Thérapie génique Flashcards
1
Q
2 principaux types de thérapies géniques :
A
- augmentation de l’Expression des gènes
- diminution de l’expression des gènes
2
Q
Augmentation de l’expression des gènes consiste à quoi ?
A
- applicable aux maladies où l’expression d’une prot doit être ^.
- utilisation de vecteurs viraux ou liposomes pr tx de maladies génétiques
3
Q
diminution de l’expression des gènes consiste à quoi ?
A
- applicable aux maladies où l’expression d’une prot doit être diminuée
- vecteurs ou liposomes
4
Q
Notion d’immortalisation ¢laire (concept)
A
-après plusieurs divisions => érosion des télomères => sénescence ¢laire => impossible d’utiliser ces ¢ pr les étudier
=>régions télomèriques vont se dégrader => reste ds phase G1 => active machinerie qui va supprimer les gènes responsables de la division ¢laire=> état irréversible du mécanisme de croissance
5
Q
Phénomène rare dans la notion d’immortalisation ?
A
-¢ survit à la crise menant à la sénescence => devient immortelle (télomérase devient active)
6
Q
notion de transformation ¢laire :
commenet une ¢immortelle peut devenir une ¢immortelle transformée ? (3)
A
- Mutations supplémentaires
- Réarrangements chromosomiques
- Infection avec certains types de virus
7
Q
notion de transformation ¢laire :
¢ immortelle : 4 événements peuvent expliquer l’immortalisation ¢laire
A
- activation de voies de survie
- activation télomérase
- fct anormale de suppresseurs de tumeurs (p53, prb) => prots clés pour les pts de contrôle
- Erreurs au niveau de la réplication et du maintien de l’intégrité des chromosomes
=> ¢ se divise indéfiniment, mais peut ressembler aux ¢ primaires
8
Q
notion de transformation ¢laire :
4 exemples pk les ¢ immortelles transformées ne ressemblent PAS aux ¢primaires d’origines
A
- petites
- prolifèrent en absence de sérum (facteurs de croissance)
- pas d’inhibition de contact (formation de foci)
- détachent facilement du vase de pétri
=> ¢ a un phénotype transformé => ressemble à une ¢ cancéreuse ou progénitrice
9
Q
2 façons pour la production de virus et changement de phénotype (ex.: transformation)
A
- virions => infections ds ¢ en culture => production de virus
- virions => isolation de l’ADN => ADN viral purifié => transfection ds agent de transfection (électroporation, lyposomes ou agents de trans)=> produc. de virus
10
Q
Lignées ¢laire :
définition d’une ¢ primaire ?
A
¢ cultivées de sujet sains => pot. de divison ¢laire limité et sujettes à la sénescence
11
Q
Lignées ¢laire :
définition de lignées cancéreuses et quelle type de division ?
A
¢ cultivées qui proviennent de tumeurs et
se divisent indéfiniment
12
Q
Lignées ¢laire :
définition de lignée transformée
A
modifiée phénotypiquement et présente des similitudes frappantes ak des ¢ cancéreuses
se divise indéfiniment aussi
13
Q
Lignées ¢laire :
exemple de ¢ transformées par adn viral
A
¢HEK293 et COS => humaines
(à l’aide de ¢ Ad5 ou Ad5 + Large T antigen
14
Q
virus SV40 : caractéristiques
A
- ADNdb
- facile de manipuler / digéré avec des endonucléases
- 2 régions topologiques (précoces et tardives ) => pour produire 2 prots distinctes.
- Origine de réplication = site de réplication : dualité de fcts
15
Q
2 protéines distinctes du virus SV40?
A
early : large T antigen
late : prot. de la capside
16
Q
Particularité de la région ORI du génome SV40 ?
A
-responsable de la réplication de la transcription des gènes viraux
- double fct :
1. permet induction de messagers précoces (LTA)
2. réplication du mini -cx (grace au LTA)
-Présence de ori => permet la réplication du plasmide SEULEMENT SI LE LTA EST EXPRIMÉ DS CETTE ¢ => ¢ doit préalablement avoir été transformée par le LTA (essentielle pr produire virions)
17
Q
Prot. LTA mécanisme :
régulation du cycle ¢laire
A
- inhibition de 2 marqueurs : PRB et p53 => pas de fct de pts de contrôle du cycle ¢laire
1. prb (e2f) => qui inhibait la transcription (par e2f), mais si pas de prb => pas d’inhibition => prolifération
- p53 (gardien du génome) :
normalement : p53 active => p21 va inhiber CDK4 => stop cycle ¢laire
mais mtn => p53 inhibé => p21 va pas inhiber cdk4 => cycle ¢laire continu
bref : En fait le L-Tag agit sur la fonction des gènes dist suppreseurs de tumeurs : p53 et prb (checkpoint du cycke ¢aire ,favorisera la prolifération ¢laire et par conséquent le passage d’un état physiologique
18
Q
LTA + ori SV40 = outiles de biologies moléculaires importants pk ?
A
- ¢ transformées de manière stable par SV40 exprimaient le LTA
- Lignées qui expriment LTA sont transformées => utilisées pr induire la réplication de plasmides possédant le promoteur SV40
19
Q
LTA + SV40 : mécanisme
A
¢ transformée par SV ou simplement par LTA => transfection d’un plasmide avec un insert et SV40 ori
=> LTA ds le noyau de la ¢ se lie au SV40ori => réplication du plasmide grâce au LTA et production d’une grande qt de prots grâce à l’insert
20
Q
5 techniques de transfection avec ADN plasmidique et vecteurs encodant pr produits viraux ?
A
1. DEAE-Dextran 2- Phosphate de calcium 3. Lipofection 4. Électroporation 5. autres méthodes
=> particularités pr l’efficacité de transfection
21
Q
Que représente l’efficacité de transfection ?
A
% de ¢ qui expriment un transgène après la transfection
22
Q
Comment étudier l’efficacité ?(méthode)
A
observation de laGFP par microscopie à fluorescence après la transfection
23
Q
Expression stable vs transitoire
A
=> méthodes de transfection = > pas une expression stable des gènes (transitoire) => pcq perdu à la mitose, sera éventuellement dégradé et ¢ transfectées prolifèrent moins et seront diluées
24
Q
Comment enrichir provisoirement la pop. transfectée ?
A
à l’aide d’un agent de sélection (antibiotique)
si : plasmide a un ORI fctnelle ds une ¢ eucaryote (ex SV40 ori + LTA) => générer une pop. de ¢exprimant de manière stable un transgène ET possibilité d’intégration de l’ADN ds le génome de la ¢
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co transfections
transfecter un mélange de plusieurs plasmides ds des ¢ eucaryotes => utile pr production de virus en thérapie génique
26
Technique :Transfection DEAE-dextran
- deae-dextran = polymère cationique (méthode la plus OG)
| - mélange de deae-dextran + adn => complexes qui seront transfectés ds des ¢ => absorbés par endocytose
27
Technique : Transfection au phosphate de calcium (1970s)
peu de ¢ primaires peuvent être transfectées de cette manière.
=>ca2+ + ADNplasmidique => ds sln de phosphate => précipités d'ADN ds CaPO4 => ds ¢
28
Technique : Transfection ak des liposomes cationiques (lipofection) 80s
- meilleure efficacité de transfection que 60s & 70s
- livraison d'ADN de tailles variables ds ¢, arn et prots
-pas optimisés pr in vivo :toxicité de plusieurs formes
29
Technique : Électroporation / nucléofection
-certaines ¢ impossibles à transfecter ak agents 60s-70s-80s => formation de pores momentanéments ds la bicouche lipidique
30
Technique :Microinjection
- introduire du matériel génétique ds noyau d'une ¢ ak aiguille
- utilisée pr introduire ADN ds oeufs fertilisés pr animaux transgéniques
31
Technique :
| Bombardement de particules (biolistique) aka gene gun
-propule à grande vitessede l'ADN lié à des billes de métal
32
est-ce que ces techniques sont utilisées en thérapie génique ?
- gene gun : non
| - électroporation : vaccination
33
Thérapies géniques, il faut quel genre de méthode?
-capable de véhiculer ADN tx ds un fluide corporel et permettre son entrée ds ¢
=> + utilisée = lipofection
34
2 types de vecteurs ds thérapies géniques
- vecteurs viraux
| - vecteurs n-viraux
35
Définition d'un vecteur viral et caractéristiques
- virus modifié génétiquement et utilisé pr infecter des ¢
- permettent une expression stable
- meilleure efficacité que les 5 techniques avant
- outils potentiels de thérapie génique
- utilisation laborieuse pcq risque contamination, prolifé.
36
définition de transduction
efficacité de transfection
37
3 thérapies géniques ak vecteurs viraux
1. adénovirus
2. rétrovirus (+ lentivirus)
3. virus adéno-associés
38
9 caractéristiques recherchées des vecteurs viraux
| 1
1. n-pathogène
2. n-multiplication in vivo
3. capacité d'Accueil suffisante
4. n-immunogénicité
5. xpression permanente/régulée
6. spécificité tissulaire ( point critique qd on fait de la thérap.géni => dommage collatéraux?
7. Infection de ¢mitotiques /quiescentes
8. capacité d'intégrer le génome à 1 seul site (spécificité)
9. pas d'infection des lignées germinales
39
qu'est-ce qu'une lignée d'encapsidation ? et définition de virus défectifs
principe similaire de (SV40 + LTA => réplication de plasmides comportant ORI + promoteur SV40)
- Lignées expriment de manière stable 1 ou plusieurs prots essentielles à la réplication de plasmides viraux et/ou à son encapsidation (pcq plasmides viraux ont pas ces prots)
=> donc virions produits vont pvr infecter des , mais pas capable de se reproduire => VIRUS défectifs
40
Adénovirus caractéristiques
- forment des virions n-enveloppés (36kb)
- mauvaise intégration au génome
- classés en early (e) et late (L)
- QT d'adn transportée est limitée par la taille de la capside
- adénovirus peuvent infecter des ¢ de division ou ¢quiescentes
41
3 gènes du génome
adénoviral
ressemble à quoi ?
E1A, E1B et E3
hexagone avec des fibres qui sortent à chaque coin
42
Fonction E1A et E1B ? e3 ?
A=> régule le cycle ¢laire (comme LTA) => séquestration de RB => e2fpermet la réplication virale
B=>séquestration de p53 => permet transition phase S automatique
e3 : Supression de la rép. immunitaire
43
Cycle viral des adénovirus (5) (pr former des virions)
1. attachement
2. pénétration par endocytose
3. décapsidation et migration de l'ADN viral vers le noyau
4. Cycle réplicatif (2 phases)
5. assemblage et libération des virions néo-synthétisés
44
3 techniques pour produire des adénovirus recombinants (contiennent le transgène)
1. Digestion et ligation directe du transg. et du génome viral MAIS difficile de purifier, peu de SdR et formation de gros fragments
2. recomb. site-spécifique (cre-lox)
3. Recombinaison homologue (2 vecteurs)
a) vecteur navette : contient transg
b) vecteur squelette : contient min. essentiel
du gén. adénoviral
=> consiste à cloner transgène ds vecteur navette => transformer en bactérie qui contient vecteur squelette
=> vecteur recomb => isolé et transfecté ds lignées d'encapsidation qui fournissent pr induire la production de virions contenant le transgène
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Productions d'adénovecteurs (3)
1. Digestion etligation directe
2. Recombinaison CRElox = éviter que notre plasmide helper devienne encapsidé ds syst.
3. Recombinaison homologue
46
Avantages des adénovirus en thérap. génique (5)
- Capcité d'ADN de 5-37 kb (bonne capacité d'insertion de transgènes)
- Transduction très efficace ds bcp de tissus
- Infecte les ¢ indépendamment du cycle ¢laire
- pas de pathogénicité
- Production de titres élevs
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Désavantages des adénovirus en thérap. génique
- Expression transitoire. Expression p-e durable ds ¢ quiescentes
- Pas d'intégration
- Prots de la capside sont fortement immunogène
- Réponse. forte d'AC suite à la 2e infection
- dose élevée peut entrainer la mort
48
Rétrovirus : caractéristiques (4)
- virus à ARN sb enveloppés de 7-9kb
- effectuer RT avant de pvr incorporer le génome de l'hôte
- Processus complexe de RT fait apparaître des séquences de LTR (long terminal repeats, absentes du génome d'ARN) de part et d'autre de l'ADN bicaténaire
-peuvent PAS infecter les ¢ quiescentes sauf pour lentivirus
49
rétrovirus : particularités de l'ARN (3)
- gag : groupe spécifique antigène
- pol: polymerase
- env : enveloppe de glycoprots
50
LTR : caractéristiques
| et permettent quoi ? (3)
-produits grâce au processus complexe de transcription inverse
1. Intégration génomique
2. transcription : slm la LTR en 5' => promoteur
3. LTR en 3' fournit la séquence AATAA (coupure pour polyA)
51
Comment produire un rétrovirus recombinant ?
Il faut diviser les gènes viraux sur plusieurs vecteurs => on veut générer des virions qui n'auront pas la capacité de se RÉPLIQUER DANS L'HÔTE.
Donc, séq gag, pol et env => pas encapsidées
1. transfecte HEK293 avec 3 plasmides (co-transfection). Les ¢ transfectées vont exprimer GAG,POL et ENV => PERMETTENT l'encapsidation de la séq. d'intérent présente sur un vecteur contenant les LTR.
52
Avantages des rétrovirus en thérapie génique (4)
- S'intègre ds génome
- 8-10kb d'ADN
- faiblement immunogène
- Spécifier le tropisme en modifiant les prots de l'enveloppe
53
Désavantages des rétrovirus en thérapie génique (5)
- peut causer cancer
- gène intégré p-e inactivé
- SEULEMENT les ¢ en division sont infectées
- Production de titres faibles
- Risques associés à la prod. et à la libération de virions in vivo
54
Avantages AAV en thérapie génique (5)
- Forme des anneaux circulaires qui permettent une expression stable (épisomes)
- N-pathogénique
- N-immunogène
- Infecte ¢ quiescentes et en division
- Plusieurs sérotypes aux tropismes variés
55
Désavantages AAV en thérapie génique (4)
- Faible capacité (4,7kb)
- Difficiles à produire
- Possibilité de mobilisation du virus chez l'humain
- Contamination avec virus helper
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AAV : caractéristiques
- Génome contient 2 Open reading frame
- AAV n-recombinants : capacité à intégrer le génome à un emplacement spécifique
- associés à la mbr sous forme d'épisome n-intégré
-dépendovirus = > dépendent de la présence d'un autre virus pr se multiplier (virus accessoire/helper)
57
Vecteurs AAV + Ad DNA + AAV helper
AAV vecteur : exprimant le transgène entre les ITR
Ad DNA : exprimant les gènes E2, E4 et VA d'un adénovirus
AAV helper : exprimant les gènes Rep et CAP d'un AAV
=> utilisation de plusieurs types de syst.
et ajout d'un adénovirus qui va servir pr la régulation du virus
58
Génome du VIH : 9kb pour 9 prots
a) génome VIH est composé de 3 gènes de structures (gag,pol,env), 2 gènes de régulation (rev&tat) et 4 gènes accessoires (vif,vpr,vpu et nef)
b) 2 molécules d'ARN sb sont encapsidées => les mbrs interne et externe sont composées des prots MA et Env
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3 générations de vecteurs VIH
1. enveloppe exclue => toutes les prots virales sauf ENV sont exprimées ds le plasmide d'encapsidation. À la place de ENV, un autre plasmide encode le VSV-G => SEUL TRANSGÈNE EXPRIME LE SIGNAL D'ENCAPSIDATION
2. same que 1, mais prots. accessoires sont toutes exclues du plasmide d'encapsidation
3e .Rev est exprimé sur un autre plasmide . Le plasmide encodant le transgène est aussi modifié afin de déléter la région U3 du LTR en 5' et partiellement déléter le LTR en 3' ( pas LTR actif) => 3gènes sur 9 sont exprimés (gag,pol , rev)
=> utilisation de 4 plasmides ds notre lignée d'empactage
60
4 Méthodes pour la concentration des rétrovecteurs
1. Ultracentrifugation
2. high-speed centrifugation
3. précipitation avec calcium phosphate
4. Filtration à l'aide d'un filtre à 100 kDa
61
3 façons d'augmenter l'effciacité de transduction des rétrovecteurs
(transduction = virions ready ak les gènes => pénétration ds ¢hôtes)
1. utilisation de polybrene réduit la charge de répulsion entre les virions et les ¢cibles
2. Retronectin augmente l'efficacité de transduction de certains lenti-vecteus en augmentant l'adhésion
3. Spinoculation (centifugation ak rétrovecteurs ) induit un stress ¢laire qui augmente l'endocytose des virions
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particularité de la région u3
u3 du LTR est essentielle à la réplication virale. Pas requise pr l'expression d'un gène. Les vecteurs (self-inactivating) sont donc incapable de reconstituer le promoteur viral. Ils sont donc + sécuritaires
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Types de vecteurs
a) non- SIN vector ou wildtype ( délétées en région u3)
| b) sin vector (sans ou avec promoteur)
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Oligonucléotides antisens : mécanisme
Adn génomique =>transcription en pré-ARNm=> épissage et maturation en ARNm mature (cible la + fréquente)
^^efficacité ds contextes in vitro et animaux
65
Fonction et caractéristiques des antisens
Souvent des oligonucléotides d'ADN (AON) d'environ 20-mer. Ils vont empêcher la traduction
66
autre fonction des oligonucléotides ?
- masquer des sites d'épissage (exonskipping)
| - utilisés pour ajouter un exon (trans-épissage)
67
Mécanismes d'actions des AON (3)
1. RNAse dégrade entre autres les amorces d'ARN du brin retardé lors de la réplication de l'ADN (enzyme n-spécifique) => coupe que l'ARN ds l'hétéroduplex
2. AON peuvent bloquer la traduction par encombrement stérique au niveau du ribosome ou en bloquant la liaison du cap en 5'
3. AON peut déstabiliser les pré-ARNm ds le noyau, empêcher leur épissage et altérer l'Expression d'une prot.
68
Comment contrôler une expérience qui utilise des antisens ? 3 exemples
- oligonucléotides mélangés
- 1 ou 2 nuclé. différents ds la séquence
- Complémentation ¢laire avec une construction mutante
69
Comment contrôler une expérience qui utilise des antisens ?
a) Antisens va à la région complémentaire => dégradation de l'ARNm => effet physiologique mesurable
b) ARNm transgène => se fixe et mutant => pas de dégradation de l'ARNm du transgène mutant => plus de diminution de réponse = reconstitution ou complémentation
70
ARN interférence définition ?
mécanisme naturel qui consiste à la dégradation hautement spécifique de transcrits (viraux) suite à une infection
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2 voies de ARN interférence (diapo 70)
1. Micro-ARN(miRNA), transcrits par le génome, et qui régulent l'expression de nbrs messagers (n-viraux)
2. voie d'ARN interférence qui produit des short interference RNA (siRNA) => réponse immunitaire aux infections virales.
=> petits ARN db spéciaux sont produts et l'un des brins du duplex sera utilisé pour reconnaître et dégrader PRÉCISEMENT les ARNm complémentaires par un mécanisme différent des antisens
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2 voies de ARN interférence (diapo 70)
voie commune ?
voie propre au mir ?
voie commune :
dégradation ARNm hautement spécifique
voie propre aux miR :
inhibition traduction
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Utilisation des siRNA et des shRNA (2 façons)
- transitoire (siARN) => dans liposome => forme lipoplex => transfection et forme ARNi (RISC)
- + stable (shARN) => clonage dans un plasme (séléction possible avec antibiotique) => transcription ds l'hôte => dicer => ARNi (risc)
74
Vérification du knock-down par RT-PCR / WB
-si ARN subit un knockdown => observation de 2 choses : diminution de l'ARNm ciblé par siRNA + diminution de la prot. traduite
75
ribozymes (arn ak activité enzymatique) sont quoi ? (3)
- ARN catalytiques de 40-50 nt ak site de liason au substrat (spécifique) et domaine catalytique (RNase) qui clive le substrat lié => souvent de petite taille et existent ds la nature (hammergead + hairpin)
- libérés par liposomes ou par des vecteurs contenant le ribozyme (Vecteur viraux de la tx génique) => fragiles et modifiables
- n-immunogènes
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CRISPR c'est quoi ?
- séquences répétées à intervalle régulier
- protègent les bactéries contre infections phagiques
- répétitions se rencontrent ds les lignées d'archébactéries et de bactéries, mais pas encore vus chez eucaryotes
77
structure CRISPR/CAS9 en thérapie génique
- CRISPR/CAS9 => endonucléase spécialisée pr couper ADN sur les 2 brins de la double hélice
- Ak séquences complémentaires sgRNA, CAS9 permet d'éditer le génome
