Transferencia de embriones équidos Flashcards
Tasa de gestación
Transferencia no quirúrgica en fresco: 50-80%
Transferencia embriones congelados: 50-60%
Selección de donantes
DEFECTOS REPRODUCTIVOS-SUBFERTILES POTRAS DE DOS AÑOS: UNA CRIA POR AÑO YEGUAS DE GENÉTICA SUPERIOR YEGUAS EN COMPETICIÓN A la llegada: Desparasitar, vacunar. Historial reproductivo. Exploración genital externa. Exploración genital interna: palpación vaginal y rectal, y ecografía. Citología endometrial Cultivos bacteriológicos Biopsia Antes de comenzar: Evaluar 1 o 2 ciclos estrales (comportamiento, dinámica folicular, cambios uterinos y ováricos propios…)
Selección de receptoras
- Animales de poco valor genético, económico…
- Edad: 3-10 años
- Adecuado historial reproductivo: multíparas, evitar celo
del potro, sin abortos idiopáticos… - Talla similar o mayor a la donante.
- Examen del aparato reproductor normal: examen vaginal,
palpación rectal, ecografía, cultivo bacteriológico,
citología endometrial, biopsia uterina.
¡¡UNO DE LOS FACTORES MÁS CRITICOS DEL
PROGRAMA DE E.T. ES EL MANTENIMIENTO DE
YEGUAS RECEPTORAS!!
Solución:
- Aumentar el número de embriones recogidos
- Utilizar yeguas ovariectomizadas tratadas con progesterona.
Superovulación
la falta de un protocolo eficaz para inducir ovulación múltiple ha frenado el progreso de la ET equina.
- > El tejido gonadal equino muestra baja concentración de receptores a eCG.
- > Inusual anatomía del ovario (fosa de ovulación)
Gonadotropina coriónica equina (eCG)
GnRH
FSHp
Hormona del crecimiento
Inmunización activa y pasiva frente a inhibina
Gonadotropinas extraídas de glándulas pituitarias equinas (EPE)*** 1,7 a 3,8 ovulaciones/ciclo.
Gonadotropinas extraídas de glándulas pituitarias equinas (EPE)
Problemas:
• No se comercializa en Europa
• Su actividad biológica es muy variable
• Al ser extracto de cerebro existe riesgo de persistencia de priones
Ventajas:
• Aumenta las ovulaciones
• Se obtiene un 50% de embriones con respecto al número de
ovulaciones
PAUTA DE ADMINISTRACIÓN
25 mg cada 12 h a partir del día 5-6 post-ovulación
= 7.1 ovulaciones /ciclo
Sincronización e inducción de la ovulación
permite sincronizar los ciclos de donantes y receptoras, predecir aproximadamente el momento de la ovulación y gestionar las inseminaciones. • Inducción y sincronización de celo: PGF2α (Solución sobresaturada ClNa) Progesterona + PGF2α Progesterona + 17β estradiol + PGF2α Trat. Lumínicos • Inducción de la ovulación: Gonadotropina coriónica humana (HCG) Agonistas GnRH: buserelina Deslorelina
Las receptoras deben ovular 1 día antes o hasta 3 días
después que las donantes
Si las receptoras ovulan 2-3 días antes: (inhibidor de la PG sintetasa) desde el día 7 al día 9 después de la ET (Wilsher y col, 2005)
- Altrenogest 12 ml/día desde recogida a d50 (Acosta y col, 1997)
Día de lavado
día 6: recogida para congelación
día 7-8: ↑ tasa de recogida embrionaria
día 9: ↑daños durante recogida y transferencia
¿Jeringa con embrión?
- 0,25 cc pajuela + adaptador + jeringa tuberculina
- 0,5cc pajuela + adaptador + jeringa tuberculina
FLUIDO - AIRE FLUIDO CON EMBRIÓN- AIRE - FLUIDO.
Conservación de embriones
Refrigeración: bajada 0,5 grados/min hasta 5ºC, en un medio F10 de Ham. Alta viabilidad. Limitaciones: hasta 24h.
Congelación:
- bajada de 0,5 grados/min hasta -6ºC
- bajada de 0,3 grados/min hasta -30 grados
- bajada de 0,1 grado/min hasta -33ºC.
Medio de glicerol, etilenglicol o metanol. Glutamina. Sucrosa. Largo periodo de conservación.
Limitaciones: tiempo empleado, equipamiento caro, no viable para blastocistos de tamaño mayor de 300micras.
Vitrificación:
Congelación a 196ºC en nitrógeno líquido.
Medios: Glicerol. Etilenglicol. Galactosa.
Ventaja: Largo periodo de conservación, congelación rápida, método barato.
No aceptado por la mayoría de las asociaciones.
Refrigeración de blastocistos
La refrigeración nos permite mantener embriones a 5º C, durante un periodo no
superior a 24 horas, de modo que podemos transportar embriones a distintas localizaciones para transferir a las hembras receptoras.
• Protocolo de refrigeración (D. Vanderwall et al., 2000) :
1.- Gaseamos una botella de 100 cc. de medio F-10 de Ham (con nutrientes,
aminoácidos, vitaminas y otros componentes) con la mezcla de gases (5% CO2,
5% O2 Y 90% N2) durante 3-5 minutos para amortiguar el medio.
2.- Suplementamos el medio con 10% suero fetal bovino, penicilina (100 unidades/
ml) y estreptomicina (100 μg/ml).
3.-Esterilizamos el medio F-10 de Ham por filtrado y lo colocamos en tubos de 5 ml
con tapa a presión dejando un espacio de aire en la parte superior.
MEDIOS EMPLEADOS:
• Ham F-10 (5 ml) con SFB, gaseado 5% CO2, 5% O2 y 90%
N2 a 24h a 5-37ºC
• Ham F-10 con SFB, HEPES (5 ml) a 24h a 5-37ºC
• Medio de mantenimiento comercial (5 ml) 24h a 5ºC
(Syngro, Vygro, EmCare)
• Medio de flushing Zwitertónico (500 ml) a 5ºC
4.- Transferimos cuidadosamente el embrión, previamente lavado con medio DPBS
con 10% de suero fetal bovino, dentro del medio, colocamos el tapón a presión y envolvemos el tubo en parafilm.
5.- Llenamos un tubo de centrífuga de 50 ml con medio F-10 de Ham no filtrado y se coloca el tubo de 5 ml conteniendo el embrión, colocamos la tapa del tubo
de 50 ml tratando de eliminar la mayor cantidad de aire posible y lo envolvemos en parafilm.
6.- Mantener el embrión a temperatura de refrigeración (5º C) disminuyendo
previamente la temperatura unos 0.5ºC por minuto. El sistema de refrigeración y
transporte Equitainer® para semen equino también es utilizado para transportar embriones en condiciones de refrigeración.
Congelación convencional de blastocistos
Dificultades de la Congelación de Blastocistos Equinos:
En el blastocisto de 6.5 a 7 días se desarrolla la cápsula, una membrana de glicoproteínas que
otorga la característica al embrión equino de flotar libremente por el útero hasta que se produce su
su implantación, y además, impide la penetración del agente crioprotector.
¿Cómo aumentamos el éxito en la congelación?
-Recogida de embriones de 6 días y <200 μm de diámetro
(mórula).
-Tratamiento enzimático con Tripsina → ↑ penetración de la cápsula por el agente crioprotector
Solución diluyoconservadora para congelación
• Sucrosa: solución no penetrante que impide que la membrana se desestabilice durante el enfriamiento.
• Glicerol 10% en PBS con suero fetal bovino (0.4%): solución penetrante que evita la formación de cristales intracelulares durante la congelación, gracias a su intercambio con el agua intracelular durante un equilibrado de 20 minutos.
Presenta elevados porcentajes de supervivencia en los embriones, pero tiene el inconveniente de su eliminación, pasando el embrión por soluciones decrecientes de sucrosa.
• Etilenglicol 1.5 M: solución penetrante que no precisa de eliminación.
• Glutamina: se ha demostrado que adicionando 100 μm de glutamina a la solución incrementa la supervivencia de los embriones.
Los embriones de 6 o 7 días se cargan en pajuelas de 0,25 ml y los embriones de 8 o 9 días en pajuelas de 0,5 ml.
Vitrificación: definición, ventajas e inconvenientes.
La vitrificación es un proceso físico de criopreservación donde una solución líquida es transformada en un sólido particular amorfo y estable, llamado vítreo, cuando se congela a bajas temperaturas (criogénicas) utilizando altas
concentraciones de crioprotectores.
Ventajas:
↑ Viabilidad embrionaria (60-75%)
↓ Tiempo (3-4 min/embrión)
↓ Coste (equipamiento poco complejo
Inconvenientes: ↑ Concentración de crioprotector →Toxicidad celular Eliminación del crioprotector tras la descongelación
Protocolo de vitrificación
Recogida de embriones a los 6.5 días de gestación, siendo lavados y colocados
en una placa de Petri con solución conservadora durante menos de 20 minutos antes de su vitrificación.
Preparación de la solución de vitrificación y de dilución. A partir de medio PBS sin calcio ni magnesio, suplementado con 0.3 mM de piruvato de sodio, 3.3 mM de glucosa y 20% de suero fetal bovino, añadimos glicerol, etilenglicol y galactosa para crear las soluciones de vitrificación y dilución.
• Sometemos al embrión a incrementos en la concentración de crioprotector en 3 pasos:
– 1.4 M de glicerol en PBS durante 5 minutos.
– 1.4 M de glicerol y 3.6 M de etilenglicol en PBS durante 5 minutos.
– 3.4 M de glicerol y 4.6 M de etilenglicol en PBS durante menos de 1 minuto.
• Depositamos el embrión en una pajuela de vitrificación (Open Pulled Straw)
– 90 μl de solución 0.5 M de galactosa en PBS.
– Burbuja de aire de 5-10 μl
– Embrión en 30 μl de solución de vitrificación 3.
– Burbuja de aire.
– 90 μl de solución 0.5 M de galactosa en PBS.
• Colocamos la pajuela dentro de un recipiente de plástico de medidas 10 x 120 mm,
sobre un recipiente con nitrógeno líquido, sujeta por dos fórceps de modo que es sometida a la acción del vapor durante 1 minuto. Transcurrido este tiempo
introducimos la pajuela dentro del recipiente de plástico en el nitrógeno líquido.
• Descongelación:
– Temperatura ambiente durante 10 segundos.
– 20-22 ºC durante 10 segundos.
Éxito en un programa de ET
- Identificar los factores que afectan a la tasa de gestación y pérdida embrionaria
- Controlar los puntos críticos
- > Método de transferencia
- > Manejo del embrión
- > Sincronía D-R
- > Técnico
- > Estación
- > Morfología embrionaria
- > Tamaño y edad de los embriones
- > Historial de las donantes
Factores relacionados con las yeguas receptoras
• Edad de la yegua receptora:
ME en yeguas viejas, aunque no hay diferencias entre grupos de 2-9 y 10-18 años (Carnevale y col, 2000)
• Estación:
Yeguas en transición tienen mayores pérdidas embrionarias
Tras el 1º celo es posible albergar embriones con igual éxito que ciclos posteriores
Las yeguas se pueden utilizar en ciclos sucesivos si quedan vacías;
descartar en caso de patología reproductiva
Al final de la estación, meses calurosos reducen la viabilidad del transporte, stress…; además quedan las yeguas más problemáticas.
• Tono uterino:
Reducido tono uterino está asociado a pérdida embrionaria, indicando alteración del ambiente uterino
