Week 3 Flashcards
Transport door nuclear pore complex
Transport gebeurt via Nucleocytoplasmic transport
Twee kanten transport
- Import van nucleaire eiwitten naar nucleus (erin)
2. Export van RNA naar cytoplasma (eruit)
Twee manieren van transport
- Passieve diffusie
a. Kleine moleculen, bv. ionen: geen energie benodigd - Energy-afhankelijke transport. Macro moleculen moeten erdoorheen geduwd worden: kost energie
Structuur nuclear pore complex
- Gigantische structuur
- Bestaat uit meer dan 50 eiwitten
- Per menselijke celkern wel 3000-4000 stuks
- Aan de cytoplasmatische kant zitten cytosolic fibrils
•Aan de nucleus kant zitten nuclear fibrils
Wat heb je nodig om de nucleus “in” te gaan
Eiwitten die naar de nucleus heen moeten bevatten het nuclear localisation signal (NLS).
N-terminus en patch. Bij patch bepaald vouwen of het zichtbaar is of niet.
Nut behouden signaal peptide
bij de celdeling worden er nieuwe nucear pores gemaakt om de chromosomen heen. Alleen zitten deze nu buiten de celkern (aan de cytosol kant). Dus moeten ze opnieuw de celkern in worden getransporteerd. Hiervoor zijn de signaal peptide nodig.
Importin
is een klasse van eiwitten die specifiek eiwitten herkent met NLS
Importin bindt aan NLS van nucleaire eiwitten en zorgt voor transport van cytoplasma naar nucleus
adaptor eiwitten
Deze helpen soms de importin met het herkennen van bepaalde NLS
Iets bijzonders aan nucleaire import eiwitten
Bijzondere aan nucleaire import eiwitten is dat zij oplosbaar zijn: kunnen in cytoplasma eiwitten binden en brengen naar de kern
Wat heb je nodig om de nucleus “uit” te gaan
Eiwitten die de nucleus uit moeten bevatten het NES (Nuclear export signal).
Exportin i.p.v. importin!
Hoe werkt transport met importin
1)Importin bindt een eiwit met NLS en vormt een complex
Gaat naar nuclear pore complex
2)Bindt aan tip van cytoplasmatische fibril
3)Gaat door nuclear pore heen en eindigt op nuclear basket (is nu binnen)
4)Importin koppelt los van eiwit
a.Eiwit gaat nucleus in
B.Importin gaat terug naar cytoplasmatische kant
Hoe weet importin wanneer koppelen wanneer loslaten? Dus hoe weet hij waar hij is?
+ stappenplan
Met behulp van small GTPase Ran!
Actieve vorm, GTP, alleen in nucleus. Inactieve vorm, GDP, alleen in cytoplasma.
Als Importin + eiwit arriveert in de nucleus > GTPRan bindt aan Importin, eiwit laat los > Importin + GTPase terug naar cytoplasma > Eenmaal terug in cytoplasma wordt GTPase GDPase > Importin laat GDPase los en bindt nieuwe cargo.
GEF en GAP bepaling locatie
•GEF heeft een specifieke locatie in de nucleus
Eiwit RCC1: bindt aan chromatine (DNA)
Altijd in de kern dus!
•GAP heeft een specifieke locatie aan cytoplasmatische zijde. Bevindt zich op cytoplasmasmatische fibrillen
Dus altijd buiten de kern (in het cytoplasma)!
•GAP en GEF bepalen dus eigenlijk wat is de binnenkant- & wat is de buitenkant van de nucleus
Complete cyclus nuclear protein import! (8)
1) Eiwit met NLS wordt gemaakt in het ribosoom
2) Eiwit bindt aan importin en vormt complex
3) Bindt aan de fibril cytoplasmatische zijde
4) Beweegt zich door nuclear pore heen richting basket
5) Ran GTPase bindt aan importin
6) Importin laat eiwit los
7) Importin & GTPase gaan terug naar cytoplasmatische kant
8) Eenmaal in het cytoplasma wordt GTP > GDP en laat los van importin
Nodig voor mRNA export
mRNA altijd gecoat met
Heterogenous nuclear RiboNucleoprotein Particle (hnRNP)
mRNA wordt naar cytoplasma geëxporteerd als een groot RNP-complex (verpakt met hnRNP dus).
hnRNP bevatten de NES (signaal voor export)
Zullen alleen worden verplaatst als mRNA ‘rijp’ is voor export (gespliced etc.)
hnRNP eiwitten zullen alleen NES signaal naar voren brengen als het gebonden is met een complete mRNA sequentie
5’ kant van mRNA zullen altijd als eerste de nucleus verlaten
Stappen mRNA export
1) Eiwit dat het NES bevat (hnRNP eiwit) bindt aan mRNA
2) hnRNP eiwit bindt aan nuclear export receptor
3) Ran GTPase bindt ook aan nuclear export receptor
a. Complex van hnRNP eiwit met mRNA + receptor + Ran GTP
b. Op nuclear fibril
4) Gaat door nuclear envelop heen
5) Komt aan bij cytoplasmatische zijde
a. GAP inactiveert de GTPase (GTPase wordt GDPase)
6) Complex valt uit elkaar
7) Export receptor gerecycled naar nucleus
Nodig tRNA export
tRNA heeft van zichzelf een unieke 3-D structuur die herkent moet worden door het ribosoom. Dit structuur leidt ertoe dat t-RNA geen hnRNP nodig heeft voor transport.
tRNA bindt direct aan nuclear export receptor: Exportin-t
Alleen een complex van 3 factoren
• Ran-GTP
• Exportin-T
• tRNA
Dus zonder hnRNP!
stappen tRNA export
1) tRNA bindt aan nuclear export receptor
2) Ran GTPase bindt ook aan nuclear export receptor
a. Complex van tRNA + receptor + Ran GTP
b. Op nuclear fibril
3) Gaat door nuclear envelop heen
4) Komt aan bij cytoplasmatische zijde
a. GAP inactiveert de GTPase: GTPase wordt GDPase
5) Complex valt uit elkaar
6) Export receptor gerecycled naar nucleus
Fluoriscentie
Fluorescentie wordt gebruikt om moleculen binnen een cel te lokaliseren
Gebeurt in combinatie met fluorescentie microscoop
Bij fluorescentie wordt licht opgenomen door atomen waardoor valentie elektronen aanslaan tot een hogere orbitaal (energie)
‘Aangeslagen toestand’
Natuurlijk willen atomen zo weinig mogelijk energie hebben, dus vallen ze terug
Tijdens terugvallen stralen ze licht uit, ze ‘persen’ de extra energie er basically uit
LET OP:
Energie dat erin ging, is altijd meer dan de energie dat eruit komt
Werking fluorescentie microscoop
Lamp die meerdere golflengtes kan uitstralen, vervolgens:
1) First barrier filter: Voor specifieke golflengte doorlaten
2) Beam splitting mirror: Laat een deel wel door en een ander deel van het licht niet
3) Second barrier filter: Verwijderen van ongewild licht om specifieker naar een bepaalde golflengte te kijken
Relatie golflengte en energie
Lagere golflengte = hogere frequentie = meer trillingen = meer energie
E= h*f
F= C/y
Immunofluoriscentie direct en indirect
Gebruikmaking van antistoffen
Directe manier: Gebruikmaking van 1 antilichaam waarbij deze fluorescent gelabeld is
Indirecte manier: Gebruikmaking van 2 antilichamen waarbij de tweede antilichaam fluorescent gelabeld is
hierdoor is er een nog sterker signaal
DAPI
DNA kleuring
blauw
FITC
cytoskelet kleuring
groen