гликозилирование антител во многом зависит от концентрации различных
углеводов в среде, поскольку они действуют как предшественники пула нуклеотидных
производных сахаров, необходимого для гликозилирования. Различные концентрации
глюкозы могут оказывать существенное влияние на гетерогенность гликанов, что
особенно важно в процессах с подпиткой, когда для достижения заранее
определенного клинического результата необходимо последовательное
гликозилирование продукта.
стратегия полной
замены глюкозы другими сахарами, конечно,
позволяет добиться коррекции профиля
гликозилирования и снижения продукции
лактата, но также приводит к снижению
плотности клеток и титра белка.
в условиях, когда доступно
более одного источника углерода, клетки
отдают приоритет субстрату с самой высокой
скоростью транспорта из-за конкуренции
мембранных переносчиков.

Question 18

Метаболизм лактата

Answer 18

Регенерация NAD+
из NADH, необходима для продолжения работы гликолиза.
Окисление глицеральдегид-3-фосфата до пирувата инициируется глицеральдеги-3-
фосфатдегидрогеназой (G3PD), в результате генерируется АТФ и NADH, а зависит это
окисление от наличия цитоплазматического NAD+
. NAD+ не перемещается между
митохондриями и цитоплазмой, а количество цитоплазматического NAD+ ограничено.
В условиях высокого содержания глюкозы в клетке будет накапливаться
глицеральдегид-3-фосфат, если только цитоплазматический NADH не подвергается
постоянному повторному окислению.
Клетки окисляют цитоплазматический NADH комбинацией трех путей:
аспартатно-малатного челнока, глицерин-фосфатного челнока и во время превращения
пирувата в лактат. Последний путь активен как минимум на начальных стадиях роста

Question 19

Глицерин-фосфатный челнок

Answer 19

Цитоплазматическая глицерин-3-фосфатдегидрогеназа (цГФД) переносит пару
электронов от NADH к дигидроксиацетонфосфату (ДГАП), образуя глицерин-3-
фосфат (Г3Ф) и регенерируя NAD+
, необходимый для выработки энергии посредством
гликолиза.

Question 20

Аспартат-малатный челнок

Answer 20

Более сложным и более эффективным челночным механизмом является малатаспартатный челнок. Он переносит восстановленные эквиваленты
цитоплазматического NADH, образующегося при окислении G3P, в матрикс
митохондрий в виде малата. При этом он регенерирует NAD+
, который может
использоваться G3PD для поддержания гликолиза. Эта система частично управляется
глутамином.

Question 21

Лактатдегидрогеназа

Answer 21

ЛДГ может повторно окислять цитоплазматический NADH, превращая пируват
в лактат. Это расточительный процесс, ведущий к метаболическому тупику. NADH,
который не был окислен аспартат: малатным или глицерол: фосфатным челноком,
окисляется ЛДГ через окисление пирувата. Накопление лактата в системах клеточных
культур свидетельствует о том, что челноки неспособны повторно окислять весь
NAD+
, необходимый для поддержки катаболизма G3P.

Question 22

Лактатный сдвиг

Answer 22

Высокая концентрация лактата приводит к пагубным последствиям для роста и
продуктивности клеток. Одним из ключевых изменений, которые могут (должны)
произойти в ходе производственного цикла, является переход от продукции лактат к
его потреблению, хотя бывает и одновременное потребление глюкозы и лактата.
Важно отметить связь между потребления лактата и увеличением продуктивности,
следовательно метаболический сдвиг от производства лактата к его потреблению
может считаться маркером метаболической эффективности.

В потреблении лактата участвуют два ключевых белка: монокарбоксилатный
транспортер (MCT), через который лактат входит в клетку и выходит из нее в
совместном транспорте с Н+
, и лактатдегидрогеназа (LDH), которая превращает лактат
в пируват. Вторая идея основывается на том, что контроль над любым из этих белков
позволяет управлять метаболизмом лактата. Регуляция MCT происходит на
экспрессионном уровне, а активность МКТ полностью контролируется концентрацией
лактата и Н+
. Вначале концентрация лактата вне клетки низкая, поэтому весь лактат,
вырабатываемый клеткой, экспортируется. Подкисление цитозоля, происходящее в
результате гликолиза, также выводит лактат из клетки, создавая градиент рН через
плазматическую мембрану.
Добавление основания в среду повышает pH среды и позволяет лактату
достигать таких высоких концентраций в культуральной среде. Для того чтобы
началось потребление лактата, должно произойти одно из двух событий: либо
концентрация H+
внутри клетки должна упасть, и приток протонов по градиенту
концентрации будет переносить лактат вместе с ним, либо концентрация
внутриклеточного лактата должна упасть ниже концентрации внеклеточного лактата
настолько, чтобы он смог преодолеть градиент pH

Question 23

Подпитка для культуры

Answer 23

Фактически, большая часть биологических препаратов на основе клеток CHO
производится с использованием периодического процесса с подпиткой. Поскольку
базальные среды могут не содержать все специфические питательные вещества и
факторы роста, необходимые для поддержания роста на протяжении всего процесса, в
ходе культивирования к средам обычно регулярно добавляют подпитки, чтобы
обеспечить клетки дополнительными питательными вещества, факторами роста,
регуляторами метаболизма. Состав добавок обычно более сложен, чем базальной
среды, и многие из них включают дополнительные аминокислоты, витамины,
микроэлементы и другие добавки, которых нет в питательных средах.

Основные факторы, определяющие оптимальную подпитку культуры,
включают:
1. не допустить токсического эффекта;
2. поддержание желаемых посттрансляционных модификаций белков;
3. повышение жизнеспособности клеток и предотвращение апоптоза;
4. увеличение продолжительности жизни культуры;
5. способствование аккумуляции продукта, а не просто концентрации
клеток;
6. способствование аккумуляции высококачественного продукта, а не
просто количества продукта.

Question 24

Основные побочные продукты и их токсический эффект

Answer 24

Высокие
концентрации побочных продуктов метаболизма наносят ущерб росту клеток и
синтезу антител. Наиболее известными из них являются лактат и аммоний, однако
было выявлено и множество других.
измерение состава среды с помощью различных анализаторов метаболитов в
ходе всего процесса позволяет проводить количественный анализ и динамику
ключевых метаболитов и субстратов, присутствующих в питательной среде, что
позволяет получать данные о том, какие пути и реакции активны в клетке при
заданных условиях культивирования.

Question 25

Индикаторы клеточных процессов

Answer 25

Глюкоза
Основной источник
энергии для
жизнедеятельности клетки.
Субстрат для гликозилирования.
В процессе жизнедеятельности
клетки потребляют глюкозу.
Скорость потребления зависит от
концентрации клеток, активности метаболизма
Продукт метаболизма Лактат
CO2, H2O
Норма
Обычно 2-
10 г/л

Лактат Дополнительный источник
энергии для
жизнедеятельности клетки.
Субстрат для
гликозилирования
В высоких концентрациях
ингибирует клеточный рост
CO2, H2O ≤5,5 г/л

Глутамин Предшественник азотистых
оснований в ДНК, входит в
состав белков. Составляет
до 25% от всех
аминокислот в белке.
Деградация глутамина приводит
к образованию аммония и
глутамата
Глутамат,
NH4
+
≤10
ммоль/л

Глутамат Способен входить в TCA,
следовательно может
служить дополнительным
источником энергии в
клетке. Способен
превращаться в
аминокислоты
CO2, H2O
≤10
ммоль/л

Na+ Поддержание
осмотического давления

K
+ Катализатор при обмене
углеводов и белков

Изменение в концентрациях
натрия и калия вызывает
изменение осмоляльности
культуральной жидкости. При
увеличении концентрации клеток
в культуральной жидкости
содержание натрия постепенно
увеличивается, а калия
снижается (действие натрийкалиевого насоса).
Отношени
е Na+
к K+
Примерно
20:1

NH4
+ Является побочным
продуктом азотистого
обмена
В высоких концентрациях
ингибирует клеточный рост. При
увеличении концентрации клеток
в культуральной жидкости
постепенно увеличивается
содержание аммония. Влияет на
внутриклеточный рН, снижает
скорость роста клеток,
максимальную плотность клеток,
продуктивность рекомбинантных
белков, может изменить профиль
гликозилирования, увеличивает
скорость потребления глюкозы.
Большое количество аммония
находится внутри клеток,
поэтому при их гибели часто
увеличивается концентрация
аммония в среде
≤4 ммоль/л
На
поздних
стадиях
культивир
ования его
концентра
ция
увеличива
ется также
за счет
гибели
клеток и
может
достигать
10 ммоль/л

Осмоляльн
ость,
мОсм/кг.
Свидетельствует о
содержании осмотически
активных частиц в
культуральной жидкости
Изменение осмоляльности
связано с добавлением
питательных добавок, щелочи,
сахаров
В норме:
270 до 330
мОсм/кг,
на поздних
стадиях
культивирования
осмо
вырастает
до 450–550
мОсм/кг

Question 26

Лактат

Answer 26

Глюкоза служит основным источником углерода. Лактат является одним из
основных токсичных метаболитов, обнаруживаемых в центральном метаболизме.
Лактат подавляет рост клеток, индуцирует апоптоз и снижает титр рекомбинантных
терапевтических продуктов, что связано с понижением рН, а добавляемая щелочь, для
восстановления рН, приводит к нежелательному повышению осмоляльности.

Метаболизм лактата клеточноспецифичен, и получаемое количество сильно
зависит от состава среды, стадии культивирования и генетическими особенностями
клеточной линии. В биореакторе чистое производство лактата обычно наблюдается в
ходе фазы экспоненциального роста. Для уменьшения производства лактата
используется несколько вспомогательных стратегий. Классическим методом является
ограничение количества глюкозы в культуральной среде. Однако слишком низкая
концентрация глюкозы затормозит рост клеток, а также снизит титр антител. На
практике концентрация глюкозы часто поддерживается на уровне 1-6 г/л. Другой
вариант - использование вместо глюкозы альтернативные источники, но это чревато
замедлением роста и понижением продуктивности даже при больших концентрациях
этих углеводов.

Question 27

Аммоний

Answer 27

Основной
источник его образования - метаболизм глутамина.
Даже малые концентрации аммиака могут иметь
токсический эффект. Высокие концентрации
аммония приводят к таким последствиям, как
ингибирование роста клеток, ухудшение
продуктивности рекомбинантного белка, изменения
профиля гликозилирования.

Некоторые линии клеток, в том числе клетки CHO, производят
глутаминсинтетазу (ГС) - фермент, который катализирует синтез глутамина из
глутамата и аммиака. Если эндогенная активность глутаминсинтетазы достаточно
высокая, чтобы клетки пролиферировались в безглутаминовой среде, то можно
заменить глутамин глутаматом, что поможет уменьшить концентрацию аммония в
результате синтеза глутамина из аммония и глутамата. Также существуют линии CHO,
лишенные глутаминсинтетазы и для них необходимо наличие глутамина в среде

Question 28

Осмоляльность

Answer 28

Осмолярность определяется суммой содержания ионов на в 1л растворителя и
выражается в миллиосмолях на литр (мОсм/л). Осмометры же обычно измеряют
осмоляльность, выражающаяся в миллиосмолях на килограмм (мОсм/кг).
Осмолярность и осмоляльность часто приравниваются. Осмоль — это количество
молей вещества, которое способствует осмотическому давлению раствора. В
осмометре для измерения осмоляльности обычно используется депрессия точки
замерзания.
Внесение подпиток, добавок, в том числе гидрокарбоната натрия, изменяет
конечную осмолярность среды, что может негативно сказаться на росте клеток в
культуре. Желательно проверять осмоляльность ростовой среды после добавления
подпиток, а также проверять осмоляльность среды и подпиток после приготовления.
Осмоляльность связана как с регуляцией пролиферации клеток, так и с
продуктивностью рекомбинантных белков. Оптимальная осмоляльность для
большинства линий клеток млекопитающих должна находиться в диапазоне от 260 до
330 мОсм/кг. Более высокое или более низкое осмотическое давление нарушает
целостность клеточной мембраны и, соответственно, вызывает разрушение клеток.

Question 29

Гликозилирование

Answer 29

MAb представляют собой сложные белки и требуют правильную сборку и
посттрансляционные модификации. Хотя биологическая активность белков
закодирована в их аминокислотных последовательностях, на нее существенно влияют
посттрансляционные модификации, такие как дезамидирование, образование
дисульфидной связи и гликозилирование. Последнее является самой
распространенной посттрансляционной модификацией (около 50% всех белков нашего
организма гликозилировано).
Гликаны сперва синтезируются в виде предшественника на
мембранах эндоплазматического ретикулума и там же прикрепляются к строго
определенной аминокислотной последовательности уже синтезированного белка.
После этого начальный гликопротеин переносится в аппарат Гольджи, где он может остаться как есть либо претерпеть дальнейшие изменения с удалением ”лишних”
сахаридов и достройки до новой сахарной структуры.

вариации профиля гликозилирования влияют
на различные биологические процессы, такие как передача сигнала, сворачивание
белка, иммунный ответ. Поэтому гликозилирование считается критическим
показателем качества

Question 30

Факторы, влияющие на гликозилирование

Answer 30

На возможность постройки гликана будет влиять доступность ферментов,
материала (пула моносахаридов), кофакторов ферментов, времени прохождения в
тельцах Гольджи и тд. Одни лишь эти факторы — достаточно непредсказуемы и
зависят от генетического статуса клетки (генотипа и мутаций экспрессии генов), от
уровня экспрессии генов и от клеточного гомеостаза в данный момент времени. Всё
это взаимосвязано и может регулироваться как внутренними стимулами клетки, так и
факторами среды. Такая пластичность — настоящее испытание для биоразработки.
Сейчас даже нет исчерпывающих данных обо всех условиях, обеспечивающих
появление того или иного гликана, не говоря уже о предсказании и нацеленном
синтезе желаемых структур.
На гликановый профиль могут влиять рН, DO, pCO2, концентрация и
соотношения сахаров, специфические добавки к средам и накопление побочных
продуктов. Как правило, эти переменные влияют на биосинтетический механизм
внутри клеток, вызывая изменения активности гликозилирующих ферментов или доступность критических метаболических предшественников. Было показано, что
компоненты среды клеточной культуры являются основными параметрами,
ответственными за модуляцию профилей гликозилирования рекомбинантных белков.

Question 31

Иммуноглобулины

Answer 31

Иммуноглобулины — одна из самых больших фракций белков крови, напрямую
связанная с иммунитетом. Углеводная часть иммуноглобулинов G влияет как на их
стабильность, так и на биологические функции. Так через вариабельный Fab-фрагмент
антитела идет специфическое распознавание патогенного участка антигена, а
взаимодействие иммунных клеток с Fc-фрагментом сигнализирует иммунной системе
о дальнейших действиях. Оба эти фрагмента несут углеводные модификации, и это
влияет на особенности иммунного ответа.

Question 32

Цикл клеточного роста
эукариотических клеток

Answer 32

Фаза G1 (фаза роста 1) — клетки
индуцируют рост, сначала вырабатывая РНК и
белки, а содержание ДНК не меняется.

S-фаза (фаза синтеза) — синтез ДНК
протекает с репликацией ДНК, клетки имеют
переменное количество ДНК.

Фаза G2 (фаза роста 2) — клетки
завершают синтез ДНК и продолжают расти,
готовяться к митозу, сохраняя при этом
количество ДНК, вдвое превышающее
исходное.

М-фаза (митоз) — деление ядра и
цитоплазмы с образованием двух дочерних
клеток.

Question 33

С точки
зрения процесса культивирование рост клеток можно разделить на

Answer 33

1. латентная фаза (лаг-фаза)
2. фаза экспоненциального роста (лог-фаза).
3. стационарная фаза
4. фаза гибели
5. В ходе латентной фазы культура приспосабливается к новой среде, прежде
   чем начнется пролиферация. Слишком низкая начальная концентрация биомассы
   может удлинить латентную фазу, особенно в случае бессывороточного
   культивирования.
6. Затем культивирование переходит в фазу экспоненциального роста. Она
   характеризуется ростом с высокими скоростями и с высоким потреблением глюкозы и
   аминокислот, что приводит к накоплению лактата и аммония. Эта фаза может иметь
   различную продолжительность в зависимости от клеток и условий роста. Может быть
   довольно короткой в случае клеточных культур животного происхождения, тогда как
   микробные культуры могут расти экспоненциально в течение длительного периода,
   если нет ограничений, выраженных, например, в наличии питательных веществ или
   кислорода. Параметры биореактора также влияют продолжительность
   экспоненциальной фазы роста, что важно учитывать в производстве. Характерной чертой фазы роста является низкая продукция mAb. Переход от фазы роста к
   стационарной фазе определяет максимальную плотность жизнеспособных клеток
   (VCD), тогда как переход от стационарной фазы к фазе гибели определяет
   долговечность культуры.
   Лучшее понимание основных механизмов, вызывающих эти переходы, может
   быть использовано для разработки процессов культивирования, в которых клетки
   растут до более высоких плотностей или остаются жизнеспособными в течение более
   длительного периода времени, что и то, и другое приведет к увеличению объемной
   продуктивности моноклональных антител. На этапе масштабирования нужно
   обеспечить генетическую и фенотипическую стабильность и высокую
   жизнеспособность, для этого поддерживают клетки на экспоненциальной фазе роста.
7. После этого наступает период уменьшения скорости роста, когда новые
   клетки образуются параллельно с гибелью старых, увеличения количества клеток
   практически не происходит, но клетки еще нуждаются в источниках энергии для
   поддержания своей жизнедеятельности и синтеза белков.
   Стационарная фаза характеризуется сравнительно низким потреблением
   источников углерода и азота и сниженной гликолитической активностью. Напротив,
   потоки цикла ТСА увеличиваются во время этой фазы, при этом уже потребление
   лактата из внеклеточной среды во многом обеспечивает пул ацетил-КоА. Было
   показано, что высокая активность TCA и пентозофосфатного пути связана с пиковой
   выработкой моноклональных антител. Именно поэтому стационарная фаза
   наиболее интересная с точки зрения синтеза рекомбинантных белков. Параметры
   биореактора также влияют продолжительность стационарной фазы роста.
8. Последняя фаза является
   фазой гибели. К гибели клеток
   приводит ряд факторов, важнейшим
   из которых является исчерпание
   запасов энергии в клетке и
   накопление токсический продуктов
   метаболизма. Наблюдается резкое
   экспоненциальное уменьшение числа
   жизнеспособных клеток.
   В процессе биопроизводства
   важной целью является поддержание
   культуры в состоянии максимальной
   продуктивности с высокой
   жизнеспособности клеток, высокой
   пиковой плотностью. В случае
   образования продукта значительный
   прирост продуктивности может быть
   получен за счет удлинения
   стационарной фазы. Однако при
   проектировании процесса
   культивирования всегда следует
   учитывать его последствия для процесса выделения целевого продукта. Очень
   поздний сбор может привести к проблемам в процессе выделения целевого продукта
   и/или ухудшить качество продукта.

Question 34

Гибель клеток

Answer 34

Гибель клеток уменьшает общий выход продукта и усложняет этапы очистки.
Клеточная гибель бывает двух типов: непредсказуемая и запрограммированная.
Наиболее часто клетки погибает посредством некроза и апоптоза.
Цель биопроизводства состоит в ингибировании, замедлении наступления
гибели клеток, и поддержании высокой жизнеспособности клеточных линий (обычно
выше 90-95%) в течение продолжительного времени для максимального увеличения
продуктивности, а также облегчения очистки в процессе выделения целевого
продукта, так как культура клеток с высокой жизнеспособностью образует гораздо
меньше клеточного дебриса, что упрощает процесс очистки.

Question 34

Некроз

Answer 34

Некроз является внезапной
гибелью, вызываемой
неблагоприятными условиями,
которые наносят физическое
повреждение клетке
(экстремальных скачки значений
рН температуры, давления).
Омертвевшая клетка теряет
способность поддерживать
осмотическое давление в
клеточной мембране, что
приводит к разбуханию клетки с
последующей потерей
целостности мембраны

Question 35

Апоптоз

Answer 35

Апоптоз является
запрограммированной, генетически
регулируемой гибелью. Примерами
явлений, которые могут вызвать
апоптоз, являются нехватка
питательных веществ, нехватка
кислорода, аккумулирование
токсичных метаболитов.
Апоптические клетки обычно можно
наблюдать на последних стадиях
периодического культивирования.
При апоптозе происходит активация
каспаз, которые расщепляют ядерные белки, белки плазматической мембраны и
митохондриальные белки, что в итоге приводит к гибели клеток. Фрагменты белков,
нуклеиновых кислот собираются в везикулы — апоптозные тельца. В живом
организме эти везикулы легко перевариваются фагоцитами и удаляются без
воспалительной реакции. Однако при культивировании клеток в лабораторных и
производственных условиях фагоциты отсутствуют и апоптозные тельца остаются в
культуральной среде, пока не будут удалены в ходе процессов очистки при выделении
целевого продукта. Со временем везикулы могут перейти на вторую стадию апоптоза,
когда происходит нарушение целостности мембраны и происходит высвобождение
содержимого, которое может негативно сказываться на других, здоровых клетка.

Question 36

Некроптоз

Answer 36

Некроптоз представляет собой запрограммированную высокоиммуногенную
гибель клеток, похожую на некроз с точки зрения морфологических признаков, но
клетки умирают контролируемым образом.

Question 37

Выбор клеточной линии

Answer 37

Выбор подходящего хозяина для биологического синтеза химических
соединений или белков является решающим фактором в производстве. Микробные
культуры подходят для производства небольших молекул, таких как ферменты и
прочие небольшие пептиды. Производство больших и сложных белков, таких как
моноклональные антитела, затруднено из-за отсутствия у них механизма
гликозилирования. Клетки млекопитающих обладают рядом преимуществ, наиболее
важным из которых является их способность продуцировать белки со сложными
посттрансляционными модификациями (ПТМ), которые аналогичны тем,
которые продуцируются у человека. Это дает системам экспрессии клеток
млекопитающих преимущество, несмотря на их медленный рост и высокие требования
к среде.
Наиболее часто используемыми клеточными линиями млекопитающих являются
HEK (клетки эмбриональной почки человека) и CHO. Клетки CHO являются
предпочтительным выбором в фармацевтических исследованиях и разработках.
В истории производства моноклональных антител клетки CHO использовались в
лабораторных целях еще с 1919 года и были наиболее часто используемыми клетками
млекопитающих.

Question 38

Клеточный банк

Answer 38

Одним из важных преимуществ использования серийно культивируемых клеток
для биотехнологического производства является возможность иметь
охарактеризованный источник для каждой производственной серии, т.е. иметь банк
клеток. Также, к сожалению, клетки млекопитающих уязвимы к генетическим
вариациям, если их постоянно поддерживать путем серийного пассажа, этого можно
избежать путем криоконсервировации и хранения в клеточном банке в стабильном
состоянии при сверхнизких температурах до тех пор, пока они не потребуются.
Термин «банк клеток» относится к хранению клеток с определенным геномом для
продления их жизнеспособности, чистоты и генетической стабильности.
Производители могут создавать свои собственные банки клеток или получать их из
внешних источников.
Различные типы банков
клеток классифицируются в
зависимости от их статуса.
Обычно это исследовательский
банк клеток (ИБК), главный
банк клеток (master cell bank,
MCB, ГБК) и рабочий
банк (working cell bank, WCB,
РБК).
Процесс начинается с ИБК — криоконсервированной моноклональной
клеточной линии, которая еще не полностью охарактеризована. Они служат ценным
ресурсом в ряде научных областей, включая биотехнологию и фармацевтическую
промышленность. Если эти клетки в ходе исследований будут сочтены пригодными
для использования, их можно будет использовать в качестве основы главного банка
клеток.
Как правило, сначала создается ГБК, обычно непосредственно из исходного
клона или из предварительного банка клеток, полученного из исходного клона.
Для инженерных продуктов клетки в ГБК уже
трансформированы. В некоторых случаях существует необходимость создания
отдельных банков клеток - для вектора экспрессии и клеток хозяина. Главный банк
клеток используется для получения всех рабочих банков клеток. Исходной точкой для
оценки возраста клеток в процессе производства служит момент оттаивания
криопробирок с ГБК.
По мере необходимости из главного банка отбирают очередную пробирку,
размораживают, культивируют находящиеся там клетки и получают рабочий банк -
также сотни пробирок, которые хранятся в другом месте и являются основой для
производства. Полученную культуру после взятия из места хранения в главный банк
клеток не возвращается. Именно РБК, как правило, используется непосредственно для
нужд производственного процесса, храниться, как правило, в резервуаре с жидким
азотом при температуре –70 °C или ниже.
Свежеприготовленный РБК должен быть соответствующим образом
квалифицирован путем установления его характеристик и проведения испытаний.
Допускается использование одноуровневого банка, состоящего только из
ГБК и не содержащего РБК, например, если для производства препарата каждый год
требуется относительно небольшое число контейнеров с клетками.
Также в отдельную категорию можно отнести послепроизводственные клетки
(ПК) - клетки, культивированные до 10 или более удвоений популяции свыше
максимального уровня удвоения, используемого для производства (производство
однократного сбора продукта), или клетки, культивированные в период, который
превышает используемую продолжительность культивирования на одну треть
(производство многократного сбора продукта. В связи с этим создается
послепроизводственный банк клеток (ПБК).
Клетки различных уровней, особенно ГБК, необходимо исследовать на наличие
посторонних агентов (вирусных, бактериальных, грибковых, микоплазменных, а также
клеток других клеточных линий). Особое внимание следует обращать на вирусы,
которые часто контаминируют те виды животных, от которых получена линия клеток.
Для каждого ГБК производители должны проводить испытания клеточного
субстрата на подлинность и чистоту однократно, а также однократное испытание
стабильности в ходе культивирования клеток для каждого подлежащего регистрации
лекарственного препарата. Кроме того, испытания на чистоту и подлинность, следует
проводить однократно для каждого РБК.
ГБК и РБК также обязательно тестируются на генетическую стабильность в
течение определенного количества поколений клеток, чтобы обеспечить нужные
параметры клеточной линии при производстве. Для этого клетки выращивают в
культуральной среде, периодически пересевая и секвенируя кДНК целевого гена.

Question 39

Последствия контаминации

Answer 39

Последствия контаминации
 Получение продукта неизвестного качества;
 Потеря клеточного материала или продукта целиком;
 Невоспроизводимые или неверные данные экспериментов;
 Потеря времени и денег;
Визуально исследуйте среду на наличие макроскопических признаков
микробной контаминации. К ним относятся необычные сдвиги рН, DO, помутнение
или наличие частиц, нехарактерного запаха. С помощью микроскопа проверьте среду
на наличие признаков микробного загрязнения, а также морфологию клеток.

Question 40

Виды контаминации

Answer 40

Микоплазмы
Грибы
Дрожжи
Вирусы
Бактерии

Question 41

Микоплазмы

Answer 41

Особенности:
1. Не имеют клеточной стенки.
2. Размеры от 0.15 до 1.5 мкм.
3. Из-за малого размера обнаружение в растворах затруднено.
4. Микоплазмы не вызывают помутнения питательной среды.
5. Проходят через обычные фильтры диаметром 0.22 благодаря
строению плазматических мембран и малыми размерами.
6. Не изменяют pH среды.
7. Микоплазмы растут в основном в связи с мембранами клеток
млекопитающих.
8. Могут сосуществовать с клетками эукариот, не снижая их
жизнеспособность.
9. Могут вызывать изменения характеристик роста клеток,
ингибировать метаболизма, нарушать синтез нуклеиновых кислот, а также
могут изменять скорость трансфекции и восприимчивость к вирусам.
10. Устойчивы к широкому спектру применяемых антибиотиков.
Наиболее вероятным источником микоплазменной контаминации на
предприятии является зараженная клеточная культура, что подчеркивает
необходимость тщательного скрининга всех новых клеточных линий и
соответствующих протоколов карантина и хранения всех поступающих клеточных
культур. Микоплазмы и другие микробы распространяются аэрозольно-капельным
путем при выполнении обычных процедур культивирования клеток, включая
пипетирование и дозирование жидкостей среды.

Микоплазмы крадут необходимые питательные вещества и вызывают различные
формы повреждения клеток, что, в свою очередь, может привести к значительным
ошибкам в результатах лабораторных исследований. Считается, что в настоящее
время большое количество клеточных линий заражено микоплазмой. Основная
проблема заключается в том, что, несмотря на сильное микробное загрязнение
(обычно 107
– 108
клеток/мл) клеточные культуры часто выглядят нормальными как
при макроскопическом, так и при микроскопическом осмотре. Микоплазму обычно
выявляют методом флуоресцентного окрашивания ДНК.

Question 42

Грибы

Answer 42

Особенности:
1. Образуют споры.
2. Некоторые формы продуцируют микотоксины, оказывающие
токсическое воздействия на клетки млекопитающих.
3. Грибы образуют тонкий нитевидный мицелий, а иногда и более
плотные скопления спор. Их легко наблюдать под микроскопом с малым
увеличением, на поздних стадиях можно увидеть без увеличения.
4. Время удвоения гораздо выше бактериального
5. На ранних стадиях заражения грибы обычно не вызывают изменений
pH среды.

Question 43

Дрожжи

Answer 43

Группа одноклеточных грибов, утративших мицелиальное строение в связи с
переходом к обитанию в жидких и полужидких, богатых органическими веществами
субстратах.
Особенности:
1. Типичные размеры дрожжевых клеток составляют 3—7 мкм в
диаметре, некоторые виды способны вырастать до 40 мкм.
2. В аэробных условиях круг усваиваемых субстратов широк:
углеводы, а также жиры, углеводороды, ароматические и одноуглеродные
соединения, спирты, органические кислоты.
3. На ранних стадиях заражения дрожжи обычно не вызывают
изменений pH в среде, но по мере их увеличения среда для становится
мутной, а pH может стать более кислым.
Дрожжи под микроскопом будут выглядеть как округлые или почкующиеся
частицы

Question 44

Вирусы

Answer 44

Особенности:
1. Это неклеточные инфекционные агенты, которые могут
воспроизводиться только внутри живых клеток. Вирусы поражают все
типы организмов, от растений и животных до бактерий и архей.
2. Размеры большинства исследованных вирусов составляют 200–300
нм, из-за чего не видны под обычным микроскопом.
3. Часто не оказывают заметное влияние на клеточный рост, однако
некоторые инфекции могут быстро убить культуру.
4. Полное отсутствие основного и энергетического обмена и
отсутствием аппарата трансляции (синтеза белка).
Такая контаминация может быть результатом загрязнения исходных клеточных
линий или случайной контаминации вирусом в процесса производства и может иметь
серьезные клинические последствия.

Разработано 3 основных взаимодополняющих подхода к контролю
потенциальной вирусной контаминации биотехнологических продуктов:
1. отбор и испытание исходной клеточных линий и другого сырья,
включая компоненты среды, на отсутствие контаминации вирусами.
2. испытания продукта на соответствующих этапах процесса
производства на отсутствие контаминации инфекционными вирусами.
3. удаление и инактивация вирусов на более поздних этапах
производства;

По сравнению с другими инфекциями вирусные контаминанты в культурах
клеток представляют более серьезную угрозу из-за сложности их обнаружения и
отсутствия методов лечения пораженных культур клеток. Более того, вирусы
обладают способностью интегрировать свой геном в клетку-хозяина, что приводит к
постоянному производству новых вирусных частиц. Это потенциальный риск для
здоровья операторов и может стать источником горизонтальной передачи вируса в
другие клеточные линии.
К сожалению, общие тесты для системной оценки вирусных контаминантов
довольно сложны и ненаправлены. Первым признаком проблемы может быть снижение количества жизнеспособных клеток или снижение производства. Методы
массового параллельного секвенирования позволяют обнаруживать даже неизвестные
вирусы на очень низких уровнях, что позволяет далее применить более специфичные
методы ПЦР. Электронная микроскопия позволяет получать изображения с высоким
разрешением, обеспечивая тем самым немедленный обзор фактического статуса
клеточной инфекции и формы вирусов. Наблюдаемая морфология и размер позволяют
провести немедленную предварительную классификацию вирусного типа.
(А) Общая структура ретровируса. Ретровирус представляет собой частицу с
оболочкой диаметром около 100 нм, которая состоит из гликопротеина, инкапсулированного
липидами, полученными из плазматической мембраны клеток-хозяев во время процесса
почкования. Геном ретровируса состоит из двух идентичных одноцепочечных молекул
РНК. Группоспецифические антигены (gag) являются основными компонентами вирусного
капсида, а обратная транскриптаза (pol) необходима для синтеза вирусной ДНК. (B) Наличие
неспецифического ретровируса в культуре клеток по данным электронно-микроскопического
анализа. Ретровирусные частицы можно обнаружить в культуральной среде и в
цитозоле. (C, D) Изображения ретровирусов с большим увеличением показывают типичную
сферическую структуру. (E) На этом электронномикроскопическом изображении показан
процесс почкования, при котором ретровирусная частица приобретает свою оболочку,
распространяясь через плазматическую мембрану хозяина

Question 45

Вирусная фильтрация и инактивация

Answer 45

Очистка полупродукта от вирусов осуществляется с помощью удерживающей
вирус фильтрации, инактивация оболочечных вирусов с помощью низкого pH и/или
обработки детергентом, а также с помощью стадий хроматографии. Один этап
очистки обычно не считается надежным в отношении удаления широкого спектра
различных вирусов.

Существует несколько методов инактивация вирусов. Наиболее
распространенные из них:
 методы с применением низкого уровня pH. Особенно часто применяются к
моноклональным антителам (mAbs)
 методы с применением растворителя или ПАВ. Они обычно используются
для полисахаридов.
Реже используются такие методы инактивации вирусов, как пастеризация,
применение парообразного теплоносителя и прочее.

Question 46

Метод вирусной инактивации с применением низкого
pH

Answer 46

В данном методе на процесс инактивации влияют такие характеристики, как pH,
длительность воздействия, температура, содержание белка и растворителя или буфера.
Необратимая денатурация и эффективное уничтожение многих вирусов возможны при
pH не выше 5,0–5,5. Однако для эффективной инактивации ряда вирусов необходим
уровень pH в диапазоне 3,5–4. Стоит учитывать, что при длительном воздействии pH в
этом диапазоне также может произойти инактивация или повреждение продукта, в
частности белков или ферментов. По сравнению с другими белками иммуноглобулины
(включая моноклональные антитела IgG и IgM) обычно менее восприимчивы к pH 3,5–
5,5. Инфекционная вирусная нагрузка снижается до эффективного минимума при
выдерживании в условиях инактивации в течение достаточно длительного времени.

Question 47

Обработка растворителем/ПАВ для инактивации
вирусов

Answer 47

Методы с растворителем или ПАВ чаще всего используются для инактивации
вирусов в оболочке. Применяемые реагенты оказывают незначительное влияние на
лабильность терапевтических белков или антител, тогда как некоторые методы с
применением низкого pH могут вызывать их денатурацию или изменение структуры.
При использовании методов инактивации с растворителем/ПАВ необходимо учесть,
что все добавленные растворители должны быть удалены из будущего лекарственного
вещества, что не требуется для методов с низким pH.
Однако частицы вирусов необходимо будет удалить физическим способом.
Физическая фильтрация вируса с помощью нанофильтров является одним из наиболее
эффективных методов, которая удаляет как вирусы с оболочкой, так и вирусы без
оболочки.

Question 48

Бактерии

Answer 48

Особенности:
1. Одноклеточные микроскопические организмы. Типичные размеры
бактериальных клеток в среднем составляют 0,5—5 мкм.
2. Могут образовывать споры.
3. В большинстве случаев бактериальная контаминация
происходит в течение 12–24 часов и, как правило, заметна невооруженным
глазом.
4. Обычно приводят к резкому снижению pH и DO. Типичная
клеточная культура животного происхождения со средней концентрацией
биомассы может поглотить весь имеющийся кислород в течение часа, если не
добавлять новый, бактериальные культуры могут потребить его в течение
нескольких секунд, что может служить индикатором контаминации.
Резкое падение значений DO и pH наблюдается, когда бактериальная
нагрузка превышает возможности управления процессом биореактора.

Пример резкого падение DO примерно через 3 часа после контаминации
2л биореактора. Несмотря на максимальный поток кислорода DO не
увеличивается.
Пространство между клетками млекопитающих под микроскопом будет
выглядеть зернистым и может мерцать от движения бактерий. Кроме того,
зараженная культура может помутнеть и на поверхности ростового сосуда
может образоваться небольшая пленка, которая рассеивается при перемещении
сосуда.
Для предотвращения перекрестного загрязнения культур не следует
использовать одни и те же бутыли со средой и реагентами при работе с различными
культурами клеток, в БББ не стоит одновременно работать с несколькими клеточными
линиями. Кроме того, пипетки, имевшие контакт с флаконами и колбами, не следует
повторно использовать для отбора среды из соответствующих емкостей.

Question 49

Стерилизация

Answer 49

Стерилизация - совокупность физических и химических способов полного
освобождения объектов внешней среды от вегетативных и покоящихся (споровых)
форм микроорганизмов.
Асептика может включать влажную уборку помещений, обработку их
ультрафиолетовыми лучами, антисептическими средствами, использование
стерильных инструментов, сред, технологической одежды, подачу стерильного
воздуха и пр. Следовательно, комплекс мер, обеспечивающих асептику
биотехнологических процессов, включает: механическую, физическую и химическую
защиту биообъекта и среды его обитания, а при необходимости – и конечный продукт.
К механической защите относятся: удаление механических примесей, например, из
воздуха, культиваторов, герметизация оборудования, изоляция узлов и соединений; к
физической – обработка воздуха и поверхностей приборов и аппаратов
ультрафиолетовым светом, кипячение, стерилизация паром под давлением, обработка
ультразауком; к химической – обработка поверхностей химическими антисептиками.

Question 50

Химическая стерилизация

Answer 50

Химическая дезинфекция обычно является предпочтительным методом
обеззараживания поверхностей и мебели. Аэрозоли перекиси водорода, диоксида
хлора, глутаральдегида, параформальдегида, оксида этилена и надуксусной кислоты
используются в некоторых лабораториях для обеззараживания боксов
биобезопасности или инкубаторов.
 Спирт является одним из наиболее широко используемых
дезинфицирующих средств.
 Они бактерицидны и фунгицидны, но не спороцидны; некоторые
оболочечные вирусы также уничтожаются.
 Бактерицидная сила спирта прогрессивно возрастает с увеличением
молекулярной массы спирта.
 Этиловый спирт в концентрации от 50 до 90% эффективен против
вегетативных или неспорообразующих клеток.
 Метиловый спирт менее бактерициден по сравнению с этиловым
спиртом, кроме того, он очень ядовит. Высшие спирты — пропиловый, бутиловый,
амиловый и др. — более бактерицидны, чем этиловый спирт.

Механизм действия спиртов
 Спирты проявляют свою противомикробную активность, денатурируя
белки микробных клеток.
 Спирты также являются растворителями липидов и, следовательно, могут
повреждать липидные комплексы в клеточной мембране.
 Они также действуют как обезвоживающий агент.

Question 51

Физическая стерилизация

Answer 51

1 Автоклавирование
Самый надежный способ стерилизации - автоклавирование. Стерилизующее
действие автоклава обусловлено контактом насыщенного пара под давлением с более
холодными объектами, что приводит к конденсации пара в воду и сопровождается
выделением тепла, повышающего температуру стерилизуемого объекта. Но жидкость
при этом не начинает кипеть. В зависимости от стерилизуемых материалов
температура насыщенного пара устанавливается от 110° до 138°С, давление от 0,4 до
2,5 атмосфер, экспозиция от 30 до 60 минут. Простые питательные среды,
физиологический раствор, дистиллированную воду, стеклянную посуду, одежду
стерилизуют при режиме 1 атмосфера (121°С) 15- 30 минут. Чувствительные температуре материалы, а также сахара, витамины, аминокислоты и некоторые другие
соединения стерилизуют при более низком давлении (0,4-0,5 атм.).
2 Стерилизация растворов фильтрованием
Стерилизация веществ, не подлежащие автоклавированию, к которым относятся
растворы белков, витаминов, сахаров и некоторых других, осуществляется через
стерилизующие фильтры с размером пор 0,22 мкм (или менее). Эти фильтры
задерживают бактерии, грибы, но не все вирусы и микоплазмы.
Выделяют:
1. глубинные фильтры.
2. мембранные фильтры.
Глубинные фильтры состоят из относительно толстого фильтрующего материала
и обычно имеют номинальный размер пор >1 мкм. Благодаря объему они улавливают
большое количество частиц внутри своей пористой структуры. Мембранные фильтры
обычно состоят из полимеров, прошедших химическую обработку, в результате чего
образуются высокопористые тонкие пленки с микроскопическими
порами. Мембранные фильтры обычно имеют абсолютный размер пор <1 мкм.

Характеристика мембранного фильтра
 Химическая совместимость: Материал фильтра должен быть совместим с
химической природой фильтруемых жидкостей и растворенных веществ, чтобы
избежать структурных повреждений.
 Смачиваемость: Гидрофильные мембраны легко смачиваются водой и
предпочтительны для фильтрации водных растворов. Гидрофобные мембраны
рекомендуются для фильтрации газов и вентиляции.
 Размер пор:
o 0,1 мкм: удаление микоплазмы
o 0,20–0,22 мкм: удаление бактерий и спор
o 0,45 мкм: осветление водных растворов и органических растворителей.
o 0,8 мкм: удаление крупных частиц.

Question 52

Гидрофобные и гидрофильные фильтры

Answer 52

Одним из наиболее важных факторов, которые следует учитывать, является
смачиваемость мембраны. Тест на смачиваемость — это процедура, используемая для
демонстрации того, является ли мембрана гидрофильной или гидрофобной. При
контакте с поверхностью капля жидкости растекается по поверхности или остается
сферической. Угол между жидкостью и поверхностью – контактный угол.
Контактный угол <90° указывает на то, что поверхность гидрофильна, а угол >90°
указывает на то, что поверхность гидрофобна.
1) Гидрофобные мембранные фильтры
Когда гидрофобная мембрана вступает в контакт с водой, поверхностное
натяжение вытесняет воду из пор и мембрана становится барьером для потока
воды. Из-за своей способности отталкивать воду и противостоять смачиванию водой
гидрофобные мембранные фильтры обычно используются в качестве вентиляционных
фильтров, для газоотвода.
2) Гидрофильные мембранные фильтры
После смачивания гидрофильная мембрана не пропускает воздух или другие
газы в больших количествах, если только они не применяются под давлением. Они
включают осветление образцов, стерилизация.

Question 53

Материал мембраны

Answer 53

Мембраны из поливинилидендифторида
(PVDF). Обладают очень низким связыванием с
белками, широкую химическую совместимость и
наоборот. Подходит для фильтрации биологических
растворов.

Мембраны из полиэфирсульфона (PES). Устойчивы к кислотным и
щелочным растворам. Обычно используются в качестве альтернативы целлюлозным
мембранам и обеспечивают быстрый поток, высокую фильтрующую способность и
низкое связывание белков, оставаясь при этом бактерицидными. Подходит для
фильтрации биологических растворов.
Мембраны из нейлона и полиамида. Нейлоновая
фильтрующая мембрана имеет внутреннюю опору из
инертного полиэстера, что придает ей дополнительную
прочность и стабильность. Используются для фильтрации
водных и органических растворов для использования в
ВЭЖХ и других аналитических методах. Могут иметь
высокую степень связывания с белками и малыми
молекулами и не рекомендуются для стерилизации
биологических образцов.
Мембраны из политетрафторэтилена
(PTFE). Обладают высокой прочностью и широкой
химической совместимостью и обычно используются
для очистки водных растворов, органических
растворителей и агрессивных жидкостей. Гидрофобные
мембраны из PTFE используются для фильтрации газов
(задерживают частицы до 0,1 микрона).
Мембраны из ацетата целлюлозы (CA).
Гидрофильная мембрана с низким уровнем
связывания. Подходят для фильтрации биологических
жидкостей, имеют очень низкую степень связывания с
белками.
Мембраны из смешанных эфиров целлюлозы
(MCE). Не имеют отдельного опорного слоя,
хрупки. Мембраны MCE демонстрируют
большее связывание с белками, чем мембраны
CA. Однако мембраны MCE имеют тенденцию иметь более однородную пористую
структуру и более высокую скорость потока фильтрации.
Для фильтрации питательных сред, подпиток чаще используют мембранные фильтры
CA и PES, для фильтрация газов и вентиляции - мембранный фильтр из PTFE.

Question 54

Стерилизация УФ облучением

Answer 54

Ультрафиолетовый компонент солнечного света является главной причиной
гибели микробов в наружном воздухе. Смертность микроорганизмов на открытом
воздухе достигает 90–99 %, но зависит от вида микроорганизма. Споры и некоторые
виды бактерий окружающей среды имеют стойкость к воздействию солнечного света
и могут переносить длительное облучение светом без особого вреда своему организму.
Искусственные источники ультрафиолетового излучения (УФИ) используют гораздо
более сконцентрированные лучи, оказывая на микроорганизмы как летальное, так и
мутагенное воздействие.
Биофизическое действие УФ излучения на генетический или функциональный
аппарат бактерий выглядит следующим образом: излучение вызывает
деструктивномодифицирующее повреждение ДНК, нарушает клеточное дыхание и
синтез ДНК, что приводит к прекращению размножения и лизису микробных клеток.
Сила проникновения ультрафиолетовых лучей невелика, тонкий слой стекла
достаточен для того, чтобы не пропустить их. Если микроорганизмы и частицы пыли
расположены в один слой, при многослойном расположении верхние защищают
нижележащие, защитная оболочка вокруг бактерильной клетки препятствует
достижению антимикробного действия.

Question 55

Типы биореаторов

Answer 55

Существует две основные конструкции биореакторов: с мешком на качающейся
платформы и с мешком или стеклянным корпусом со встроенной магнитной
мешалкой. Первым одноразовым биореактором является волновой биореактор.
Используемое в нем качающееся движение усиливает массоперенос на границе раздела
воздух-жидкость и обеспечивает перемешивание.
Другим распространенным биореактором является биореактора с мешалкой.
Лабораторные реактора имеют высокую степень
управляемости параметрами процесса, имитируя среду крупномасштабного биореактора. Пробирки, микротитровальные планшеты и встряхиваемые колбы,
широко используемые при разработке процессов, лишены этой важной характеристики.
Несмотря на многообразие конструкций биореакторов, все они должны
обеспечить максимально гомогенную среду и удовлетворить потребности клеток в
питании для достижения надежного и максимального роста и продуктивности клеток в
стерильных условиях. Поэтому биореакторы должны иметь:
 подвод к каждой клетке в достаточном количестве всех питательных
веществ;
 отвод от клеток продуктов метаболизма (как минимум газов);
 поддержание оптимальных рабочих параметров: аэрирования,
перемешивания, ph, температуры в каждой точке;
 высокий уровень автоматизации процесса культивирования, техники
безопасности и условий труда операторов.
Для выполнения этих требований каждый реактор должен быть снабжен
следующими системами:
 подачи жидкостных потоков в аппарат;
 ввода и вывода газовых потоков;
 аэрирования среды;
 перемешивания;
 возможностью пеногашения;
 термостатирования;
 вывода жидкости из аппарата (как минимум для отбора проб);
 системой контроля и регулирования параметров процесса.

Question 56

Типы процессов

Answer 56

Режимы работы биореактора. (A) Периодический - питательные вещества подаются
только в начале процесса. После этого последующая подача не производится, а
рабочий объем остается постоянным; (B) Повторяющаяся партия – в этом
полупрерывистом режиме после начальной фазы часть среды циклически
пополняется свежей средой без сбора клеток, а рабочий объем, остается
постоянным; (C) Партия с подпиткой – во время культивирования клетки
снабжаются свежими питательными веществами; (D) Перфузия – к культуре
непрерывно добавляют свежую среду, а отработанную среду непрерывно удаляют с
той же скоростью потока.

Question 57

Биопроцесс без подпиток (Периодический) (Batch
processes)

Answer 57

При периодическом процессе все питательные вещества подаются в начале
выращивания, без добавления их в последующем биопроцессе. В течение всего
биопроцесса не добавляются никакие дополнительные питательные вещества – только
контролируются такие параметры, как газы, pH (добавлением кислоты/СО2 и
основания), то есть это закрытая система. Биопроцесс длится до тех пор, пока
питательные вещества не будут израсходованы. Обычно запускаются при
максимальном рабочем объеме. В течение всего времени работы биореактора
питательные вещества постепенно истощаются, а токсичные побочные продукты
накапливаются внутри сосуда. В определенный момент рост клеток прекращается, а доля жизнеспособных
клеток снижается, поскольку питательные вещества расходуются, а токсичные
метаболиты накапливаются. Эта стратегия подходит для быстрых экспериментов,
таких как характеристика штаммов или оптимизация питательной среды.
Продолжительность серийного процесса может составлять около 7 дней.

В начальной лаг-фазе количество живых клеток увеличивается
лишь медленно, что приводит к умеренному, но устойчивому поглощению
источника углерода. Потребление кислорода увеличивается во время фазы
экспоненциального роста, пока не превысит возможное поступление кислорода. Как
только источник углерода истощается, начинается стационарная фаза, за которой
следует фаза отмирания, во время которой количество живых клеток резко
уменьшается.

Преимущества периодической культуры:
 Короткая продолжительность
 Меньше шансов загрязнения, поскольку питательные вещества не
добавляются.
 Легче управлять
Недостатки включают в себя:
 Низкий выход продукта
 Низкая концентрация клеток

Question 58

Биопроцесс с подпиткой (Fed-batch)

Answer 58

Культура с подпиткой представляет собой модифицированную версию
культуры периодического действия. В этом случае в культуру подаются питательные
вещества для поддержания их постоянной концентрации. При добавлении свежих
веществ и разбавлении токсичных побочных продуктов клетки дольше сохраняют
жизнеспособность и процесс может работать в течение 2–3 недель.
Стратегии кормления по принципу Fed-batch предполагают хорошее понимание
клеточного метаболизма и скорости окисления клетками питательных веществ.
Можно поддерживать высокие концентрации субстратов, что приводит к увеличению
плотности клеток, однако со временем происходит накопление токсичных
метаболитов, которые начинают подавлять рост и продуктивность клеток.
Биореактор инокулируется при меньшем рабочем объеме, который часто
является минимальным рабочим объемом сосуда. Клетки культивируются без
подпитки в течение короткого времени, пока не будут достигнуты определенные
критерии, позволяющие начать подачу подпиток. Обычно субстрат перекачивают из
флакона или мешка в культуральный сосуд через силиконовую трубку. Оператор
может либо вручную установить подачу в любое время, либо добавлять питательные
вещества при соблюдении определенных условий, например, при достижении
определенной концентрации биомассы или при исчерпании питательных веществ.

Как правило, подпитка начинается в экспоненциальной фазе, чтобы
предотвратить исчерпание источника углерода и других необходимых веществ.
Дополнительно может вноситься добавка глюкоза, когда ее концентрация в среде
низкая. Расчеты по добавлению подпиток основаны на конечном или максимальном
рабочем объеме. Обычно в биореактор периодического действия ежедневно или через
день подается от 3 до 5 % от общего рабочего объема емкости.
Организмы
остаются в длительной экспоненциальной фазе (толстая серая линия и пунктирная
серая линия). Это также означает, что количество потребляемого кислорода
увеличивается, поэтому количество растворенного кислорода в среде уменьшается
(толстая синяя линия по сравнению с пунктирной синей линией).

Преимущества периодической культуры с подпиткой:
 Увеличивает выход продукта за счет повышения количества клеток
и продления их жизнеспособности
 Может использоваться для управления экспрессией генов и
активностью ферментов путем смены субстрата.
 Возможность использовать различные стратегии кормления для
достижения максимальной продуктивности
Недостатки:
 Накапливаются ингибирующие агенты и токсины
 Обеспечивает еще одну точку проникновения загрязнений.
 Может привести к высокой плотности мертвых клеток и клеточного
мусора, с которыми трудно справиться на последующих этапах

Question 59

Непрерывный процесс

Answer 59

В настоящее время наблюдается тенденция к переходу на непрерывные
процессы, в котором свежая среда непрерывно добавляется к клеточной культуре, а
продукт удаляется из нее. Такой подход лучше автоматизируется, дает более высокий
титр продукта, кроме того, качество продукции может быть более равномерным, так
как клетки постоянно находятся в одних и тех же условиях окружающей среды.

Три наиболее распространенных типа непрерывного процесса:
1. Хемостат: скорость добавления одного субстрата, ограничивающего
рост, контролирует размножение клеток.
2. Турбидостат: косвенное измерение количества клеток (мутности или
оптической плотности) контролирует добавление и удаление жидкости. Для
этого требуется дополнительный датчик, но он осуществляется на основе
обратной связи в реальном времени.
3. Перфузия: этот тип режима непрерывного производства основан
либо на сохранении клеток в биореакторе, либо на рециркуляции клеток обратно
в биореактор. Предоставляется свежая среда, и бесклеточный супернатант
удаляется с той же скоростью.

В перфузионном процессе добавление свежей среды и удаление отработанной
среды с одинаковой скоростью позволяет поддерживать постоянный объем культуры в
биореакторе, поэтому максимальный рабочий объем сосуда не ограничивает
количество свежей среды, которое может быть добавлено в культуру на протяжении
всего цикла. Процесс перфузии может длиться три и более недель, в зависимости от максимального значения VCD, выбранного для ограничения скорости потребления
среды.

Question 60

Для удержания клеток в биореакторе используется один из нескольких
подходов:

Answer 60

1. Фильтрация. Фильтры, которые
   удерживают клетки и пропускают
   жидкость и небольшие
   молекулы. Самый простой вариант
   — спин-фильтр. Спиновые фильтры
   относительно дешевы, но имеют
   некоторые ограничения, например
   склонность к засорению. Часто
   используются устройства фильтрации с
   тангенциальным потоком (TFF) и с
   переменным тангенциальным потоком
   (ATF). В TFF жидкость проходит мимо
   пор тангенциально, а не проталкивается
   через них ортогонально, что снижает вероятность засорения.
   Устройства ATF используют тот же принцип тангенциального потока,
   но меняют направление потока один раз в каждом цикле, чтобы
   минимизировать загрязнение и еще больше уменьшить силы сдвига.
2. Разделение акустических
   волн. Основано на образовании
   трехмерной стоячей волны в
   жидкости. Клетки захватываются и
   агрегируются в узлах волны. Затем
   клеточную суспензию очищают по мере
   оседания агрегатов.
3. Сосуд с насадочным слоем. Такой слой
   представляет собой пористую сетку из
   полиэстера и полипропилена, которая
   обеспечивает поверхность роста для
   прикрепившихся клеток и удерживает
   взвешенные клетки. Иммобилизация клеток в
   матрице облегчает сбор бесклеточной среды из
   биореактора.
   Как уже отмечалось, процессы периодического с подпиткой, непрерывного и
   перфузионного действия требуют хорошего понимания метаболизма клеток, а также
   разработанных систем регулирования. Непрерывные и перфузионные культуры
   требуют меньшего объема культуры и позволят достичь высокого выхода продукта, но
   в большей степени подвержены контаминации и сбоям оборудования.

Question 61

Регулирование параметров биореактора

Answer 61

ПИД-регулятор
Пропорционально-интегрально-дифференциальный (ПИД) регулятор жизненно
важен для промышленных систем управления. Такие параметры как растворенный
кислород (DO), pH, температура чувствительны к настройкам PID. Во многих
биореакторах контуры управления расположены каскадно, поэтому переменные
регулируются одновременно.