Sesión 12 términos Flashcards
Tecnología del ADN recombinante
Permiten aislamiento, amplificación, manipulación y caracterización de genes o fragmentos de ADN
ADN recombinante
ADN híbrido
Obtención in vitro por combinación de ADN de diferentes orígenes
Organismos transgénicos
Células u organismos que reciben ADN recombinante
Ingenieria genética
Aplicación práctica de las tecnologías del ADN recombinante a problemas biológicos, médicos y agrícolas específicos
Utilidad de ingenieria genética
Estudio de estructura y función
Aplicación de analisis molecular
Desarrollo de productos comerciales para diagnostico y tratamiento
Pasos esenciales para clonación de genes
- Formar molécula recombinante
- Clonación de moléculas recombinantes en célula
Pasos necesarios para formar molécula recombinante
- Aislar ADN de distintos origenes
- Obtener fragmentos de ADN
- Unión de fragmentos de ADN con vectores de lonación por ADN ligasa
Como se obtienen los fragmentos de ADN
Por enzimas de restricción
Enzimas de restricción
Endonucleasas de restricción
Proteínas que cortan el ADN en lugares específicos
Vectores de clonación
Moléculas de ADN que pueden llevar un fragmento de ADN foráneo y replicarlo dentro de una célula huésped
Plásmidos
Origen de enzimas de restricción
bacterias
Mecanismo de defensa de bacterias
Enzimas de restricción reconocen secuencias de ADN extraño y lo cortan en puntos específicos
Como se portegen las bacterias de sus propias enzimas de restricción
Metilación las vuelve resistentes a su acción nucleolitica
Clasificación de enzimas de restricción
Tipo I y III: Cortan ADN en puntos no especpificos
Tipo II: Corte específico en misma diana
Enzimas de restricción tipo I
Cortan lejos de secuencia de reconocimiento
Enzimas de restricción tipo III
Cortan 5-8 bases lejos de secuencia de reconocimiento
Necesita ATP
Enzimas de restricción tipo II
Cofactor Mg++
No ATP
Secuencias cortas
Simetria rotacional
Secuencia palindromica
Secuencia de bases es la misma cuando se lee en direcciones opuestas en las dos cadenas complementarias del ADN
Tipos de extremos producidos por enzimas de restricción
Extremos romos
Extremos cohesivos
Extremos romos
Corte de cadenas en mismo punto por el centro de la diana
Extremos cohesivos
Corte a pocos núcleotidos de distancia del eje de simetría
Isoesquizomeros
Enzimas de restricción específicas para misma secuenca de reconocimiento pero cortes diferentes
Sau3AI y Mbol
Diferentes enzimas de restricción que pueden reconocer y cortar misma secuencia de forma difernete
Smal y xmal
Reconocen misma secuencia pero cortan en diferentes puntos
ADN ligasa
Regenera el enlace covalente
Para unión de fragmenos de ADN recombinante
Transferasa terminal
Modifica extremos de ADN artificialmente
Puede construir extremos cohesivos
Une nucleotidos a extremos 3’
Puede formar fragmentos complementarios
Electroforesis en gel
Técnica bioquímica que permite separar moléculas según su
tamaño y carga eléctrica.
Funcionamiento de electroforesis en gel q
ADN migra a ánodo (carga positiva)
Marcador de peso molecular
Fragmentos de ADN de tamaño conocido
Permite determinar tamaño aproximado de fragmentos de interés
Clonación
Amplificación de moléculas recombinantes
Por medio de introducción a célula huesped que se reproduce y produce copias identicas
Principales carcaterísticas de vectores de clonación
Replicación autonoma
Marcador seleccionable
Sitios de restricción únicos
Replicación autonoma de vectores de clonación
Deben tener origen de replicación propio
Marcador seleccionable de vectores de clonación
Para que el huesped tenga un fenotipo facilmente identificable
Ejemplos de marcadores seleccionables
Genes de resistencia a antibioticos
Genes que codifiquen enzimas que los huespdes no tengan
Vectores de clonación más usados
Bacteriofagos
Cosmidos
Cromosomas artificiales
Plásmido
Molécula circular extracromosómica de ADN bicatenario presene en microorganismos
Inconveniente de plásmidos
Solo incorporan fragmentos de ADN pequeños
características de plásmidos
Origen de replicación propio
Genes de resistencia antibioticos
Número de dianas únicas para enzimas de restricción comunes
pUC
Plásmido mejorado
Alfa complementación
-E. coli mutado sin péptido alfa de B-galactosidasa
-Enzima inactiva
-Bacterias no hidrolizan galactosa ni x-gal
-Transformació con vector pUC aporta péptido alfa
Reconocimiento de bacterias transformados con pUC
Forman colonias azules en presencia de un substrato incoloro x-gal
Por que las bacterias transformadas forman colonias azules
Cuando x-gal es hidrolizado por B-galactosidasa produce substancia azul insoluble en presencia de IPTG
Colonias blancas
Al insertar un fragmento de ADN extraño
Se interrumpe fragmento del gen
No ocurre complementación alfa
B-galactosidas es inactiva
Bacteriofagos
Vehículos naturales de transducción del ADN
Fago lambda de E.coli
Más conocido
Empaqueta ADN flanqueado por secuencias cohesivas
Complementariedad de extremos cos en lambda
Permite que cromosomas lambda adquiera forma circular al infectar a E.coli
Tipos de bacteriofagos
Vectores lambda de inserción
Vectores de reemplazamiento
Vectores lambda de inserción
Tiene lugares de restricción unicos para endonucleasa para fragmento de ADN exogeno
Vectores de reemplazamiento o sustitución
Tamaño de fragmento de ADN debe ser de igual tamaño al frgamento de ADN de lambda sustituido
Cósmidos
Son factores de clonación hibridos entre bacteriófagos y plasmidos
Utilizados para formar genotecas
Son encapsulados en fagos
Replicados como plásmidos en células huesped
Secuencias cos de cósmidos
Secuencias cos de fago lambda en cósmidos permiten clonar fragmentos de mayor longitud
Cromosomas artificiales de levadura (YAC)
Minicromosomas de levaduras
Usados para clonar fragmentos de ADN largos
Compisición de cromosomas artificlaes de levadura YAC
Dos telomeros: para replicaciónn y protección
Un centromero: para correcta segregación en replicación
Un origen de replicación: para replicación independiente
Un marcados seleccionable: para identificar células que han recibido nuevo cromosoma
Dianas de restricción: para facilitar clonación de ADN foraneo
Cromosomas BAC
Basados en plásmido F de E. coli
Cromosomas PAC
Derivados de bacteriofago P1
Vectores de expresión
Permite obtener producto proteíco de gen clonado
Promotor activo y regulable
Transformación
Entrada directa de ADN recombinante por medio de un plásmido en una abcteria (E.coli)
Tipos de células receptoras utilizadas en ingenieria genética
Bacterias
Saccharomyces cerevisia
Células de mamiferos
Bacterias como células receptoras
Primero y más usados
E.coli el más usado
Saccharomyces cerevisiae
Célula receptora
Levadura del pan
Células de mamíferos
Células recpetoras
Tranferencia de genes a células de mamiferos
Endocitosis de ADN en liposomas
YAC
Vectores basados en retrovirus
Genotecas
Archivos del genoma de una especie cortado en segmento
Almacenado en vector de clonación dentro de célula huesped
Mantiene separados fenes de un organismo para su facil acceso
Clasificación de genotecas
Segun origen de ADN clonado
Genomicas
ADNc
Expresión
Genotecas genomicas
Representan genoma completo de un individio
Genotecas de ADNc
Copias de ARNm de detrminado tejido o tipo celular
Genotecas de expresión
Uso de vectores de expresión
Permiten expresión de gen insertado
Construcción de genoteca genómica
-Extracción de ADN
-Digestión con enzima de restricción
-Clonación selectiva de todos los fragmentos
Vectires usados por genotecas
Fagos lambda
Cósmidos
BAC
YAC
En los humanos existen genotecas de cada uno de los cromosomas
Si
Construcción de genoteca de ADNc
-Purificación de ADN
-Retrotranscripción de ARNm a ADNc
-Sintesis de segunda cadena de ADN
PCR
Permite amplificar y selccionar ADN
Que se necesita para una PCR
Conocer secuencia de nucleotidos en extremos de fragmentos de ADN a copiar
Proceso de PCR
Desnaturalización del ADN
Emparejamiento de cebadores
Sintesis de ADN con Taq polimerasa
Hibridación de ácidos nucleicos
Fundamento del uso de sondas
Dos cadenas de ADN o ARN de dieferente origen se unen
Sonda marcada
Permite detección de hibridación de acido nuceloticos
Formas de marcacón de sondas
Nucleotidos unidos a atomo radioactivo
Nucleotidos unidos a moleculas identificadas por reacciones quimicas
dNTPs marcados con fluoresencia
Cribado
Identificar un gen en las genotecas
Por hibridación por sonda
Por PCR
Tecnicas inmunologicas en cribado
Union de anticuerpo marcado a proteína permite identificar colonias de bacterias importadoras del gen que las sitetiza
Hibridación in situ
Tecnica para determinar donde y cuando esta expresado un gen
Usa sonda de ADN o ARN marcado que es complementario al ARNm a estudiar
Proceso de hibridación in situ
Fijación de célula
Desnaturalización de cromosomas
Adición de sonda marcadp
FISH
Hibridación in situ por fluoresencia
Permite analisis de varios elementos
Transferencia de Southern
Para identificar secunecia genética especifica de fragmnetos resultantes de digestión de ADN
Proceso de transferencia de Southern
Digestión de ADN
Electroforesis en gel de agarosa
Desnaturalización de fragmentos
Hibridación con sonda marcada
Lavado de filtro
Exposición a rayos X
Técnica de Northern
Basada en técnica de Southern
Usa ARN
Util para obtener información de patrón de expresión de genes
Secuenciación del ADN
Permite leer información genética en ADN
Busca determinar orden de nucleótidos en secuncia de ADN
Metodos de secunciación
Químico (maxam y gilbert): modificación quimica y escisión de bases
Enzimático (sanger): uso de ddNTps, elongación de cadena
Secuenciación enzimática
Sintesis de cadena de ADN complementaria a la que se quiere secuenciar
Secuenciación automatica
Más rapido
Menos riesgo
Traducción de bases con detector laser
Mutagenesis dirigida
Tecnica para cambiar propiedades de genes
Hace sustituciones en aminoacidos en proteína codificada por gen
Cambia función de proteína
Proceso de mutagenesis dirigida
Obtención de cadena simple y oligonicleotido
Hibridación de oligonucleotido y se replica
Uso de oligonucleotido como sonda
Se secuencia región de interes para confirmar mutación
