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Complément virologie > Vecteurs > Flashcards

Vecteurs Flashcards

1
Q

Décrire expression transitoire

A

TG non intégré

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Q

Décrire expression permanente

A

TG intégré, modification est transféré dans les cellules filles par division cellulaire

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3
Q

Décrire transformation

A

introduction de matériel génétique à l’intérieur d’une bactérie

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4
Q

Décrire transfection

A

introduction, sans aide de vecteur viral, de matériel génétique dans une cellule eucaryote

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5
Q

Comment effectuer la transfection (3 façons)

A
  1. Phosphate de calcium (Ca2+ masque polarité négative de l’ADN)
  2. liposomes (fusionne avec membrane cellulaire)
  3. électroporation (augmente perméabilité de la membrane cellulaire)
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6
Q

Décrire transduction

A

introduction matériel génétique dans une cellule (euk ou prok) à l’aide d’un VIRUS ou VECTEUR VIRAL

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7
Q

Décrire vecteur réplicatif (3 points)

A

Se réplique de manière autonome
Réalisation de TOUT le cycle de vie du virus se produit a/n des cellules cibles
Il y a production nouvelles particules virales qui vont transduire les cellules environnantes

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8
Q

Décrire vecteurs oncolytiques

A

Vecteur se répliquant et éliminant spécifiquement des cellules cancéreuses

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9
Q

Décrire vecteur non réplicatif (ou défectif)

A

gènes essentiels à la réplication sont retirés (rend les virus incompétents à la réplication)
Nécessite plasmide d’encapsidation (exprime gènes viraux essentiels retirés qui permettaient de produire particules virales du vecteur)
—- ne produisent aucune particule virale a/n des cellules cibles

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10
Q

Séquences essentielles aux vecteurs

A
  1. TG
  2. Promoteur
  3. Psy (encapsidation du vecteur)
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11
Q

Séquence événements vecteurs non réplicatifs

A
  1. Transfection dans cellules d’encapsidations (nécessite plasmide encapsidation)
  2. Encapsidation
  3. Transduction
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12
Q

2 types de vecteurs rétroviraux

A
  1. Vecteurs rétroviraux (gammarétrovirus)
  2. Vecteur lentiviraux (lentivirus)
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13
Q

Type de génome de vecteur rétroviral simple

A

ARN sb +

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14
Q

Exemple de virus gammarétrovirus

A

Moloney Murine Leukemia virus

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15
Q

Structure de gammarétrovirus

A

-5’LTR + 3’LTR
-PSY
-GAG (matrice, capside, nucléocapside)
-POL (protéase, RT, intégrase)
-ENV (glycoprotéine de l’enveloppe)

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16
Q

Exemple rétrovirus complexes

A

HIV-1

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17
Q

Structure lentivirus

A

LTR (3’ et 5’), GAG, POL
+ Protéines de régulation (Tat, Rev)
-Tat (transactivation de transcription des ARNs viraux)
-Rev (exportation ARN non épissés vers cytoplasme)
+ Protéines accessoires (Nef, VPr, Vpu, Vif): optimisation réplication virale via modulation fine de L’intéraction virus/cellules hôtes et évasion de la réponse immunitaire

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18
Q

résumé cycle réplication rétrovirus (HIV)

A
  1. Fusion
  2. décapsidation
  3. Transcription inverse
  4. intégration (intégrase (pol))
  5. transcription (Tat)
  6. export hors noyau (Rev)
  7. Traduction
  8. assemblage
  9. bourgeonnement
  10. maturation (protéase)
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19
Q

Construction vecteurs rétroviraux

A

NON RÉPLICATIFS (pathogènes): enlève gag pol et env (Remplace pour TG)
On garde séq PSY + LTR
*peut répliquer seulement dans cellules d’encapsidation
*gag pol et env doivent être exprimés sur plasmides différents pour éviter recombination
**évite sites de recombinaison possibles

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20
Q

Taille insert vecteur rétroviral

A

8kb

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21
Q

Vecteur rétroviral peut infecter quel type de cellule

A

cellules qui se divisent

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22
Q

Vecteur lentiviraux sont dérivés de quel virus

A

VIH1

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23
Q

Décrire vecteur lentiviral 1st gen

A

3 plasmides
1. packaging plasmid: promoteur CMV, gag pol et gènes accessoires
2. env: promoteur CMV + VSV-G
3. vecteur: 5’LTR, psy, RRE (Rev response element - export noyau vers cytoplasme), TG sous expression du promoteur CMV et 3’LTR

24
Q

Décrire vecteur lentiviral 2nd gen

A

comme vecteur 1st gen, mais pas de gènes accessoires

25
Décrire vecteur lentiviral 3rd gen
4 plasmides : 1. Packaging (pro:CMV, gag, pol, RRE) 2. env: (pro:CMV, VSV-G) 3. Rev: (pro:CMV, Rev) 4. Vecteur: (pro:CMV, 5'LTR sans U3, psy et RRE, pro:CMV-TG, 3'LTR avec U3 muté) différence avec 2nd gen: Rev sur un autre plasmide, LTR mutés, Tat enlevé
26
Vecteur SIN?
Self-inactivating vecteur, inhibe l'activité des LTR promoteur CMV en 5' au lieu du U3; en 3' U3 est muté ADN intégré: 2 U3 mutés (pas de promoteur actif) -> permet de ne pas activer d'oncogènes à proximité
27
Lentivirus en vecteur utilisé comme vaccin?
non
28
Taille insert vecteur lentiviral?
10kb
29
application vecteurs lentiviraux/rétroviraux
-Expression permanente protéines dans lignées cellulaires - Expression inhibée d'une prot via utilisation vecteur exprimant ARN interférence - Étudier protéines: surexpression permanente et suppression permanente - sélection clones cellulaires en criblage (expression d'un gène de sélection)
30
Vecteurs adénoviraux les + utilisés
Ad2 et Ad5
31
Génome adénovirus
ADN db linéaire
32
Transcription des adénos?
régions précoces + tardives
33
Structure adénos
non enveloppé, prot fibre impliquée dans attachement
34
Récepteur adénos?
CAR (Coxsackie + adénovirus réceptor)
35
Décrire phase précoce cycle réplication adénos
Gènes précoces: E1A, E1B, E2, E3, E4: modulent expression gènes de l'hôte (facilite réplication ADNv + synthèse prot. tardives) *E1A stimule transcription des autres gènes précoces, active le cycle cellulaire
36
Décrire phase tardive réplication adénos
Commence avec réplication ADN Transcrits tardifs (L1-L5) codent pour protéines structurelles nécessaire à assemblage, libération et lyse cellule hôte Assemblage dans le noyau Lyse + relâche 2-6j postinfection
37
Décrire vecteur adéno 1st gen
délétion de E1 pour ajouter TG -> non réplicatif Produite dans cellules exprimant E1 Enlève aussi E3 (pas effet en culture) pour augmenter taille de l'insert Insert de 8kb (encapside max 105% de son génome) *même si E1 enlevé, facteurs cellulaires semblables à E1 peut permettre expression gènes viraux -> toxicité + réponse immune (mort cellules transduites)
38
Décrire vecteur adéno 2nd gen
délétion de E2 et E4 (essentiel réplication virale) insert +- 14kb Lignée encapsidation doit exprimet E1, E2, E4 *risque diminué réponse immune, de recombinaison avec virus sauvage ou RH
39
vecteur adéno 3rd gen?
Délétion tous les gènes sauf ITR et PSY Insert max 36kb (min 75% so insert DNA stuffer) besoin d'un virus ou plasmide helper (helper contient pas la région PSY)
40
Vecteur adénoviral oncolytique?
Délétion de E1B (lie et inactive p53 qui active normalement le cycle cellulaire) et puisque inactivation de p53 nécessaire à réplication virus; virus tropisme cellules tumorales p53-
41
Désavantage utiliser vecteur adéno?
séroprévalence élevée dans population, neutralisation avant infection...
42
Structure adéno associated virus
non enveloppé, chq sérotype a une capside particularités uniques, capside icosaédrique
43
Génome AAV
ADN sb linéaire contient ITR aux extrémité de chq brin 4 prot de réplication (Rep...) 3 prot de capside (VP...) *code pas pour polymérase virale *Incapable de réplication *besoin d'un virus helper comme Adéno ou Herpes
44
Vecteur AAV
-Délétion de Rep + cap : insert 5kb -Rep + cap dans un plasmide d'encapsidation avec gènes adénos (E1, E2, E4, VA) - AAV autocomplémentaire: insert moitié taille puisque 2 sections complémentaires. Augmente vitesse de transfection puisque pas besoin de synthèse du 2e brin
45
Avantages Vecteur AAV
- peu pathogène - large tropisme, selon sérotype - peut inf. cellules se divisant ou non - bon niveau expression pendant années même si aucune intégration (vecteur extrachromosomique) -produits en grande qté
46
Désavantages vecteurs AAV
Taille insert : 5kb Expression TG lente (nécessite synthèse 2e brin)
47
ex rhabdovirus
VSV
48
Génome Rhabdovirus
ARNsb- Code 5 protéines (LP = 2 s-u) - L (Large): ARNpol dép ARN - P (Phosphoprotine): ARNpol dép ARN - G: glycoprotéine enveloppe - N: Nucléoprotéine - M: Matrice (perturbe rép. immune) *séq leader ET terminale: complémentaire, signal PSY, promoteur
49
Récepteur VSV
Low density lipid receptor entrée clathrine dép
50
Réplication rhabdovirus
dans le cytoplasme
51
Fonction de la protéine M
Inhibition de l'expression de gènes cellulaires empêche export des ARNm Bloque synthèse IFN
52
Pourquoi VSV oncolytique intéressant
Se réplique de manière sélective dans les cellules qui ont défauts dans la voie IFN
53
Applications vecteur VSV
-surexpression protéines - virus oncolytique - vaccin réplicatif
54
Structure poxvirus
enveloppé, ADNsb, environ 100 gènes
55
3 souches étudiées poxvirus vecteurs
NON RÉPLICATIVES - MVA -ALVAC -NYVAC
56
cycle réplication poxvirus
-Entrée par endocytose - relache capside dans cytoplasme - synthèse séquentielle transcrits précoces, intermédiaires et tardifs - code sa propre ARNpol dép ADN - Réplication cytoplasmique - encapdisation ADN, acquisition des membranes dans TGN -fusion pour sortir
57
génération de VECTEUR poxvirus
1. vecteur insertion: TK gène (site de restrictions, ORI + gène rapporteur + plasmide contenant TG + gène rapporteur 2. clivage du vecteur insertion avec enzyme de restriction + ligation -> gène TK non fonctionnel --> création vecteur recombinant 3. Infection avec WT + transfection -> le gène TK-va faire RH avec le gène TK+ du WT, sélection des virus TK- par BrdU (TK phosphoryle BrdU qui est incorporé dans génome viral et létal)

Complément virologie (6 decks)

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