ARN interférence Flashcards
Comment on peut étudier la fct d’un gène ?
-^ ou diminuant son expression (^ qd expression d’un gène est peu ou pas exprimé/ actif et vice versa)
2 types d’études de surexpression/sous-expression peuvent être faites de 2 façons
Transitoire (tx de ¢ en culture ak oligo anti-sens)
Permanente (souris trans-géniques)
La surexpression d’un gène peut permettre quoi ? (2 caract)
- fct du gène (variation du phénotye informe sur le rôle + modif d’intéractions entre prots)
- ^ peut entraîner un débalancement => donner des phénotypes qui ne sont pas nécessairement représentatif de la fct de la prot.
La diminution (knock-down) peu permettre quoi ? (3 caract)
- informer sur la fct du gène ( perte de fct observable, modif du comportement ¢laire)
- Perte d’Expression du gène => pas nécessairement une modif.observable
- Corriger une surexpression pathologique
Comment diminuer l’expression d’un gène :
ARN antisens
1- ARN antisens : ADNc dont l’orientation a été inversée est cloné ds un vecteur d’expression => transfecté ds ¢où l’ARN antisens sera exprimé à partir de cette construction. L’ARN antisens s’hybride à l’ARNm cible => traduction bloquée
Comment diminuer l’expression d’un gène :
OLIGO-antisens
Oligo(15-24 nu) dont la séq. Est complémentaire à l’ARNm cible est introduit ds la ¢et va s’hybrider à cet ARNm => empêche la traduction du gène par diff. Mécanismes
Comment diminuer l’expression d’un gène :
Ribozymes
ARN catalytique de 40-50 nu possédant une portion de liaison au substrat (reconnaissance de séq. Spécifique) et une portion catalytique (coupure arn cible)
Comment diminuer l’expression d’un gène
ARN interférence : siRNA
siRNA => ARN db de 20-25 nu => coupure par nucléase Dicer d’un ARNdb contenant la séq. Cible, s’associant à un complexe RISC et => reconnaissance + coupure de l’ARNm cible par le complexe.
-Mécanisme naturel qui p-e utilisé pr diminuer l’xpression de gènes spécifiques
Comment diminuer l’expression d’un gène
ARN interférence : shRNA
ARN codé par un plasmide ak 2 portions de séq. Compl. Formant une structure en épingle => réponse similaire au siRNA
Comment diminuer l’expression d’un gène
ARN interférence : miRNA (micro)
Court ARN (22 nu), structure semblable au shRNA => ds ¢eucaryotes impliqué ds régu. Post-transcrip
Comparaison de méthodes d’inhibition de gène
Knock-out animal ( + et - )
+ : Inhibition COMPLÈTE du gène
- : $, COMPLEXES, mutants létaux peuvent empêcher le dev. Embry
Comparaison de méthodes d’inhibition de gène :
Petites molécules inhibitrices
+ : introduction facile
- : spécificité variable, travail de dév intensif
Comparaison de méthodes d’inhibition de gène :
Anti-sens DNA
+ : SIMPLE , peu onéreux
- : efficacité et spécificité variable, besoin transfection
Comparaison de méthodes d’inhibition de gène :
RNA interference
+ : SPÉCIFIQUE, facile
- : knock down ( PAS KNOCK OUT) , besoin transfection
ARN antisens (caractéristiques 5)
- Inhiber la traduction d’ARNm spécifiques
- ARN généré instable
- Effets variables selon la cible et efficacité très variable : éteint le gène ds certains cas ou aucun effet
- effets n-spécifiques
- moins utilisé qu’avant
Principe de l’ARN antisens
- ADNc du gène cible est cloné ds un vecteur d’expression en orientation inverse
- Construction est transfectée ds ¢ où ARN antisens est synthétisé
- ARN AS s’hybride spécifiquement à l’ARNm cible et bloque traduction
- Intéraction stoechiométrique (1 :1)
OU
Antisens => inhibe ARNm=> pas d’Acti. De type catalytique
oligonucléotides antisens(3 caract)
- Oligonucléotide antisens d’ADN 15-20 nu => se lie à une cible complémentaire d’ARNm
- bloque la traduction de gènes spécifiques
- Organisation spatiale et repliement de longs ARNm => interdir accès de l’oligo sur certaines portions de l’ARNm (doit donc cibler des zones accessibles)
Mécanisme oligonucléotides (ADN)
- plupart des oligo antisens sont hybridés à leur cible => activent RNase H => clive la partie ARNm cible => effet CATALYTIQUE (reste ADN intact) (pas obligatoire d’activer RNase H)
- hybridation de l’oligo à l’ARNm cible bloque la traduction par encombrement stérique du ribozome => effet STOECHIOMÉTRIQUE
guide d’étude :
liaison à un ARNm cible => déstabilisation des pré-ARNm, blocage de la traduction (ARNm=> prots), Si oligo active RNase H => activité de type CATALYTIQUE possible, sinon act. stoechio
Modifications pr améliorer la stabilité des oligo.antisens (4)
- oligo.anti d’ADN n-modifiés => rapidement dégradés par nucléases ds la ¢
- Modifier chimiquement les nuc. Pr les stabiliser
- Phosphorothioate : + utilisé
- 2e génération (substitu carbone 2)
(comparaison des 2)
Modifications pr améliorer la stabilité des oligoantisens
Phosphorothioate vs 2e gén
Phospho :
- soufre remplace un O du Phosphate
- résistant aux nucléases que nucléotide phosphodiester
- appariements normaux ak bases appariées lors de son appariement avec ARNm
- active RNase H
- Liaison augmenté à certaines prots => possible toxicité (SNC)
2nd gen :
- moins toxiques
- ^ affinité pr cible
- active pas RNase H
Oligonucléotide antisens : Gapmers : fct
-active RNase H en évitant la dégradation => gapmers = oligonucl. Hybride incorporant 2 caract :
- séquence centrale d’ADN ou adn à phosphorothioate
- Nu. Modifiés aux 2 extr. Pr protéger la dégradation (MOE)
Dream team : phosphoro + MOE
Oligonucléotide antisens : Transfert ds ¢ (5 méthodes)
- endocytose médié par des rc (pas efficace + peu réponse)
- microinjection (peu de ¢traitées)
- Lipides cationiques ( + utilisée pr transfert ds ¢ en culture)
- électroporation
- Méthodes de transfert in vivo (vecteurs viraux)
Oligonucléotides antisens :
Fonction des contrôles ?
- s’assurer que l’effet est spécifique à l’inhibition par l’antisens.
- comportement p-e influencé par sa composition nucléotidique + props. Globales (ex. conformation)
Oligonucléotides antisens :
4 types de contrôle
- structure similaire : mais ayant un séquence nucléotidique différente
- Séquence mélangée : mm composition nucléotidique mais ds ordre différent => structure secondaires différentes : oligonucléotides sens
- Mésappariement ou + pr démontrer la spécificité de l’hybridation de l’oligonucl
- utilisation de lignés ¢ ayant le gène cible muté, délété que l’oligo ne peut cibler.
Oligonucléotides antisens - Confirmation de l’efficacité et utilisation ds la thérapie génique (2 démonstrations)
- Démonstration de la diminution de l’Expression de la prot
2. Démonstration de la diminution dépendante de la RNASE-H de l’ARNm spécifique par Northern Blot
Pk le comportement biologique ne p-e utilisé pr démontrer l’Efficacité ?
-p-e le résultat d’un effet n-spécifique par le squelette de l’oligo
Si l’oligo agit en bloquant l’ARNm de façon stérique, qu’est ce qui est inutile ?
Northern-blot => pas de dégradation de ARNm par RnaseH
=> démonstration de peptides tronqués
=> oligo cible région 5’ ou codon AUG -> western blot
Oligonucléotides antisens - Confirmation de l’efficacité et utilisation ds la thérapie génique :(3 remarques ds la thérapie génique))
- Nbr croissant d’utilisation d’oligos antisens ds des études cliniques
- Nbr limité de résultats +
- Résolution de prob : construction d’oligos efficace + ^ act. bio + meilleurs techniques de livraison de l’oligo à la cible
qu’est ce qu’un ribozyme (2 types)
molécules d’ARN à act. catalytique qui reconnait une cible ARN
-activité de clivage d’un acide nucléique.
2 types : marteau et type épingle à cheveux => intéressant pr leur act. catalytique de type nucléase
Caractéristiques ribozyme (4):
- 40-50 nucl
- 2 domaines : liaison + catalytique
- avantageux comparé aux thérapies prots => ribozyme entraine peu de rép. immunitaire
- peuvent être modifiés pr qu’il coupe ARN en trans => permet de cibler un substrat spécifique en ajoutant une séquence complémentaire à la cible
Ribozyme hammerhead : caractéristique ?
-activité en cis = coupe une fois sa propre chaine => pas d’Activité “catalytique” => pcq ne revient pas à sa forme de départ apres le clivage
oligonucl antisens vs ribozyme ?
-ribozyme : peut désactiver plusieurs ARNm cible successivement ds un cycle liaison -clivage -détachement
Effets : ribozymes
FITC
-ribozyme est couplé de manière covalente au FITC (fluo) => permet de visualiser son entrée ds les ¢cibles (pour voir où l’ARNm est exprimé)
ici couplé ak des ribozymes permettant de détecter des ARNm spécifiques
6 conclusions du mécanisme de l’ARN interférence
=> arn antisens et sens peuvent entrainer une diminution de l’expression d’un gène.
- répression génique n’était observé que pr l’injection d’ARNdb => mais peu ou très peu pr l’ARN sens ou antisens
- Répression était spécifique à l’ARNm homologue au ARNdb. Les autres ARNm n’étaient pas affectés
- ARNdb devrait correspondre à l’ARNm mature . Les séquences introniques ou promotrices n’entrainaient pas la réponse=> mécanisme post-transcriptionnel
- ARNm disparait apres injection (suggérant qu’il est déhradé)
- Qqs ARNdb étaient nécessaires pr une répression complète => adndb amplifié de façon catalytique et non stoechiométrique
- L’effet de l’ARNdb pouvait se transférer entre les tissus => transmission entre les ¢.
diagramme: ARN codant (1)
ARNm
Diagramme :
Arn n-codant => Arn de transcription
ARNr
ARNt
Diagramme :
ARN n-codant => petit ARN( 4)
- ARNsi
- miRNA
- snRNA
- snoRNA
3 types principaux d’ARN interférents (arn normal)
- microRNA : 1ere maturation ds noyau via drosha/pasha => réguler l’expression des prots
- petits arn interférents (21 nuc) => double arn qui va exporter à l’ext. du noyau => processé par des enzymes => joindre au risc => couper (catalytique)
- Piwi-interacting RNAs => embryonnaire => boucle d’amplification
Mécanisme d’ARN interférence (5 steps)
- Intro du ARNdb ds ¢
- Complexe DICER (act. nucléase) et se lie à ARNdb et coupe en un siRNA contenant 21 pb
- brin antisens (brin guide : permet de sélectionner arnm et couper) est intégré au complexe RISC => fct catalytique
- Complexe RISC reconnait ARNm compl. spécifique à sa séq et le coupe. ARN coupé ne peut être traduit et est ensuite dégradé
- Complexe RISC peut se lier à d’autres ARNm compl => ACTIVITÉ CATALYTIQUE
ARN Interférence : DICER est une quoi ? (structure)
protéine multi-domaines qui comprend 2 domaines Rnase 3, un domaine PAS, domaine de diaison à ARNdb (dsRBD) , un domaine de fct pas connu et domaine hélicase
ARN interférence : DICER fct ??
Clivage des molécules ARNdb longues d’origine endogène ou exogène pour former des siRNA
produisent des longueurs de 20-25 pb
Caractéristiques de liaison du domaine PAZ
et domaine dsRBD
PAZ : lie extrémité ak extension 2-nt 3’ de l’ARNdb. (dstance entre site de liaison est de 25 pb de l’ARN db)
dsRBD : lie l’autre portion de l’ARNdb
ARN interférence : ARgonaute sont quoi ?
- Composants catalytiques du complexes RICS => origine du silencing/interférence par ARN
Constitution du argonaute(4 domaines )
N-terminal, paz, mid, piwi
Argonaute : domaine piwi contient ?
contient une structure apparenté au Rnase Hfold, => responsable de l’Activité de clivage de l’argonaute
Argonaute : domaine paz fct ?
lie l’ARNsb guide à l’argonaute
Rôle des complexes RISC et DICER
- Destruction de l’ARN viral envahissant
- Élimination de transcrits d’éléments mobiles (transposons) et adn répété
- Inhibition de la trasncription médié par l’ARNi via condensation de la chromatine
- Inhibition de la synthèse de protéine médié par les petits ARN (miARN)
- Mécanismes utilisés lorsque des siARN exogènes sont introduits pr inhiber l’act. de gènes spécifiques
3 méthodes d’INHIBITION GÉNIQUE basé sur les siARN dans des ¢eucaryotes
- Molcéules synthétiques ARNi => avec standard siRNA et StealthRNAi
- ARNi basée sur des vecteurs de bases => avec shRNA expression + miRNA expression. Possibilité de créer des lignées ¢ ayant un effet ARNi permanent
- Synthèse in vitro => processus avec transcription et dicer => transfection ds ¢. TEMPORAIRE / PAS LIGNÉES PERMANENTES
sh rna => activité catalytique comme siRNA
Expression stable ou transitoire ds les ¢ : 2 façons principales pr exercer un effet ARNi
Transitoire :
siARN => liposomes => transfection =>ARNi (RISC)
+stable (lignée cellulaire stable : shARN=> clonage ds plasmide => transfection => tige boucle (shRNA) => dicer => ARNi
Amplification possible ds certaines espèces ?
oui, Première coupure => permet la production de d’autres siRNA(amplification)
Caractéristiques microARN(miRNA)
- moins spécifiques que siARN et se lient des motifs répandus ds le 3’-UTR. => régulent 50% de nos gènes
- nécessite DICER et RISC
- si partiellement complémentaire : répression de la traduction (stoechiométrique)
- si complémentarité total : dégradation du transcrit (catalytique)
Fct miRNA
effet : inhiber la traduction (par la liaison du complexe RISC sur région 3’-UTR)
- bloque le cycle ¢laire
- certains miR induits par glucose et exercice => rôle ds métabolisme
- certains sont induits par UV et participent à la réparation d’ADN
- régulent angiogenèse
-induits ou réprimés ds
nbreux cancers, maladies dégénératives et cardiovasc
Région commune qui détermine la spécificité de reconnaissance de certains 3’-UTR ?
AGCAGC
limitations et intéret des siRNA (6)
- peuvent stimuler rép. immunitaire innée (interférons)
- choix du brins antisens du siARN => effets OFF TARGET = d’autres gènes pourraient être ciblés de manière n-spécifique
- bcp de controvese sur spécificité des siRNA
- conception pr utilisation in vivo est laborieuse
- peuvent avoir des efffets sur la traduction comme les miRNA
- limitation principale : utilisation comme agent txique . Transport et livraison efficace et spécifique (instable, mauvais F, stimule syst. immun)
avantages siRNA (4)
- knock down (sliencing) à 90%
- possibilité d’être produits par plasmides (shRNA) => stable
- libération facile par liposomes ou vecteurs viraux
- utiles pr création de librairies et dépistage du rôle des prots
Exemple de répression génique par siRNA
- ¢ controles vs ¢ qui serviront de créer un modèle de déficience
- Transfection avec un siRNA ou autre approche de knockdown :
a) pour le controle : sans siRNA ou siRNAcontrpole
b) ¢ tests : lipofection ak siRNA dirigé contre prot X
3) 70-90% knockdown pr ¢ tests
Analyse de l’Exemple de répression génique par siRNA (RTPCR et Western-Blot) : observation de 2 choses si ARN subit un knockdown
- diminution de l’ARNm ciblé par siRNA
- diminution de la prot. traduite
RTPCR : diminution de l’ARN prot. X
WesternBlot : diminution de la prot
si eg : diminution arnm , mais pas de la prot= >présence d’autre mécanisme en jeu
5 types de transport et transfert des siRNA
- liposomes
- nanoparticules polymère
- Nanoparticules à <3 métalique
- dendrimères
- micelles polymère
Transport et transfert des siRNA:
Liposomes
vésicules composés d’une bicouche lipidique qui renferme un compartiment aqueux => facilitent internalisation du siRNA (par fusion)
Transport et transfert des siRNA:
nanoparticules polymère
- constituées de polymère
- stable, relachement controlé, grande capacité , permet cotransport
- peuvent être upgradé pr ^ stabilité, transport, spécificité du ciblage ou transfert
Transport et transfert des siRNA:
nanoparticules à <3 métalique
<3 recouvert d’un sucre ou autre polymère à l’Ext duquel le siRNA p-e conjugué.
=> permet la détection pr des études de distribution ou modifier leur distribution mais sont limité par leur toxicité
Transport et transfert des siRNA:
dendrimères
-mol. polymères à plusieurs branchements => arn est lié grâce à la charge + du coeur ou covalente
Transport et transfert des siRNA:
Micelles polymère
Partage des caractéristiques des liposomes et nanopart.
=>propriétés adaptées à l’environnement ¢laire des liposomes ak une mbr hydrophile + <3 hydrophobe
CRISPR/CAS9 : Silencing et édition ciblé du génome
consiste à quoi ? (4 caractéristiques)
- new outil basé sur une nucléase protéique-9 bactrienne associées à CRISPR (cas9)
- Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats
- CRISPR et gènes CAS sont essentiels pr immunité adaptative de certaines bactéries => permet rép. rapide et élimination du matériel génétique étranger
- 3 types de mécanismes CRISPR identifiés (2e est le + studied)
3 types de mécanismes CRISPR identifiés, quel type de mécanisme CRIPSR est utilisé pr l’édition ciblé du génome ? pk ?
2
- impliquent des prots associées à CRISPR différentes
- type 2 : complexe le + simple = > + facile à transposer ds un autre syst.
Mécanisme CRISPR/CAS9 (5 pts)
- Cas genes : en amont et près du locus CRIPSR
- CRISPR locus : alternance de séquences répétées et spacers
- Phase d’acquisition : ADN étranger est incorporé ds génome bactérien aux locus CRISPR
- Expression / biogenèse du crRNA : LEs locus CRISPR transcrits en pre-crRNA par CAS6 ou RNASE 3 et assemblage du complexe cas + crRNA = complexe crRNP
- Interférence : endonucléase cas9 complexée ak un crRNA et un tracrRNA séparé clive l’ADN étranger contenant une séquence complémentaire au crRNA de 20 nucl. adjacente à la séq PAM
CRISPR 2 : Mécanisme
- acquisition : fragment adjacent à une courte séquence PAM de l’ADN étranger est incorporé ds génome bactérien aux locus CRISPR
- biogenèse du crRNA : locus CRISPR transcrits et transformés en crRNA par CAS9 et RNase3
- Interférence : endonucléase cas9 complexée avec un crRNA et un tracrRNA séparé => clive 2 brins de l’ADN étranger contenant une séq. complémentaire au crRNA de 20 nucl. adjacente à la séq. PAM
act. endonucléase db cas9 nécessite ?
présence d’un site conservé de 2-5 nts PAM suivant immédiatement l’Ext. 3’ de la séq. complémentaire crRNA
3 composantes nécessaires pr crispr 2
cas9
trRNA
crRNA
Adaptation du CRISPR type 2 pr l’édition génomique
comment fonctionne l’édition génomique avec CAS9 ?
Changement de structure pr que ça soit + ez (crisprRNA)
=> capable de cibler ds une ¢ une dégradation spécifique
=> simplifié à 2 composantes en combinant trRNA et crRNA en un seul ARN guide synthétique, le gRNA. tout aussi efficace que trRNA+ crRNA
=> coupure db franche de la cible du guide gRNA par cas9 ayant 2 domaines nucléases (ruvclike + hnh-like)
Activation de mécanismes de réparation db: (2)
Ajout adn donneur obligatoire ?
Conséquence de ne pas inclure ADN donneur ?
Mécanisme de réparation est sollicité en présence ou absence d’ADN donneur ?
- non
- NHEJ : insertion et/ou délétion, perturbe le locus cible
Si un adn donneur est fourni : réparation basé sur homologie (HDR) => remplacement précise de la zone coupée par une séq. modifiée
Adaptation du cripsr type 2 pr édition génomique :
Dév. d’une variante Cas9 (Cas9D10A)
Comment fonctionne ce système ?
Qu’est ce qui le distingue du syst. de la diapo 43 ?
avantage de ce système ?
Quel mécanisme permet cet avantage ?
- cas9d10a : un seul domaine nucléase coupant un seul brin => association d’une 2e cas9d10a ayant une cible l’autre brin => BRISURE DOUBLE BRIN NON FRANCHE
- coupure n-franche => pas d’activation de NHEJ
- diminution coupures hors-cible
- présence d’un adn donneur=> activation de HDR (homology directed repair) slm => moins de mutations de type insertion/délétion
Adaptation du cripsr type 2 pr édition génomique :
dcas9
quel est le principe ?
3 illustrations ?
- mutation des 2 sites nucléasiques => plus de coupure de la cible
- permet une reconnaissance et un positionnement séq. spécifique d’une cible
- modulation de transcription par association des activateurs (1ère illust) ./répresseurs(2e illust)
- visualisation (3e illust) par association à des molé fluo
CRISPR/cas9 : efficacité du ciblage et mutations hors-cible :
mutations hors-cible
- Comprendre la problématique et importance des mutations hors-cible
- Amélioration du syst. Crispr/cas9 pr ^ fidélité ?
1.
-crispr/cas9 peut tolérer jusqu’à 5bases de mésappariement ds sa séq. de reconnaissance et d’un nucléotide de sa séquence PAM
- nécessite un séquencage du génome entier pr déceler les mutations hors-cibles
- grand nbr de mutations de nucléotides uniques
2.
Modifications au syst. peuvent ^ fidélié :
a) gRNA tronqué, ajout de G en 5’.
b) utilisation double cas9D10a
c)détection de meilleures séq. cibles qui minimisent les mod. hors-cibles
bref : prob: pleins de mutations uniques; grosses qt de mutations après le séquençage de l’ADN => prévenir le moins possible d’altérations off-target
CRISPR/cas9 : efficacité du ciblage et mutations hors-cible :
perspectives
- ¢ humaines , bactéries.etc.
- simple : redesign de crRNA slm pr changer la spécificité à la cible
- ^ efficacité et versatilité
Crispr/cas9 :
adaptation du crispr type 2 pr édition génomique:
éléments nécessaires pr crispr/cas9 dans le vecteur
-cas9, gRNA
CRISPR/cas9 : efficacité du ciblage et mutations hors-cible :
mutations hors-cible
différences d’efficacité ?
CRISPR /CAS9 se compare avantageusement aux autres méthodes
talens et ZFN 1-50% efficacité ds ¢humaines
crispr/cas9 : >70% ds zebrafish + plantes et 78 % ds ¢ embryo souris
