adn recombinant 1-2 Flashcards
technologie de l’adn recombinant consiste à quoi ?
transfert d’info génétique (adn) d’un organisme à un autre.
format d’une expérience d’adn recombinant (4 ÉTAPES)
- ADN est extrait coupé à l’aide d’enzymes et joint à une autre entité d’adn pour former une MOLÉCULE D’ADN RECOMBINANTE.
- MDR est transféré et maintenu ds une ¢ hôte. = introduction d’ADN ds une ¢hôte appelée TRANSFORMATION
- ¢ ak ADN sont identifiées et SÉLECTIONNÉES de celles qui ne l’ont pas incorporée
- la construction d’ADN p-e faite de façon à ce que la PROT.CODÉE par la séquence d’ADN inséré SOIT PRODUITE DANS L’HÔTE.
Enzymes de restriction reconnaissent quoi et coupent comment ?
séquences spécifiques d’ADNdb
coupent les 2 brins d’ADN À L’INTÉRIEUR OU TOUT PRÈS DE CES SÉQUENCES.
enzymes qui coupent les molécules d’AN à l’inté, d’une séquence = ?
endonucléases
enzymes qui dégradent à partir des extrémités
exonucléases
endonucléases de type 2 sont et font quoi ?
+ utilisés
coupe de façon reproductible l’ADN à un site spécifique à l’int. de cette séquence
3 types de coupure
- extrémités cohésives overhang 5’ ( brin en haut : 5’ court et oh’ long)
- extrémités franches
- extrémités cohésives avec extension 3’
Quelles coupures ces enzymes font ? EcoRi BamHi PTsl Pvu3 Hpal Notl
5-Po4 5-Po4 3-oh franche franche 5-po4
Protection d’ADN par les bactéries de quelle façon?
méthylation => site n’est plus reconnu par l’enzyme de restriction.
3 types de bases méthylés sont retrouvées ds ADNbact.
5-méthylcytosine
N4-methylcytosine
N6-methyladenine
ADN plasmide contient 2 adn methyltransferase (sitespécifique)
- DAM (gm6Atc)
- DCM (Cm5CaGG ou Cm5CTGG)
Si enzymes de restriction rencontrent une base méthylée (3 effets)
- 0 effet
- inhib. partielle
- inhib complète
enzyme de type IIS => particularité?
reconnait la séquence et va couper à (x) nucléotides plus loin
Isoschizomère ?
vs
Néoschizomère
EdR reconnaissant la mm séquence cible et clivant au mm site
EdR reconnait mm séquence cible mais coupant à un site diff.
Coupures compatibles sont possible si les 2 extrémités sont ___
franches ou extrémités cohésives provenat d’un MM EdR
Coupures compatibles :mécanisme ?
- Coupures avec certains couples d’EdR (couper à une certaine place)
- Séquences compatibles et vont pvr se coller ensemble
Particularités de l’act. EdR (cb de nuclé on doit laisser autour pr avoir un clivage de >90%
2 nucléo de chaque côté
Particularités de l’act :
Activité star
Qd cond. rxnelles pas optimales (tampon,pH) => - séleectives
=> coupure à sites n-spécifiques
Utilisation de plusieurs EdR en mm temps possible, mais dépend de :
Conditions optimales de catalyse pour CHAQUE enzyme
eg: tampons des EdR peuvent varier et inhiber les enzymes (soit digérer 2 sites de restr. en mm temps ou digérer 1 pis ensuite digérer avec la 2e)
Méthode d’analyse de restriction :
-Reconnaissance des séquences coupées en fonction de la position dans le gel (fragments coupés + longs => migration - loin sur le gel d’agarose
Méthode d’analyse de restriction :
coupure d’un fragment linéaire
vs coupure d’une frament circulaire
linéaire :
x coupure = x+1 fragments
circulaire :
x coupure = x fragments
EdR : Analyse du plasmide recombinant
: (pas une question)
être capable de calculer la longueur des fragments après les coupures (diapo 16)
eg: clonage de l’insert ds le plasmide en utilisant les EdR
- coupure avec les enzymes du fragment voulu (1.7kb) qui va former l’insert
- Clonage de l’insert
- Insertion de l’insert et formation du plasmide recombinant
Comment s’assurer que les enzymes ne coupent à l’intérieur de notre séq. à amplifier ?
- création d’amorces de PCR qui contiennent les ext. n-appariées (à l’ext. de l’ADN d’intéret) contenant un site de restriction
- enzymes de digestion => coupure dans les ext.n-appariées et non ds l’ADN
3 critères pour que l’insert soit placé dans la bonne direction
- doit être placé en aval d’un promoteur
- ds le bons sens
- respecter le cadre de lecture
Meilleure technique : placer l’insert ds la bonne direction
******* réponse pas certaine
- utilisation de 2 EdR ( avec 1 enz. qui génère une ext. cohésive)
- (ajout de sites à nos amorces qui codent pr des EdR pr que ça soit différent aux 2 amroces pr savoir quel côté est le bon)
Insérer fragment ds le bon cadre de lecture : problème ?
séquence est lue en décalant le départ de lecture d’une seule base => une séquence peptidique complètement différente est obtenue.
=> décalage du cadre de lecture (FRAMESHIFT) => peut produire un codon stop
Méthode pr insérer le fragment dans le bon cadre de lecture :
- s’assurer des trios de nucléotides vont bien s’aligner
- prévoir avec la coupure de l’enzyme => analyser l’amorce coupée devrait ressembler au cadre de lecture
Enzymes utiles pour les techniques d’ADN recombinant:
exonucléase 3 = ?
Part des ext. 3’ et coupent jusqu’à que ce n’est plus de l’ADNdb => production de fragments sb
Mécanisme de ligation (ligase) (4)
Formation d’un lien phosphodiester à partir du 3’-OH et 5’-PO4 des brins à joindre. (T4ligase)
=> 3OH et 5PO4 => présent pr faire la ligation
=>capable de lier des ext. franches => besoin 10 à 100 x + de T4 ligase
=>bactéries capable aussi
probleme : les plasmides vides durant la ligation
problème :
Ligation du plasmide sans avoir lié l’adn d’intéret
Technique pr plasmides vides
- Phosphatase alcaline va enlever tous les 5PO4 du vecteur (devient 2 OH)=> empêche d’être refermé sur lui mm ak ligase =>
=>formation du plasmide recombinant p-e refermé (présence de bris sb= nicks)
=> ligases vont lier ces nicks
fonction d’un vecteur ?
Transporte un ADNcirculaire pour STOCKER ou EXPRIMER ds un type ¢laire quelconque.
Quand-est ce qu’un insert sera un transgène ?
s’il s’agit d’un gène que l’on désire exprimer ds un type ¢ qui ne possède pas
4qualités d’un vecteur
- Origine de réplication (pro/eucar)
- plusieurs sites de restriction pr cloner
- possède 1 ou plusieurs gènes de résist. aux antibio ( = marqueurs génétiques)
- Peut présenter un promoteur de notre choix (spécifique au rôle du vecteur)
Ordre de grandeur des vecteurs :
Plasmide ?
0.1-10 kb (adn petit) => vecteurs simples pr cloner de petits fragments
Ordre de grandeur des vecteurs :
Bactériophage :
10-20kb
=> vecteurs capacité intermédiaire => multiples clones
Ordre de grandeur des vecteurs :
cosmide
35-45 kb : vecteurs simples ; peu utilisé
Ordre de grandeur des vecteurs :
BAC
50-300 : vecteurs généralistes très utilisés ds projet du génome humain
Ordre de grandeur des vecteurs :
YAC
100-2000
Très grande capacité, utilisation complexe et applications spécifiques
Ordre de grandeur des vecteurs :
HAC
> 2000 kb
4 avantages des plasmides
- ez 2 use
- auto-réplication => prolifération de ce plasmide dans les bactéries
- stables : à long terme sous forme d’ADN purifié ou dans des bactéries transformées
- Fctnnels ds différentes espèces et peuvent être utiles pour diverses applications : utilisés pr comprendre le fctnnement des promoteurs, des petits ARN .etc
plasmides sont dans des bactéries comme des entités _____________
extra-chromosomiques indépendantes
Plasmide F ?
Contiennent l’information pour leur propre transfert d’une ¢à l’autre
Plasmide R
Encodent la résistance aux antibiotiques
Les plasmides peuvent se répliquer ?
oui, grâce aux origines ORI
narrow-host-range-plasmid
vs
broad-host-range-plasmid
- sélectif aux mol. de l’hôte impliquées ds sa réplication
- p-e répliqué ds plusieurs hôtes
High-copy-number plasmids
10-100 mol/hôte
Low-copy-number plasmids
1-4 mol/hote
Transférage des plasmides entre bactéries par différents mécanismes (2)
- formation de pili (naturel)
- transformation
Type de plasmides :
plasmides de clonage
- faciliter le clonage de fragments
- contient slm un gène bactérien de résistance à un antibiotique, Ori + MCS
Types de plasmides:
Plasmides d’expression
- utilisé pr expression des gènes
- contient une séquence promoteur (production d’ARN à partir ADN)
- séquence de terminaison(signaler fin de transcription arn)
- séquence activatrice pr augmenter la qt de prots
- séquence de transcription et le gène inséré
Types de plasmides :
gene knock-down
- réduire l’expression d’un gène endogène =>expression d’un shRNA ciblant l’ARNm du gène d’intérêt
- pr ARN courts
Types de plasmides:
Reporteurs
- étudier fct des éléments génétiques
- gènes rapporteur qui : offre une lecture de l’activité de l’élément génétique.
Types de plasmides:
viraux
- structure des virus => transfert du matériel génétique ds ¢ cibles
- créer particules virales
Plasmide de 1st gen
- ds nature
- pr insérer séq. d’ADN => pas bcp de sites de restrictions, pas de gène de Resis, ni de promoteur (pr ^ expression gène)
Plasmide 2nd gen
-plasmides naturels => plasmides recombinants utiles et faciles (PBR322)
Plasmide 3rd gen
-optimisés pr faciliter clonage et sélection => + polylinker( site de clonage multiple)
plasmides d’expression eucaryote
optimisation pr expression chez eucaryotes
PBR322
caractéristiques
- 2 gènes de résis aux AB(Ampiciline et tétracycline)
- quelques sites de restriction et 1 orig
- possible de cloner un fragment d’ADN ou gène ds l’un des sites de restriction présent ds gènes de résistance aux AB
- si insert est inséré ds SdR contenus ds GdR aux AB => gène n’est plus fctnnel et bactéries ne seront pas résistantes à cet AB
PUC19
caractéristiques
- +pratique que PBR322
éléments qui entrainent un mode de clonage et de sélection différent :
- Site de clonage multiple
- gène b-galactosidase et controle de son expression
Exemple de plasmide d’expression eucaryote moderne
a) site de clonage multiple qui fait preuve d’utilisabilité
- bon vecteur contient plusieurs SdR pr faciliter clonage
- différents sites peuvent permettre clonage de l’insert ds différents cadres de lecture
Exemple de plasmide d’expression eucaryote moderne
B) Présence d’un tag
- séquence de nucléotide ajouté en 5’ et 3’ du gène d’intérêt => produisant une prot. chimérique ou prot. de fusion.
- tag utile pr détection et isolation
Exemple de plasmide d’expression eucaryote moderne
C) présence d’un promoteur
-fort pr expression ds ¢ de mammifères => puissante expression du gène (promoteur IE du cytomégalovirus humainCMV)
Exemple de plasmide d’expression eucaryote moderne
D) 1 ou plusieurs GdR aux AB
- sélection ds bactéries et/ou ds des ¢ de mammifère
- régions = cassettes de résist. => contiennent leur propre promoteur
En d’autres mots :
vérifier si la ligation a eu lieu => mettre nos ¢ ds un antibio, ceux qui ont incorporés le plasmide vont être résistantes et survivent
Amp vs b-lactamase
- amp inhib. 3e et last étape de la synthèse de la paroi ¢laire bactérienne catalysé par la transpeptidase
- cette inhibition condui lyse ¢laire
le gène de résistance à l’ampiciline produit b-lactamase qui hydrolyse ampiciline
Exemple de plasmide d’expression eucaryote moderne
E) différentes ORI
- différentes ori permettent une réplication des plasmides ds l’hôte voulu :
1. ori ds bactéries
2. ori ds ¢ mammifères
3. ori ds levures.etc
réplicon est une ?
molécule/région d’ ADN ou ARN => capable de se répliquer à partir d’une seule ORI
- unité de réplication ADN bicaténaire
- chez procaryotes : ensemble du chromosome
- eucaryotes : plusieurs réplicons par chromosome
Exemple de plasmide d’expression eucaryote moderne
F)Séquence d’amorce standard
-amorces complémentaires à ces séquences p-e utilisées pr séquence ou amplifier la région du plasmide où a été insérée la séq. d’intérêt
Exemple de plasmide d’expression eucaryote moderne
g) Signal de polyadénylation
- chez ¢ eucaryotes : prots doivent contenir un signal de polyA en 3’ de l’insert => produire ARNm mature ak une queue poly A stable => transporté dehors et traduit en prot.
- vecteurs d’xpression proc ne contiennent pas de signal de polyA
3 états des plasmides
1: circulaire covalente fermée surenroulée => super repliement => capable de se faufiler et migrer
2. circulaire, relâchée, un des 2 brins est coupé (open circular => migre encore moins bien)
3. linéaire (permet de déterminer la taille réelle du segment)
Chlorure de Césium utilisé pk ?
-séparer des fragments de matériel génétique de masse volumique différente => (centrifugation)
3 mécanismes de réplication de plasmides
- unidirectionnelle : 1 fourche de rép.
- Bi-directionnelle : 2 fourches de réplic
- Circulaire : simple brin est généré par réplication puis le brin complémentaire est synthétisé pr reformer un plasmide db circulaires
Spectre d’hôtes des plasmides est déterminé par ?
région ORI qui doit etre compatible avec le syst. réplicatif de l’hôte.
-le reste des prots nécessaires à leur réplication sont fournies par la ¢hôte.
2 types de controle de l’initiation de réplication
(contrôler le nbr d’exemplaire de plasmide ds une ¢) ont été identifiés
- régulation par des ARN antisens
- régulation par fixation des prots. essentielles sur des itérons (séquence d’ADN répétitif)
comment avoir incompatibilité entre plasmides ?
-2 plasmides partagent le mm mécanisme de controle de réplication
Mécanisme ARN-antisens
RNa2 va synthétiser un bout d’ARN qui va servir d’amorce pr la réplication => utilisation d’une autre enzyme qui va synthétiser un bout d’ARNcomplémentaire à l’amorce => + de plasmides + d’armoces + de bouts arn antisens => bloque polymérisation (limiter qt plasmides)
Fonction
arn 2
arn1
rop
- arn2 : forme amorce pr initiation synthèse ADN
- arn1 et Rop : régulateurs négatifs de la réplication
- arn1 lie arn2 => empeche formation de l’amorce
- rop stabilise 1 et 2
Types de plasmides d’expression (2)
procaryotes : production ARN/prots ds bactéries
Eucaryotes : production arn/prots ds ¢eucaryotes
4 caract. entre plasmides d’expression eucary vs procary
- composantes communes
- spécialité de certaines composantes qui modifiera la fct de ces vecteurs
- 2 types de plasmides peuvent être amplifiés ds bactéries (ori procaryotes)
- GdR + promoteurs vont être différents ds ces types de vecteurs
Expression procaryote (+ et -)
+:
- facilité de culture => prot rapide apres clonage
- facilité induction + controle expression
- bcp prot produite
- syst. expressions dispo
- syst. commerciaux d’ex. bact. rendent la purification simple
- :
1. prots souvent n-actives (dénaturés,n-solubles)
2. modif. post-traduc pas ajoutés par bactéris => prot pourrait ne pas avoir act. native
Exp. eucaryote (+ et -)
+ :
- niveau xpress ^^
- syst. purification
- sécrétion possible de la prot. ds milieu => production cste de prot sans lyser ¢
- prot produite sous forme fctnnel, replié et porte modif.posttraduc
- `
1. croissance lente + +de soins
2. level of exp - important qu’ak les bactéries
3. limité pr produire prots. toxiques à la ¢
caractéristiques vecteurs eucary et procary
Eucary (4) :
- Poly A : signal de polyadénylation
- SV40 ori : origine de réplication actif ds eucaryotes
- NEor : résistance à la némoycine (sélection eucaryote)
- Kozak : séquence autour codon initation + ^ lvl expression
Procaryote (6)
- Région contrôle/induction de l’expression (LAC)
- RBS : site de liaison ribosome
- TEV : Site de clivage (prot. de fusion)
- T7 terminator : arrêt de la transcription
- Lacl : Produit le répresseur de l’opéron lac
- codon stop
Prots. fluorescente (GFP) (2 caractS)
- utile pr microscopie à fluo
- déterminer la localisation de la prot. (eg : LAMP-C = marqueur des lysosomes.
4 classes AB:
ampiciline : mode d’action
-bloque formation de la paroi bactérienne
4 classes AB:
aminoglycosides
-lient s-u30S et entrainent des erreurs de traduction en bloquant les translocations des ARNt-aa ds sites A ou P
4 classes AB:
tétracycline :
empeche liaison arnt-aa à la s-u 30s
4 classes AB:
phénicolés
Inhibe l’act. peptidyl transférase
Ampiciline streptomycine tetracycline chloramphénicol kanamycine néomycine
ampiciline amino tetra phénicolés amino amino
Caractéristiques de bactéries à transformer (3)
1- compétence : transformer petites qt d’ADN ds bactéries (compétentes après tx de CaCl2 suivi choc thermique)
2- absence EdR ou autres nucléases
3- Absence de prots importantes ds recombinaison
Profil de croissance
- milieu nutritif en présence AB
- croissance optimale : t=37°C + grande surface liquide-air => remplissant que peu l’erlenmeyer + augmenter rotation
-induction de production de prots recombinantes + préparation de bact. compétentes ds phase exponentielle (3) => pcq act. métabolique + active
Conséquences (3) d’une bactérie lysée
- libérer du matériel génétique
- adn génomique dégradé
- présentation de l’adn génomique en adn linéaire
procédé de transformation et bactérie est appelée comment ?
1 bact. / 1000 peut intégrer le matériel génétique
bactérie est dite compétente
à quoi correspond le complexe de compétence ?
La compétence d’une bactérie fait intervenir plusieurs prots (formant un canal couplé à des nucléases) ds la paroi bactérienne
Critère de compétence d’une bactérie ?
-doit être en phase exponentielle de croissance
un plasmide linéaire et sb peut il devenr db ?
oui grâce à la machinerie réplicative de l’hôte
Adn linéaire n-plasmidique peut former un plasmide avec ORI ? si oui qd ?
non, mais si homologue ak ADN de l’hôte => peut faire une invasion sb + recombinaison homologue
Capable de rendre les ¢ bactériennes compétentes artificiellement?
- intégration des plasmides de leur environnement lors de la transformation
Concept de compétene naturelle ?
Incorporation d’ADN libre se trouvant dans le milieu environnement par les ¢bactériennes.
EXPÉRIENCE SOURIS
-> mélange de ¢mortes virulents avec ¢ n-virulents vivants => met dans la souris => RIP
Les bactéries peuvent incorporer de l’ADN étranger (3 façons)
conjugaison
transformation
transduction
façon d’incorporer de l’ADN étranger :
conjugaison
- transfert de matériel génétique entre 2 ¢bact. par un contact ¢-¢.
- formation d’un pont entre les 2 ¢ =>transférer une partie d’ADN sous forme de plasmide => récipient au donneur.
Technique du CaCl2 + choc thermique :
- permet de provoquer artificiellement compétentes
- rend la mbr poreuse et dépolarisé => permet au plasmide d’entrer ds ¢
Technique d’électroporation :
- courant électrique => modifications de pot.mbr transitoire ce qui augmente leur perméabilité.
- taux de transformation 10^8 -10^10
- dépolariser mbr => transférer plasmide ds mbr
Technique de transduction :
- transfert de matériel génétique entre 2 bactéries (de la mm espèce) par l’intermédiaire d’un vecteur viral.
- processus efficace (protection du DNA dans les particules virales et d’un syst. de délivrance)
2 types de transduction :
1) généralisée est assurée par des phages virulents ,c-a-d (phages qui se multiplent ds bactéries). N’importe quelle région chromosomique p-e transduite
2) Restreinte : assurée par des phages tempérés (des fois virulents ds certaines conditions (cycle lytique) et capables de s’intégrer ds le chromosome de la bactérie hôte sous forme de prophage ds d’autres cond. (cycle lysogénique)
Phage le + utilisé dans la transduction
bactériophage (lambda) => version modifiée du phage sauvage contient 2 sites BamHI
Étapes générales de la transduction (5):
- Insert du fragment ds sites Banhmi en remplaçant la région => FORCANT LE PHAGE lambda À DEMEURER en PHASE LYTIQUE
- Encapsidation in vitro de l’ADNlambda recombinant
- Dépôt sur un tapis de bactéries + croissance
- Transfert sur un fitre
- Hybridation/détection des plages de lyse positives
Transfert d’ADN ds ¢ eucaryotes (méthode)
-inclusion de l’ADN à transfecter ds liposomes => structures lipidiques possédant des propriétés structurelles comme les mbrs ¢laires => permet de fusionner et libère ADN ds ¢.
PBR322
- Clonage d’un fragment d’ADN ds site BamHi
- plasmides recombinants seront sensibles à la tétracycline et résistants à ampiciline
Technique du réplicat
-formation de colonies de bactéries résistantes après l’expression du gène de résistance à l’AB.
Opéron Lac de E.coli:
Qu’est-ce qu’un opéron ?
ensemble de gènes tous induits ensemble chez les procaryotes
Opéron Lac de E.coli:
fct iptg
analogue artificiel de l’allolactose et sera utilisé expérimentalement
Opéron Lac de E.coli:
LacZ
Encode pour la b-galactosidase (transforme lactose en glucose + galactose et allolactose (produit secondaire de la rx)
Opéron Lac de E.coli:
b-galactosidase
enzyme qui dégrade lactose en:
- glucoose + galactose
- allolactose
Opéron Lac de E.coli:
répresseur
répresseur qui est activé et qui empêche l’accessibilité à l’ARNP sur son promoteur = >
LacZ ne peut synthétiser la B-galactosidase en absence de lactose.
Opéron Lac de E.coli:
qu’est ce qui l’Active ?
Présence de lactose => digérée par (pas bcp) de b-gal => formation d’un produit secondaire (allolactose)
=>allolactose se lie au répresseur et permet ^^ lacz => ^ b-gal
Opéron Lac de E.coli:
qu’est ce qui l’inhibe
absence de lactose => répresseur est synthétisé par Lacl => bloque la transcription en amont de Lacz
ARN polycistroniques des procaryotes sont quoi ?
encodent pour plusieurs protéines.
Les cistrons contenus dans ces ARN sont traduits en mm temps et ont souvent des rôles conjoints dans une voie métabolique donnée
Comment déterminer si une bactérie exprime B-gal ?
B-gal peut cliver X-gal et produit un coloré bleu insoluble par catalyse enzymatique
Dépistage bleu-blanc (5étapes) :
1-effectuer la ligation de l’ADN d’intérêt digéré (insert) avec le vecteur digéré correspondant
- Si l’insert placé dans le MCS, il n’y aura plus de B-gal induite, parce que le MCS est situé à l’intérieur de la séquence codante de B-gal =>changer son cadre de lecture
- Si l’insert n’est pas présent, le vecteur se referme sur lui-même (self-ligation), surtout si on a pas fait une bonne stratégie de clonage
- IPTG est un modulateur allostérique négatif du répresseur de l’opéron lac (same shit que allolactose, mais synthétique et n-hydrolysable)
- rép. inhibé, b-gal est produite uniquement ds les vecteurs où l’insert n’est pas présent. Elle concertira X-gal en composé bleu. sélectionner les clones blancs (
7 étapes de l’Extraction des plasmides à partir des bactéries amplifiées
- Centrifugation de la culture bactérienne
2- Resuspension. On effectue un choc osmotique => on détruit ARNs et dégrade le peptidoglycane
3-Lyse et dénaturation (SDS et NAOH respectivement)des prots et ADN
4-Neutralisation => précipitation des lipides et grosses protéines. L’ADN CHROMOSOMIQUE partiellement renaturé est pris dans le PRÉCIPITÉ. Les plasmides, renaturés, demeurent solubles en solution
5- Élimination du précipité par centrifugation
6-Extraction phénol/chloroforme des plasmides ou utilisation d’une colonne de silice
7- Précipitation à l’éthanol des plasmides
Quantification des plasmides se fait comme ____
pour l’ADN à lambda = 260nm
Différentes options qu’on peut faire avec des prots après la précipitation (3)
Électrophorèse => westernblot (détection de la prot. TAG ak AC ds un syst. de fluo/luminescence)
Immunoprécipitation => étude des modifs. posttrraduct
immunoprécipitation => étude de l’Activité in vitro
Principe de purification d’affinité et une détection des prots. exprimées
- Chargement : ¢ lysées et prots solubles sont chargées sur la colonne d’affinité. Seules les prots ayant un TAG vont se lier par affinité à la colonne
- Lavage : Prots. n-liées vont être lavées de la colonne. Le tampon de lavage doit préserver la liaison d’affinité avec le TAG
- Élution : Compétiteur pr la liaison d’affinité et relâche les prots liées .
- Western : anticorps spécifique au TAG permet de révéler la prot. en western blot
Tag (His)6 :caractéristiques
- entre en coordination avec les atomes de nickel liés fortement aux billes
- avantage d’être petit et n’avoir habituellement peu d’influence sur le comportement de la prot.
Tag GST : caractéristiques
- volumineux
- enzyme pr la détoxification de substances variées nocives
- utilise comme co-substrat le gluthation, un tripeptide au rôle antioxydant
Stratégie d’élution:
-billes couplées au glutathion de manière covalente => pour éluer : ajout d’une enzyme qui va cliver le tag (thrombine)
Rôle des tags :
isoler une prot. sans avoir à utiliser un AC spécifique pr cette prot. La production d’AC est longue et dispendieuse
Fonctionnement syst. pET
- ARNpol T7 pas exprimé dans E.coli
- Les Ecoli BL21 contiennent le gène de la T7 ARNpol sous controle de l’opéron lac
- Le plasmide pET utilise un promoteur T7 spécifique en amont du gène cible dont l’expression est également sous contrôle de l’opéron lac
- pas d’ARNpol T7 => pas de prot
- double controle d’expression
- Lysosyme T7 peut diminuer act. de T7 ARNpol. (diapo 73)
Code génétique fonctionne par triplets
ADN => ARNm => Prot
Étapes générales du clonage
ADN intéret => vecteur recombinant (par clonage) => bactéries avec vecteur (par transformation et sélection) => 2 choix :
- bactéries avec vecteur (par transformation et sélection) => induction
=> production de la prot.ds bactérie => purification/ quantification => stockage ou tests in vitro - bactéries avec vecteur (par transformation et sélection) =>
Amplification du vecteur +++ croissance =>
Purification/quantification =>
mutagénèse OU
transfection/thérapie génique
=> production de la prot. ds des ¢ mammifères=> …=> thérapie (prots.
recombinantes)
ou
=> production de la prot. ds des ¢ mammifères=> Western Blot
Vue générale d’un clonage : sources d’ADN ?
- adnc
- fragment d’ADN génomique soniqué
- un autre plasmide
- adn + plasmides doivent être digérés par des enzymes de restrictions en vue de créer la molécule d’ADN recombinant
Exemple de procédure de clonage si on commence avec :
-adn génomique
-> PCR amroces ECORI et BamHII
=> digestion par2 EDR => ligation ds plasmide =>bactéries compétentes => transformation (choc thermique, CaCl2) =>
bactéries transformées ak plasmide capables de se répliquer => sélection (antibio) + confirmation de la présence du fragment ds le SdR + son orientation => milieu de culture
plusieurs choix :
- congélation
- purification
- controle d’expression après transfection ¢eucaryotes
- Confirmation de la séquence
Exemple de procédure de clonage si on commence avec :
ARNm total
=> RT => PCR =>ECORI et BamHII
=> digestion par2 EDR => ligation ds plasmide
=>bactéries compétentes => transformation (choc thermique, CaCl2) =>
bactéries transformées ak plasmide capables de se répliquer => sélection (antibio) + confirmation de la présence du fragment ds le SdR + son orientation => milieu de culture
plusieurs choix :
- congélation
- purification
- controle d’expression après transfection ¢eucaryotes
- Confirmation de la séquence
Exemple de procédure de clonage si on commence avec :
ADN d’un plasmide
Digestion EcoRi/Bamhi => ligation ds plasmide =>bactéries compétentes => transformation (choc thermique, CaCl2) =>
bactéries transformées ak plasmide capables de se répliquer => sélection (antibio) + confirmation de la présence du fragment ds le SdR + son orientation => milieu de culture
plusieurs choix :
- congélation
- purification
- controle d’expression après transfection ¢eucaryotes
- Confirmation de la séquence
sous-clonage ?
Vecteur dans lequel se retrouve l’ADN à sous-cloner vs autre vecteur ds lequel on désire introduire la séquence d’intérêt
sous-clonage = technique utilisée couramment en bio. moléculaire . => insérer à ds un nouveau vecteur un fragment d’ADN déjà isolé ds un autre vecteur
mutagenèse de séquence
possible de modifier la composition des AA d’une prot. en vue de déterminer leurs rôles ds cette dernière.
Génération de mutations aléatoires :
1-error prone PCR
technique consiste à augmenter les erreurs que fait la TAq => pr produire mutations au hasard.
=> mutants pourront être testés en fct de leur activité, stabilité et être séquencés pr connaitre nature de la mutation intéressante
Génération de mutations aléatoires :
2- Mutagenèse chimique
Forcer la désamination des bases => mutations => forcer le clonage de ces mutations dans une population hétérogène=> hybridation de l’amorce oligonucléotidique (fait la 2 couche circulaire) => digestion de l’ADN et élimination des vecteurs endommagés => il reste les frafments mutants => ligation + extraction de l’ADN du plasmide => biblio de plasmides mutants ????????????????????
Mutagenèse dirigée (par oligo)
- produire des prots. recombinantes mutées par mutagenèse dirigée (n-aléatoire)
- modifier précisement 1 ou plusieurs nucléotides désirés en vue d’entrainer des mutations faux-sens
-appel à la technique de polymérisation de l’ADN que nous connaissons bien.
2 paramètres importants de la méthodologie générale de la mutagenèse dirigée
- conception d’amorces de mutagenèse
- sélection plasmides mutants
TEchnique générale de la mutagenèse dirigée
- amorce conçue pr présenter une mutation au centre
- hybridation dans la 1ere couche associée => plasmide hétéroduplex mutant => synthèse du brin complémantaire (brin mutant)
1ere couche : brin sauvage
2 couche : brin mutant ak mésappariement
- taux de mutagenèse faible (<50%) puisque la bactérie a la capacité de réparer les mésappariements avant la réplication.
- faut amplifier de nbrx clones et séquences les plasmides pr trouver la mutation
Technique de sélection de mutations
répliquer les bactéries transformées sur un filtre de nitro¢lose= dénaturation de l’ADN et neutralisation (2 couches se séparent)
=>effectuer une hybridation à l’aide de la sonde utilisée pr mutagenèse => sonde s’hybride à l’ADN sauvage et ADN mutant
=> lavage => sonde reste fixée à ADN mutant => isoler l’ADN muté
3 étapes de la mutagenèse dirigée
- connaitre la séquence à modifier. L’ADN à muter doit être placé ds un vecteur qui a été produit ds bactéries DAM+ (méthylase de l’ADN) => il est méthylé
- conception de 2 amorces qui vont s’hybrider sur les brins d’ADN et vont porter la mutation
- amorce de la mutagenèse avec le mésappariement => Tm varie en fct des mésappariements
