Viral Vectors Flashcards
Que tipo de vírus são usados em Terapia Gênica?
Vírus recombinante, nunca wild-type.
Ao utilizar vetores virais na Terapia, o que pretendemos manter e retirar?
Remover elementos que causam patogenicidade ao ser humano;
Manter características de infecciosidade e capacidade de infetar rapidamente um grande número de células;
Garantir a expressão direcionada do gene terapêutico.
Quais são as características ideais de um vetor viral?
Perfil seguro;
Produção fácil;
Boa estabilidade nas células-alvo;
Alta capacidade transgênica.
Como é que se pode tornar os vetores virais mais seguros, sem comprometer a sua eficácia?
Evitar a replicação;
Promover a inativação;
Atenuar a toxicidade natural.
Que critérios são utilizados para classificar vírus?
Tipo de material genético (DNA/RNA);
Simetria do capsídeo;
Presença de envelope;
Tamanho (capacidade de carga);
Local de replicação (núcleo ou citoplasma).
Caracterize os lentivírus de acordo com os critérios de classificação de vírus.
Material genético: RNA (retrovírus);
Contêm proteínas como transcriptase reversa, integrase e protease;
Ligando: glicoproteína gp120;
Capsídeo proteico;
Replicação: ocorre em células mitóticas e não mitóticas.
Quais proteínas formam o capsídeo, nucleosídeo e matriz dos lentivírus (HIV-1)?
Capsídeo: p24;
Nucleosídeo: p7;
Matriz: p17.
Nos lentivírus, ou HIV-1, por que existem 2 moléculas de RNA de cadeia simples idênticas?
Apenas 1 é utilizada.
A outra contribui para estrutura funcional e regulação durante a transcrição.
Qual a constituição/estrutura genômica de um lentivírus (HIV-1)?
LTR em cada extremidade (zonas reguladoras: U3, R, U5).
Sequências codificadoras principais:
✳ Gag (estrutura), Pol (replicação), Env (glicoproteínas de envelope).
Elementos reguladores essenciais:
✳ Regulatórios: Tat, Rev;
✳ Acessórios: Nef, Vif, Vpr, Vpu.
Por que os lentivírus são mais seguros que os retrovírus gamma para integrar genes?
Lentivírus integram em regiões intrônicas ou intergênicas.
Retrovírus gamma integram em promotores ou zonas reguladoras, aumentando risco de mutagênese.
Descreva o ciclo replicativo do HIV-1.
Ligação a receptores (CD4).
Fusão do envelope com a membrana.
Uncoating no citoplasma, liberando transcriptase reversa, integrase e protease.
Transcrição reversa (RNA → DNA).
Integração no núcleo via integrase.
Transcrição do mRNA viral, produção de proteínas virais.
Maturação e liberação do vírus após modificações pós-tradução.
O que envolve a 3ª geração de produção de vetores lentivirais?
Aumentar segurança removendo elementos regulatórios;
Introduzir vetores SIN.
Em que consiste o pseudotyping (pseudotipagem)?
Alterar o tropismo celular;
Modificar glicoproteínas do envelope.
Em que consiste o uso de adaptadores na modificação de vetores lentivirais?
Combinar com polímeros/lipossomas;
Prevenir interações indesejadas e respostas imunes.
Em que consistem as modificações genéticas dos vetores lentivirais?
Alterar o genoma para que produza proteínas diferentes.
O que são vetores SIN (auto-inativação)?
Mutação/deleção em U3 das LTRs, inibindo replicação;
Permite expressão controlada do transgene.
O que são vetores não integrativos?
Não integram o transgene no genoma do hospedeiro;
Modificados por mutações nas zonas reguladoras ou na integrase.
Caracterize os retrovírus gamma.
infectam células mitóticas;
Integram em regiões exônicas ou promotores;
Altamente infecciosos;
Capacidade de carga: 8–9 kb.
Quais são as vantagens dos retrovírus gamma?
Simplicidade genética;
Tropismo amplo;
Produção fácil;
Expressão duradoura.
Quais são as desvantagens dos retrovírus gamma?
Transduzem apenas células mitóticas;
Alto risco de mutagênese;
Baixa estabilidade.
Caracterize os Adenovírus de acordo com os critérios de classificação de vírus.
Simetria icosaédrica (cápsideo composto por 240 proteínas – hexons);
Sem envelope;
Material genético: DNA de cadeia dupla linear;
Fibras e domínios Knob (adesão e entrada nas células);
Base do pentão: proteína na base das fibras;
Tamanho: 35 kb.
Qual é a constituição/estrutura genômica de um Adenovírus?
Flanqueado por 2 ITRs (Inverted Terminal Repeats);
2 grandes unidades de transcrição:
✳ Early transcription units (E1, E2, E3, E4): reguladoras;
✳ Late transcription units (MLTU): estruturais.
Descreva o ciclo replicativo do Adenovírus.
Adsorção: ligação pelas fibras e knobs;
Endocitose via clatrina;
Desempacotamento parcial no endossoma;
Cápsideo vai ao núcleo e libera DNA;
DNA viral é transcrito no núcleo;
Produção de proteínas virais no citoplasma;
Maturação e liberação do vírus via lise celular.
Em que consiste a 3ª geração de produção de vetores adenovirais?
Remoção de quase todos os genes virais, exceto ITRs e sinal de empacotamento;
Capacidade de carga ampliada (35 kb);
Maior segurança.
Como ocorre a produção de transgene em vetores adenovirais sem promotores?
Sistema Cre-Lox: remove o sinal de empacotamento antes de recolher os vírus;
Produção pura (95% eficiência).
Quais são as estratégias de melhoramento de vetores adenovirais?
Reduzir inflamação e resposta imune via modificações genéticas e químicas.
Quais são as modificações químicas para melhorar vetores adenovirais?
Modificação de fibras e hexons;
Partículas quiméricas;
Uso de promotores específicos.
Caracterize os Vírus Adeno-Associados (AAV).
Cadeia simples de DNA;
Sem envelope;
Muito pequenos;
Capsídeo com simetria icosaédrica (60 proteínas).
Qual é a estrutura genômica de um Vírus Adeno-Associado (AAV)?
2 ORFs: rep (replicação) e cap (proteínas de capsídeo);
Flanqueado por ITRs;
Promotores virais: p5, p19 e p40.
Qual serótipo de AAV atravessa a barreira hematoencefálica?
AAV9.
Descreva o ciclo replicativo do AAV.
Ligação aos receptores celulares específicos;
Entrada via endocitose;
Escape do endossoma via lise;
Uncoating e liberação do DNA no núcleo;
Transcrição do mRNA viral e produção de proteínas.
Quando ocorre uma infecção ativa por AAV?
Apenas com estímulos externos, como co-infecção por adenovírus.
Caso contrário, entra em estado latente.
Quais estratégias melhoram a produção de vetores AAV?
Transcapsidação;
Capsídeo mosaico;
Capsídeo quimera.
Caracterize os Vírus Herpes Simplex (HSV).
Envelope com glicoproteínas importantes para infeção;
Capsídeo com simetria icosaédrica;
Tegumento (camada proteica amorfa);
Cadeia dupla de DNA.
Por que o HSV é um bom candidato a vetor?
Infecta células mitóticas e pós-mitóticas;
Tropismo amplo devido às glicoproteínas;
Altamente infeccioso (mas também pode gerar toxicidade).
Caracterize o Vírus Vaccinia.
DNA de cadeia dupla;
Possui envelope;
Replicação ocorre no citoplasma;
Formas infeciosas:
✳ Imatura (intracelular);
✳ Madura (extracelular).
Caracterize o Baculovírus.
Infecta insetos;
Não se replica em mamíferos;
DNA de cadeia dupla (180 kb);
Formas: entre hospedeiros e replicativa.
Qual é uma característica importante de um vetor viral ideal?
Alta eficiência transgênica.
Qual vetor viral derivado do HIV é amplamente usado?
Lentivírus.
O que é removido nos vetores virais para segurança?
Elementos infecciosos.
Por que o lentivírus é útil como vetor viral?
Capacidade de integração estável.
Qual é o principal desafio dos vetores virais oncolíticos?
Infecção de tecidos saudáveis.
Por que os baculovírus não são usados em humanos?
Infectam apenas insetos.
Qual é a vantagem dos vírus oncolíticos?
Alta seletividade para células tumorais.
Que característica crítica os adenovírus possuem?
Alta expressão transgênica.
Qual estratégia reduz a toxicidade dos vetores virais?
Replicação seletiva.
Em que terapia o Vaccinia é aplicável?
Terapia suicida.
Qual é o material genético dos lentivírus?
RNA de cadeia simples.
Qual é o material genético dos adenovírus?
DNA de cadeia dupla linear.
Qual é a função dos LTRs nos lentivírus?
Regular a transcrição e replicação do vírus.
Quais são as sequências codificadoras principais dos lentivírus?
Gag, Pol, Env
Qual característica do genoma do adenovírus é importante para terapia gênica?
Não integra no genoma da célula hospedeira.
