ARN interférence Flashcards
Comment on peut étudier la fct d’un gène ?
-^ ou diminuant son expression (^ qd expression d’un gène est peu ou pas exprimé/ actif et vice versa)
2 types d’études de surexpression/sous-expression peuvent être faites de 2 façons
Transitoire (tx de ¢ en culture ak oligo anti-sens)
Permanente (souris trans-géniques)
La surexpression d’un gène peut permettre quoi ? (2 caract)
- fct du gène (variation du phénotye informe sur le rôle + modif d’intéractions entre prots)
- ^ peut entraîner un débalancement => donner des phénotypes qui ne sont pas nécessairement représentatif de la fct de la prot.
La diminution (knock-down) peu permettre quoi ? (3 caract)
- informer sur la fct du gène ( perte de fct observable, modif du comportement ¢laire)
- Perte d’Expression du gène => pas nécessairement une modif.observable
- Corriger une surexpression pathologique
Comment diminuer l’expression d’un gène :
ARN antisens
1- ARN antisens : ADNc dont l’orientation a été inversée est cloné ds un vecteur d’expression => transfecté ds ¢où l’ARN antisens sera exprimé à partir de cette construction. L’ARN antisens s’hybride à l’ARNm cible => traduction bloquée
Comment diminuer l’expression d’un gène :
OLIGO-antisens
Oligo(15-24 nu) dont la séq. Est complémentaire à l’ARNm cible est introduit ds la ¢et va s’hybrider à cet ARNm => empêche la traduction du gène par diff. Mécanismes
Comment diminuer l’expression d’un gène :
Ribozymes
ARN catalytique de 40-50 nu possédant une portion de liaison au substrat (reconnaissance de séq. Spécifique) et une portion catalytique (coupure arn cible)
Comment diminuer l’expression d’un gène
ARN interférence : siRNA
siRNA => ARN db de 20-25 nu => coupure par nucléase Dicer d’un ARNdb contenant la séq. Cible, s’associant à un complexe RISC et => reconnaissance + coupure de l’ARNm cible par le complexe.
-Mécanisme naturel qui p-e utilisé pr diminuer l’xpression de gènes spécifiques
Comment diminuer l’expression d’un gène
ARN interférence : shRNA
ARN codé par un plasmide ak 2 portions de séq. Compl. Formant une structure en épingle => réponse similaire au siRNA
Comment diminuer l’expression d’un gène
ARN interférence : miRNA (micro)
Court ARN (22 nu), structure semblable au shRNA => ds ¢eucaryotes impliqué ds régu. Post-transcrip
Comparaison de méthodes d’inhibition de gène
Knock-out animal ( + et - )
+ : Inhibition COMPLÈTE du gène
- : $, COMPLEXES, mutants létaux peuvent empêcher le dev. Embry
Comparaison de méthodes d’inhibition de gène :
Petites molécules inhibitrices
+ : introduction facile
- : spécificité variable, travail de dév intensif
Comparaison de méthodes d’inhibition de gène :
Anti-sens DNA
+ : SIMPLE , peu onéreux
- : efficacité et spécificité variable, besoin transfection
Comparaison de méthodes d’inhibition de gène :
RNA interference
+ : SPÉCIFIQUE, facile
- : knock down ( PAS KNOCK OUT) , besoin transfection
ARN antisens (caractéristiques 5)
- Inhiber la traduction d’ARNm spécifiques
- ARN généré instable
- Effets variables selon la cible et efficacité très variable : éteint le gène ds certains cas ou aucun effet
- effets n-spécifiques
- moins utilisé qu’avant
Principe de l’ARN antisens
- ADNc du gène cible est cloné ds un vecteur d’expression en orientation inverse
- Construction est transfectée ds ¢ où ARN antisens est synthétisé
- ARN AS s’hybride spécifiquement à l’ARNm cible et bloque traduction
- Intéraction stoechiométrique (1 :1)
OU
Antisens => inhibe ARNm=> pas d’Acti. De type catalytique
oligonucléotides antisens(3 caract)
- Oligonucléotide antisens d’ADN 15-20 nu => se lie à une cible complémentaire d’ARNm
- bloque la traduction de gènes spécifiques
- Organisation spatiale et repliement de longs ARNm => interdir accès de l’oligo sur certaines portions de l’ARNm (doit donc cibler des zones accessibles)
Mécanisme oligonucléotides (ADN)
- plupart des oligo antisens sont hybridés à leur cible => activent RNase H => clive la partie ARNm cible => effet CATALYTIQUE (reste ADN intact) (pas obligatoire d’activer RNase H)
- hybridation de l’oligo à l’ARNm cible bloque la traduction par encombrement stérique du ribozome => effet STOECHIOMÉTRIQUE
guide d’étude :
liaison à un ARNm cible => déstabilisation des pré-ARNm, blocage de la traduction (ARNm=> prots), Si oligo active RNase H => activité de type CATALYTIQUE possible, sinon act. stoechio
Modifications pr améliorer la stabilité des oligo.antisens (4)
- oligo.anti d’ADN n-modifiés => rapidement dégradés par nucléases ds la ¢
- Modifier chimiquement les nuc. Pr les stabiliser
- Phosphorothioate : + utilisé
- 2e génération (substitu carbone 2)
(comparaison des 2)
Modifications pr améliorer la stabilité des oligoantisens
Phosphorothioate vs 2e gén
Phospho :
- soufre remplace un O du Phosphate
- résistant aux nucléases que nucléotide phosphodiester
- appariements normaux ak bases appariées lors de son appariement avec ARNm
- active RNase H
- Liaison augmenté à certaines prots => possible toxicité (SNC)
2nd gen :
- moins toxiques
- ^ affinité pr cible
- active pas RNase H
Oligonucléotide antisens : Gapmers : fct
-active RNase H en évitant la dégradation => gapmers = oligonucl. Hybride incorporant 2 caract :
- séquence centrale d’ADN ou adn à phosphorothioate
- Nu. Modifiés aux 2 extr. Pr protéger la dégradation (MOE)
Dream team : phosphoro + MOE
Oligonucléotide antisens : Transfert ds ¢ (5 méthodes)
- endocytose médié par des rc (pas efficace + peu réponse)
- microinjection (peu de ¢traitées)
- Lipides cationiques ( + utilisée pr transfert ds ¢ en culture)
- électroporation
- Méthodes de transfert in vivo (vecteurs viraux)
Oligonucléotides antisens :
Fonction des contrôles ?
- s’assurer que l’effet est spécifique à l’inhibition par l’antisens.
- comportement p-e influencé par sa composition nucléotidique + props. Globales (ex. conformation)
Oligonucléotides antisens :
4 types de contrôle
- structure similaire : mais ayant un séquence nucléotidique différente
- Séquence mélangée : mm composition nucléotidique mais ds ordre différent => structure secondaires différentes : oligonucléotides sens
- Mésappariement ou + pr démontrer la spécificité de l’hybridation de l’oligonucl
- utilisation de lignés ¢ ayant le gène cible muté, délété que l’oligo ne peut cibler.