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sbp2026 END ME FFS > ARN interférence > Flashcards

ARN interférence Flashcards

1
Q

Comment on peut étudier la fct d’un gène ?

A

-^ ou diminuant son expression (^ qd expression d’un gène est peu ou pas exprimé/ actif et vice versa)

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2
Q

2 types d’études de surexpression/sous-expression peuvent être faites de 2 façons

A

Transitoire (tx de ¢ en culture ak oligo anti-sens)

Permanente (souris trans-géniques)

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3
Q

La surexpression d’un gène peut permettre quoi ? (2 caract)

A
  • fct du gène (variation du phénotye informe sur le rôle + modif d’intéractions entre prots)
  • ^ peut entraîner un débalancement => donner des phénotypes qui ne sont pas nécessairement représentatif de la fct de la prot.
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4
Q 
La diminution (knock-down) peu permettre quoi ?
(3 caract)
A
  • informer sur la fct du gène ( perte de fct observable, modif du comportement ¢laire)
  • Perte d’Expression du gène => pas nécessairement une modif.observable
  • Corriger une surexpression pathologique
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5
Q

Comment diminuer l’expression d’un gène :

ARN antisens

A

1- ARN antisens : ADNc dont l’orientation a été inversée est cloné ds un vecteur d’expression => transfecté ds ¢où l’ARN antisens sera exprimé à partir de cette construction. L’ARN antisens s’hybride à l’ARNm cible => traduction bloquée

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6
Q

Comment diminuer l’expression d’un gène :

OLIGO-antisens

A

Oligo(15-24 nu) dont la séq. Est complémentaire à l’ARNm cible est introduit ds la ¢et va s’hybrider à cet ARNm => empêche la traduction du gène par diff. Mécanismes

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7
Q

Comment diminuer l’expression d’un gène :

Ribozymes

A

ARN catalytique de 40-50 nu possédant une portion de liaison au substrat (reconnaissance de séq. Spécifique) et une portion catalytique (coupure arn cible)

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8
Q

Comment diminuer l’expression d’un gène

ARN interférence : siRNA

A

siRNA => ARN db de 20-25 nu => coupure par nucléase Dicer d’un ARNdb contenant la séq. Cible, s’associant à un complexe RISC et => reconnaissance + coupure de l’ARNm cible par le complexe.

-Mécanisme naturel qui p-e utilisé pr diminuer l’xpression de gènes spécifiques

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9
Q

Comment diminuer l’expression d’un gène

ARN interférence : shRNA

A

ARN codé par un plasmide ak 2 portions de séq. Compl. Formant une structure en épingle => réponse similaire au siRNA

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10
Q

Comment diminuer l’expression d’un gène

ARN interférence : miRNA (micro)

A

Court ARN (22 nu), structure semblable au shRNA => ds ¢eucaryotes impliqué ds régu. Post-transcrip

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11
Q

Comparaison de méthodes d’inhibition de gène

Knock-out animal ( + et - )

A

+ : Inhibition COMPLÈTE du gène

  • : $, COMPLEXES, mutants létaux peuvent empêcher le dev. Embry
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12
Q

Comparaison de méthodes d’inhibition de gène :

Petites molécules inhibitrices

A

+ : introduction facile

- : spécificité variable, travail de dév intensif

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13
Q

Comparaison de méthodes d’inhibition de gène :

Anti-sens DNA

A

+ : SIMPLE , peu onéreux

- : efficacité et spécificité variable, besoin transfection

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14
Q

Comparaison de méthodes d’inhibition de gène :

RNA interference

A

+ : SPÉCIFIQUE, facile

- : knock down ( PAS KNOCK OUT) , besoin transfection

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15
Q

ARN antisens (caractéristiques 5)

A
  • Inhiber la traduction d’ARNm spécifiques
  • ARN généré instable
  • Effets variables selon la cible et efficacité très variable : éteint le gène ds certains cas ou aucun effet
  • effets n-spécifiques
  • moins utilisé qu’avant
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16
Q

Principe de l’ARN antisens

A
  • ADNc du gène cible est cloné ds un vecteur d’expression en orientation inverse
  • Construction est transfectée ds ¢ où ARN antisens est synthétisé
  • ARN AS s’hybride spécifiquement à l’ARNm cible et bloque traduction
  • Intéraction stoechiométrique (1 :1)

OU
Antisens => inhibe ARNm=> pas d’Acti. De type catalytique

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17
Q

oligonucléotides antisens(3 caract)

A
  • Oligonucléotide antisens d’ADN 15-20 nu => se lie à une cible complémentaire d’ARNm
  • bloque la traduction de gènes spécifiques
  • Organisation spatiale et repliement de longs ARNm => interdir accès de l’oligo sur certaines portions de l’ARNm (doit donc cibler des zones accessibles)
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18
Q

Mécanisme oligonucléotides (ADN)

A
  • plupart des oligo antisens sont hybridés à leur cible => activent RNase H => clive la partie ARNm cible => effet CATALYTIQUE (reste ADN intact) (pas obligatoire d’activer RNase H)
  • hybridation de l’oligo à l’ARNm cible bloque la traduction par encombrement stérique du ribozome => effet STOECHIOMÉTRIQUE

guide d’étude :
liaison à un ARNm cible => déstabilisation des pré-ARNm, blocage de la traduction (ARNm=> prots), Si oligo active RNase H => activité de type CATALYTIQUE possible, sinon act. stoechio

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19
Q

Modifications pr améliorer la stabilité des oligo.antisens (4)

A
  • oligo.anti d’ADN n-modifiés => rapidement dégradés par nucléases ds la ¢
  • Modifier chimiquement les nuc. Pr les stabiliser
  • Phosphorothioate : + utilisé
  • 2e génération (substitu carbone 2)

(comparaison des 2)

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20
Q

Modifications pr améliorer la stabilité des oligoantisens

Phosphorothioate vs 2e gén

A

Phospho :

  • soufre remplace un O du Phosphate
    • résistant aux nucléases que nucléotide phosphodiester
  • appariements normaux ak bases appariées lors de son appariement avec ARNm
  • active RNase H
  • Liaison augmenté à certaines prots => possible toxicité (SNC)

2nd gen :

  • moins toxiques
  • ^ affinité pr cible
  • active pas RNase H
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21
Q

Oligonucléotide antisens : Gapmers : fct

A

-active RNase H en évitant la dégradation => gapmers = oligonucl. Hybride incorporant 2 caract :

  • séquence centrale d’ADN ou adn à phosphorothioate
  • Nu. Modifiés aux 2 extr. Pr protéger la dégradation (MOE)

Dream team : phosphoro + MOE

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22
Q

Oligonucléotide antisens : Transfert ds ¢ (5 méthodes)

A
  • endocytose médié par des rc (pas efficace + peu réponse)
  • microinjection (peu de ¢traitées)
  • Lipides cationiques ( + utilisée pr transfert ds ¢ en culture)
  • électroporation
  • Méthodes de transfert in vivo (vecteurs viraux)
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23
Q

Oligonucléotides antisens :

Fonction des contrôles ?

A
  • s’assurer que l’effet est spécifique à l’inhibition par l’antisens.
  • comportement p-e influencé par sa composition nucléotidique + props. Globales (ex. conformation)
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24
Q

Oligonucléotides antisens :

4 types de contrôle

A
  • structure similaire : mais ayant un séquence nucléotidique différente
  • Séquence mélangée : mm composition nucléotidique mais ds ordre différent => structure secondaires différentes : oligonucléotides sens
  • Mésappariement ou + pr démontrer la spécificité de l’hybridation de l’oligonucl
  • utilisation de lignés ¢ ayant le gène cible muté, délété que l’oligo ne peut cibler.
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25
Q

Oligonucléotides antisens - Confirmation de l’efficacité et utilisation ds la thérapie génique (2 démonstrations)

A
  1. Démonstration de la diminution de l’Expression de la prot

2. Démonstration de la diminution dépendante de la RNASE-H de l’ARNm spécifique par Northern Blot

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26
Q

Pk le comportement biologique ne p-e utilisé pr démontrer l’Efficacité ?

A

-p-e le résultat d’un effet n-spécifique par le squelette de l’oligo

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27
Q

Si l’oligo agit en bloquant l’ARNm de façon stérique, qu’est ce qui est inutile ?

A

Northern-blot => pas de dégradation de ARNm par RnaseH
=> démonstration de peptides tronqués
=> oligo cible région 5’ ou codon AUG -> western blot

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28
Q

Oligonucléotides antisens - Confirmation de l’efficacité et utilisation ds la thérapie génique :(3 remarques ds la thérapie génique))

A
  • Nbr croissant d’utilisation d’oligos antisens ds des études cliniques
  • Nbr limité de résultats +
  • Résolution de prob : construction d’oligos efficace + ^ act. bio + meilleurs techniques de livraison de l’oligo à la cible
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29
Q

qu’est ce qu’un ribozyme (2 types)

A

molécules d’ARN à act. catalytique qui reconnait une cible ARN
-activité de clivage d’un acide nucléique.

2 types : marteau et type épingle à cheveux => intéressant pr leur act. catalytique de type nucléase

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30
Q

Caractéristiques ribozyme (4):

A
  • 40-50 nucl
  • 2 domaines : liaison + catalytique
  • avantageux comparé aux thérapies prots => ribozyme entraine peu de rép. immunitaire
  • peuvent être modifiés pr qu’il coupe ARN en trans => permet de cibler un substrat spécifique en ajoutant une séquence complémentaire à la cible
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31
Q

Ribozyme hammerhead : caractéristique ?

A

-activité en cis = coupe une fois sa propre chaine => pas d’Activité “catalytique” => pcq ne revient pas à sa forme de départ apres le clivage

32
Q

oligonucl antisens vs ribozyme ?

A

-ribozyme : peut désactiver plusieurs ARNm cible successivement ds un cycle liaison -clivage -détachement

33
Q

Effets : ribozymes

FITC

A

-ribozyme est couplé de manière covalente au FITC (fluo) => permet de visualiser son entrée ds les ¢cibles (pour voir où l’ARNm est exprimé)

ici couplé ak des ribozymes permettant de détecter des ARNm spécifiques

34
Q

6 conclusions du mécanisme de l’ARN interférence

=> arn antisens et sens peuvent entrainer une diminution de l’expression d’un gène.

A
  1. répression génique n’était observé que pr l’injection d’ARNdb => mais peu ou très peu pr l’ARN sens ou antisens
  2. Répression était spécifique à l’ARNm homologue au ARNdb. Les autres ARNm n’étaient pas affectés
  3. ARNdb devrait correspondre à l’ARNm mature . Les séquences introniques ou promotrices n’entrainaient pas la réponse=> mécanisme post-transcriptionnel
  4. ARNm disparait apres injection (suggérant qu’il est déhradé)
  5. Qqs ARNdb étaient nécessaires pr une répression complète => adndb amplifié de façon catalytique et non stoechiométrique
  6. L’effet de l’ARNdb pouvait se transférer entre les tissus => transmission entre les ¢.
35
Q 
diagramme:
ARN codant (1)
A

ARNm

36
Q

Diagramme :

Arn n-codant => Arn de transcription

A

ARNr

ARNt

37
Q

Diagramme :

ARN n-codant => petit ARN( 4)

A
  • ARNsi
  • miRNA
  • snRNA
  • snoRNA
38
Q

3 types principaux d’ARN interférents (arn normal)

A
  1. microRNA : 1ere maturation ds noyau via drosha/pasha => réguler l’expression des prots
  2. petits arn interférents (21 nuc) => double arn qui va exporter à l’ext. du noyau => processé par des enzymes => joindre au risc => couper (catalytique)
  3. Piwi-interacting RNAs => embryonnaire => boucle d’amplification
39
Q

Mécanisme d’ARN interférence (5 steps)

A
  1. Intro du ARNdb ds ¢
  2. Complexe DICER (act. nucléase) et se lie à ARNdb et coupe en un siRNA contenant 21 pb
  3. brin antisens (brin guide : permet de sélectionner arnm et couper) est intégré au complexe RISC => fct catalytique
  4. Complexe RISC reconnait ARNm compl. spécifique à sa séq et le coupe. ARN coupé ne peut être traduit et est ensuite dégradé
  5. Complexe RISC peut se lier à d’autres ARNm compl => ACTIVITÉ CATALYTIQUE
40
Q

ARN Interférence : DICER est une quoi ? (structure)

A

protéine multi-domaines qui comprend 2 domaines Rnase 3, un domaine PAS, domaine de diaison à ARNdb (dsRBD) , un domaine de fct pas connu et domaine hélicase

41
Q

ARN interférence : DICER fct ??

A

Clivage des molécules ARNdb longues d’origine endogène ou exogène pour former des siRNA

produisent des longueurs de 20-25 pb

42
Q

Caractéristiques de liaison du domaine PAZ

et domaine dsRBD

A

PAZ : lie extrémité ak extension 2-nt 3’ de l’ARNdb. (dstance entre site de liaison est de 25 pb de l’ARN db)

dsRBD : lie l’autre portion de l’ARNdb

43
Q

ARN interférence : ARgonaute sont quoi ?

A
  • Composants catalytiques du complexes RICS => origine du silencing/interférence par ARN
44
Q

Constitution du argonaute(4 domaines )

A

N-terminal, paz, mid, piwi

45
Q

Argonaute : domaine piwi contient ?

A

contient une structure apparenté au Rnase Hfold, => responsable de l’Activité de clivage de l’argonaute

46
Q

Argonaute : domaine paz fct ?

A

lie l’ARNsb guide à l’argonaute

47
Q

Rôle des complexes RISC et DICER

A
  1. Destruction de l’ARN viral envahissant
  2. Élimination de transcrits d’éléments mobiles (transposons) et adn répété
  3. Inhibition de la trasncription médié par l’ARNi via condensation de la chromatine
  4. Inhibition de la synthèse de protéine médié par les petits ARN (miARN)
  5. Mécanismes utilisés lorsque des siARN exogènes sont introduits pr inhiber l’act. de gènes spécifiques
48
Q

3 méthodes d’INHIBITION GÉNIQUE basé sur les siARN dans des ¢eucaryotes

A
  1. Molcéules synthétiques ARNi => avec standard siRNA et StealthRNAi
  2. ARNi basée sur des vecteurs de bases => avec shRNA expression + miRNA expression. Possibilité de créer des lignées ¢ ayant un effet ARNi permanent
  3. Synthèse in vitro => processus avec transcription et dicer => transfection ds ¢. TEMPORAIRE / PAS LIGNÉES PERMANENTES

sh rna => activité catalytique comme siRNA

49
Q

Expression stable ou transitoire ds les ¢ : 2 façons principales pr exercer un effet ARNi

A

Transitoire :
siARN => liposomes => transfection =>ARNi (RISC)

+stable (lignée cellulaire stable : shARN=> clonage ds plasmide => transfection => tige boucle (shRNA) => dicer => ARNi

50
Q

Amplification possible ds certaines espèces ?

A

oui, Première coupure => permet la production de d’autres siRNA(amplification)

51
Q

Caractéristiques microARN(miRNA)

A
  • moins spécifiques que siARN et se lient des motifs répandus ds le 3’-UTR. => régulent 50% de nos gènes
  • nécessite DICER et RISC
  • si partiellement complémentaire : répression de la traduction (stoechiométrique)
  • si complémentarité total : dégradation du transcrit (catalytique)
52
Q

Fct miRNA

A

effet : inhiber la traduction (par la liaison du complexe RISC sur région 3’-UTR)

  • bloque le cycle ¢laire
  • certains miR induits par glucose et exercice => rôle ds métabolisme
  • certains sont induits par UV et participent à la réparation d’ADN
  • régulent angiogenèse

-induits ou réprimés ds
nbreux cancers, maladies dégénératives et cardiovasc

53
Q

Région commune qui détermine la spécificité de reconnaissance de certains 3’-UTR ?

A

AGCAGC

54
Q

limitations et intéret des siRNA (6)

A
  • peuvent stimuler rép. immunitaire innée (interférons)
  • choix du brins antisens du siARN => effets OFF TARGET = d’autres gènes pourraient être ciblés de manière n-spécifique
  • bcp de controvese sur spécificité des siRNA
  • conception pr utilisation in vivo est laborieuse
  • peuvent avoir des efffets sur la traduction comme les miRNA
  • limitation principale : utilisation comme agent txique . Transport et livraison efficace et spécifique (instable, mauvais F, stimule syst. immun)
55
Q

avantages siRNA (4)

A
  1. knock down (sliencing) à 90%
  2. possibilité d’être produits par plasmides (shRNA) => stable
  3. libération facile par liposomes ou vecteurs viraux
  4. utiles pr création de librairies et dépistage du rôle des prots
56
Q

Exemple de répression génique par siRNA

A
  1. ¢ controles vs ¢ qui serviront de créer un modèle de déficience
  2. Transfection avec un siRNA ou autre approche de knockdown :

a) pour le controle : sans siRNA ou siRNAcontrpole
b) ¢ tests : lipofection ak siRNA dirigé contre prot X

3) 70-90% knockdown pr ¢ tests

57
Q

Analyse de l’Exemple de répression génique par siRNA (RTPCR et Western-Blot) : observation de 2 choses si ARN subit un knockdown

A
  1. diminution de l’ARNm ciblé par siRNA
  2. diminution de la prot. traduite

RTPCR : diminution de l’ARN prot. X

WesternBlot : diminution de la prot

si eg : diminution arnm , mais pas de la prot= >présence d’autre mécanisme en jeu

58
Q

5 types de transport et transfert des siRNA

A
  • liposomes
  • nanoparticules polymère
  • Nanoparticules à <3 métalique
  • dendrimères
  • micelles polymère
59
Q

Transport et transfert des siRNA:

Liposomes

A

vésicules composés d’une bicouche lipidique qui renferme un compartiment aqueux => facilitent internalisation du siRNA (par fusion)

60
Q

Transport et transfert des siRNA:

nanoparticules polymère

A
  • constituées de polymère
  • stable, relachement controlé, grande capacité , permet cotransport
  • peuvent être upgradé pr ^ stabilité, transport, spécificité du ciblage ou transfert
61
Q

Transport et transfert des siRNA:

nanoparticules à <3 métalique

A

<3 recouvert d’un sucre ou autre polymère à l’Ext duquel le siRNA p-e conjugué.
=> permet la détection pr des études de distribution ou modifier leur distribution mais sont limité par leur toxicité

62
Q

Transport et transfert des siRNA:

dendrimères

A

-mol. polymères à plusieurs branchements => arn est lié grâce à la charge + du coeur ou covalente

63
Q

Transport et transfert des siRNA:

Micelles polymère

A

Partage des caractéristiques des liposomes et nanopart.

=>propriétés adaptées à l’environnement ¢laire des liposomes ak une mbr hydrophile + <3 hydrophobe

64
Q

CRISPR/CAS9 : Silencing et édition ciblé du génome

consiste à quoi ? (4 caractéristiques)

A
  1. new outil basé sur une nucléase protéique-9 bactrienne associées à CRISPR (cas9)
  2. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats
  3. CRISPR et gènes CAS sont essentiels pr immunité adaptative de certaines bactéries => permet rép. rapide et élimination du matériel génétique étranger
  4. 3 types de mécanismes CRISPR identifiés (2e est le + studied)
65
Q

3 types de mécanismes CRISPR identifiés, quel type de mécanisme CRIPSR est utilisé pr l’édition ciblé du génome ? pk ?

A

2

  • impliquent des prots associées à CRISPR différentes
  • type 2 : complexe le + simple = > + facile à transposer ds un autre syst.
66
Q

Mécanisme CRISPR/CAS9 (5 pts)

A
  • Cas genes : en amont et près du locus CRIPSR
  • CRISPR locus : alternance de séquences répétées et spacers
  • Phase d’acquisition : ADN étranger est incorporé ds génome bactérien aux locus CRISPR
  • Expression / biogenèse du crRNA : LEs locus CRISPR transcrits en pre-crRNA par CAS6 ou RNASE 3 et assemblage du complexe cas + crRNA = complexe crRNP
  • Interférence : endonucléase cas9 complexée ak un crRNA et un tracrRNA séparé clive l’ADN étranger contenant une séquence complémentaire au crRNA de 20 nucl. adjacente à la séq PAM
67
Q

CRISPR 2 : Mécanisme

A
  1. acquisition : fragment adjacent à une courte séquence PAM de l’ADN étranger est incorporé ds génome bactérien aux locus CRISPR
  2. biogenèse du crRNA : locus CRISPR transcrits et transformés en crRNA par CAS9 et RNase3
  3. Interférence : endonucléase cas9 complexée avec un crRNA et un tracrRNA séparé => clive 2 brins de l’ADN étranger contenant une séq. complémentaire au crRNA de 20 nucl. adjacente à la séq. PAM
68
Q

act. endonucléase db cas9 nécessite ?

A

présence d’un site conservé de 2-5 nts PAM suivant immédiatement l’Ext. 3’ de la séq. complémentaire crRNA

69
Q

3 composantes nécessaires pr crispr 2

A

cas9
trRNA
crRNA

70
Q

Adaptation du CRISPR type 2 pr l’édition génomique

comment fonctionne l’édition génomique avec CAS9 ?

A

Changement de structure pr que ça soit + ez (crisprRNA)
=> capable de cibler ds une ¢ une dégradation spécifique

=> simplifié à 2 composantes en combinant trRNA et crRNA en un seul ARN guide synthétique, le gRNA. tout aussi efficace que trRNA+ crRNA

=> coupure db franche de la cible du guide gRNA par cas9 ayant 2 domaines nucléases (ruvclike + hnh-like)

71
Q

Activation de mécanismes de réparation db: (2)

Ajout adn donneur obligatoire ?

Conséquence de ne pas inclure ADN donneur ?

Mécanisme de réparation est sollicité en présence ou absence d’ADN donneur ?

A
  • non
  • NHEJ : insertion et/ou délétion, perturbe le locus cible

Si un adn donneur est fourni : réparation basé sur homologie (HDR) => remplacement précise de la zone coupée par une séq. modifiée

72
Q

Adaptation du cripsr type 2 pr édition génomique :

Dév. d’une variante Cas9 (Cas9D10A)

Comment fonctionne ce système ?

Qu’est ce qui le distingue du syst. de la diapo 43 ?

avantage de ce système ?

Quel mécanisme permet cet avantage ?

A
  • cas9d10a : un seul domaine nucléase coupant un seul brin => association d’une 2e cas9d10a ayant une cible l’autre brin => BRISURE DOUBLE BRIN NON FRANCHE
  • coupure n-franche => pas d’activation de NHEJ
  • diminution coupures hors-cible
  • présence d’un adn donneur=> activation de HDR (homology directed repair) slm => moins de mutations de type insertion/délétion
73
Q

Adaptation du cripsr type 2 pr édition génomique :

dcas9
quel est le principe ?

3 illustrations ?

A
  • mutation des 2 sites nucléasiques => plus de coupure de la cible
  • permet une reconnaissance et un positionnement séq. spécifique d’une cible
  • modulation de transcription par association des activateurs (1ère illust) ./répresseurs(2e illust)
  • visualisation (3e illust) par association à des molé fluo
74
Q

CRISPR/cas9 : efficacité du ciblage et mutations hors-cible :
mutations hors-cible

  1. Comprendre la problématique et importance des mutations hors-cible
  2. Amélioration du syst. Crispr/cas9 pr ^ fidélité ?
A

1.
-crispr/cas9 peut tolérer jusqu’à 5bases de mésappariement ds sa séq. de reconnaissance et d’un nucléotide de sa séquence PAM

  • nécessite un séquencage du génome entier pr déceler les mutations hors-cibles
  • grand nbr de mutations de nucléotides uniques

2.
Modifications au syst. peuvent ^ fidélié :
a) gRNA tronqué, ajout de G en 5’.
b) utilisation double cas9D10a
c)détection de meilleures séq. cibles qui minimisent les mod. hors-cibles

bref : prob: pleins de mutations uniques; grosses qt de mutations après le séquençage de l’ADN => prévenir le moins possible d’altérations off-target

75
Q

CRISPR/cas9 : efficacité du ciblage et mutations hors-cible :

perspectives

A
  • ¢ humaines , bactéries.etc.
  • simple : redesign de crRNA slm pr changer la spécificité à la cible
  • ^ efficacité et versatilité
76
Q

Crispr/cas9 :
adaptation du crispr type 2 pr édition génomique:

éléments nécessaires pr crispr/cas9 dans le vecteur

A

-cas9, gRNA

77
Q

CRISPR/cas9 : efficacité du ciblage et mutations hors-cible :
mutations hors-cible

différences d’efficacité ?

A

CRISPR /CAS9 se compare avantageusement aux autres méthodes

talens et ZFN 1-50% efficacité ds ¢humaines

crispr/cas9 : >70% ds zebrafish + plantes et 78 % ds ¢ embryo souris

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