Unidad 17 técnicas para análisis de ácidos nucléicos Flashcards
Técnicas utilizadas en la caracterización de fragmentos clonados de ADN
Electroforesis en gel
PCR
RT-PCR
Secuenciación
Técnicas utilizadas en el estudio de la expresión de genes a partir de fragmentos clonados de ADN
-Northern blotting
- Southern blotting
- Hibridación in situ
Uso de técnicas de analisis de acidos nucleicos
Clonación de ADN
Diagnostico medico
Analisis forense de ADN
separación de ADN clonado en un vector
Para manipular fragmento de ADN clonado
Por medio de enzimas de restricción
Electroforesis
Separa molécuñas de acuerdo a tamaño y función
Basado en el movimiento de moléculas cargadas electricamente
Geles para electroforesis
Geles de poliacrilamida: 10-2000 nucleotidos
Geles de agarosa: 200-20k nucleotidos
Funcionamiento de la electroforesis
Moléculas negativas van hacia el ánodo (+)
Moléculas positivas van hacia cátodo (-)
PCR
Permite amplificar un segmento de ADN
Proceso de PCR
Desnaturalización
Hibridación (templado)
Síntesis (elongación)
Elementos para PCR
-Muestra de moléculas dúplex de ADN.
-Enzima Taq polimerasa (ADNpol resistente a altas temperaturas).
-Oligonucleótidos (cebadores ó primers).
-Desoxinucléotidos (dNTP’s).
-Cofactores
RT-PCR
PCR con transcripción inversa
Permite amplificación de ADNc a partir de ARNm y la cantidad incial de ARNm
RT-PCR cuantitativa
Se determina la cantidad de secuencia de ADN de doble cadena producida en cada ciclo de amplificación
Como se estima la cantidad de ARNm incial
COn extrapolación de cantidades obtenidas
Que tecnica proporciona una de las medidas más precisas para seguir cambios en expresión génica
La RT-PCR
Que se necesita para completar carcaterización de un fragmento de ADN clonado
Determinar secuencia nucleotida
Metodos de secuenciación del ADN
Enzimatico de terminación de cadena (sanger)
Secuenciación automatico
Proceso de secuenciación del ADN
Sintesis de nuevos fragmentos de ADN
Separar fragmentos por electroforesis
Identificar nucleotidos para determinar secuencia
Tecnicas de hibridación del ADN
Permiten identificar cuando y donde se expresan ciertos genes
Cuales son las tecnicas que permiten determinar secuencias especificas de ADN y ARN
Southern blotting
Northern blotting
Hibridación in situ
Analisis de southern blot
Metodo para estudio de ADN
-ADN purificado se digiere por endonucleasa
-Fragentos separados por electroforesis
-Exposición en sonda marcada
Función de sonda marcada en southern
Permite que fragmentos con secuencias complemetarias del ADN usado como sonda sean visualizados en el southern blot
Analisis northern blot
Permite identificar cuando y donde se expresa un gen en un organismo por evaluación del ARNm
Para que se usa el northern blot
Para comparar cantidades de un ARNm especifico en células que se encuentran en diferentes condiciones
Proceso de northern blot
Fragmentos de ARn purificados son separados por electroforesis
Exposición a sonda de ADN marcada para visualizar secuencias complementarias de sonda en northern blot
Analisis western blot
Detecta proteína especifica en sangreo o tejido
Permite diagnostico de enfermedades
Proceso de westerno blot
Separar proteínas de muestra por electroforesis
Transferencias de proteínas a membrana
Membrana se expone a anticuerpo especifico
Tecnica de hibridación in situ por fluoresencia
FISH
Usada para observación de genes o cromosomas en células y tejidos
Permite identificar ubicación de un gen especifico en cromosomas, numero de copias o anormalidades
Proceso de hibirdación in situ por floresencia
Adición de tinte fluoresente a muestra
Obervación bajo microscopio
Áreas especificas de fragmentos se iluminan
