adn recombinant 1-2 Flashcards
technologie de l’adn recombinant consiste à quoi ?
transfert d’info génétique (adn) d’un organisme à un autre.
format d’une expérience d’adn recombinant (4 ÉTAPES)
- ADN est extrait coupé à l’aide d’enzymes et joint à une autre entité d’adn pour former une MOLÉCULE D’ADN RECOMBINANTE.
- MDR est transféré et maintenu ds une ¢ hôte. = introduction d’ADN ds une ¢hôte appelée TRANSFORMATION
- ¢ ak ADN sont identifiées et SÉLECTIONNÉES de celles qui ne l’ont pas incorporée
- la construction d’ADN p-e faite de façon à ce que la PROT.CODÉE par la séquence d’ADN inséré SOIT PRODUITE DANS L’HÔTE.
Enzymes de restriction reconnaissent quoi et coupent comment ?
séquences spécifiques d’ADNdb
coupent les 2 brins d’ADN À L’INTÉRIEUR OU TOUT PRÈS DE CES SÉQUENCES.
enzymes qui coupent les molécules d’AN à l’inté, d’une séquence = ?
endonucléases
enzymes qui dégradent à partir des extrémités
exonucléases
endonucléases de type 2 sont et font quoi ?
+ utilisés
coupe de façon reproductible l’ADN à un site spécifique à l’int. de cette séquence
3 types de coupure
- extrémités cohésives overhang 5’ ( brin en haut : 5’ court et oh’ long)
- extrémités franches
- extrémités cohésives avec extension 3’
Quelles coupures ces enzymes font ? EcoRi BamHi PTsl Pvu3 Hpal Notl
5-Po4 5-Po4 3-oh franche franche 5-po4
Protection d’ADN par les bactéries de quelle façon?
méthylation => site n’est plus reconnu par l’enzyme de restriction.
3 types de bases méthylés sont retrouvées ds ADNbact.
5-méthylcytosine
N4-methylcytosine
N6-methyladenine
ADN plasmide contient 2 adn methyltransferase (sitespécifique)
- DAM (gm6Atc)
- DCM (Cm5CaGG ou Cm5CTGG)
Si enzymes de restriction rencontrent une base méthylée (3 effets)
- 0 effet
- inhib. partielle
- inhib complète
enzyme de type IIS => particularité?
reconnait la séquence et va couper à (x) nucléotides plus loin
Isoschizomère ?
vs
Néoschizomère
EdR reconnaissant la mm séquence cible et clivant au mm site
EdR reconnait mm séquence cible mais coupant à un site diff.
Coupures compatibles sont possible si les 2 extrémités sont ___
franches ou extrémités cohésives provenat d’un MM EdR
Coupures compatibles :mécanisme ?
- Coupures avec certains couples d’EdR (couper à une certaine place)
- Séquences compatibles et vont pvr se coller ensemble
Particularités de l’act. EdR (cb de nuclé on doit laisser autour pr avoir un clivage de >90%
2 nucléo de chaque côté
Particularités de l’act :
Activité star
Qd cond. rxnelles pas optimales (tampon,pH) => - séleectives
=> coupure à sites n-spécifiques
Utilisation de plusieurs EdR en mm temps possible, mais dépend de :
Conditions optimales de catalyse pour CHAQUE enzyme
eg: tampons des EdR peuvent varier et inhiber les enzymes (soit digérer 2 sites de restr. en mm temps ou digérer 1 pis ensuite digérer avec la 2e)
Méthode d’analyse de restriction :
-Reconnaissance des séquences coupées en fonction de la position dans le gel (fragments coupés + longs => migration - loin sur le gel d’agarose
Méthode d’analyse de restriction :
coupure d’un fragment linéaire
vs coupure d’une frament circulaire
linéaire :
x coupure = x+1 fragments
circulaire :
x coupure = x fragments
EdR : Analyse du plasmide recombinant
: (pas une question)
être capable de calculer la longueur des fragments après les coupures (diapo 16)
eg: clonage de l’insert ds le plasmide en utilisant les EdR
- coupure avec les enzymes du fragment voulu (1.7kb) qui va former l’insert
- Clonage de l’insert
- Insertion de l’insert et formation du plasmide recombinant
Comment s’assurer que les enzymes ne coupent à l’intérieur de notre séq. à amplifier ?
- création d’amorces de PCR qui contiennent les ext. n-appariées (à l’ext. de l’ADN d’intéret) contenant un site de restriction
- enzymes de digestion => coupure dans les ext.n-appariées et non ds l’ADN