découverte, production et utilisation de PROTSSSSSS recombinantes et autres entités bio à action txique Flashcards
4 façons de rentrer ds le noyau et 4 types de molécules qui peuvent rentrer
- Rc dimérisé
- canal ionique
- passer à travers la mbr
- rc hétérooligomères ?
- facteurs de croissance/Hormones
- photons, hormones, molécules odorantes
- NT, voltage, mécanique
- ptites molécules hydrophobique
2 méthodes d’Action des antagonistes
- se liant au rc
- bloquer l’étape de dimérisation
Prots par leur tailles peuvent-elles agir au niveau intra¢ ?
si trop grosses non => doivent donc jouer sur la partie extérieur (amino-terminale) du rc
4 types de prots. recomb.
- agonistes
- anticorps
- antigènes (vaccins)
- Biosenseurs : détection
qu’est-ce qu’une région codante ?
ce qui se retrouve sur arnm mature qui va coder pour un polypeptide
-conservée jusqu’à la fin
Pk développer des prots recombinantes ?
- traitement est basé sur les propriétés du produit animal ayant une fct identique au produit absent chez le pt => problèmes de RÉACTIONS IMMUNITAIRES
- Produits dérivés des humains => peuvent être dangereux
définition de protéine recombinante
-qualifiées ds mesure où elle sont produites par des ¢ dont l’ADN a été modifié par recombinaison génétique
Fabrication d’une prot. recombinante donnée se base sur :
- emploi d’un vecteur d’expression jouant le rôle de transporteur génétique du gène d’intérêt codant pr la pro. recherchée
- utilisation d’une ¢ hôte, chargée d’exécuter les instructions fournies par le gène d’intérêt qui lui est inséré => objectif de synthétiser la prot. recherchée
- phase de prod. permettant de fabriquer les vol. de prots. souhaités
- séparation et extraction de la prot.du milieu de culture => purification
caractérisé par couple d’un vecteur d’expression + hôte (¢ / organisme)
Étapes de la production de l’insuline recombinante:
quelles questions on doit se poser ?
- fait par quel organe ? aie-je accès ?
- comment produire l’insuline ?
rép: en prenant l’ARNm présent => ADNc ak transcriptase inverse de l’ARNm => cloner ds un vecteur d’expression => couple insert/vecteur transférer chez E.coli => E.coli accepte le plasmide et le copie et produit de la proinsuline ds le cytoplasme (usine de production)
Insuline humaine : chaine b : ? AA
chaine A : ? AA
30 aa ds bêta
21 aa ds alpha
=> point disulfure entre les 2 chaînes
Production d’ARNm (caractéristique)
- ajout queue polyA
- coiffe en 5’
- retirage d’introns
Étape de la sélection ARNm du gène de la proinsuline
ARNm de proinsuline => on sait déjà quelle section qui va coder pr chaine b et a. => amplifier slm cette séquence => transformer en ADN (pcq + stable et se réplique
Polymérases et RT peuvent faire quoi ?
servir de l’ARN comme matrice
-passer un brin ARN à un ADN db
Production d’ADNc à partir D’ARN avec la reverse transcriptase
Matrice ARN avec un amorce d’ADN => appariement avec des bases complémentaires => RT => polymérisation
activité RNase H => dégrade ARN pas ADN
ADN polymérase classique => enlève ARN et forme ADNdb
Exemple d’isolation de chaine B de la proinsuline
-synthétiser une amorce (bleu) d’au moins de 18 bases (chiffre minimal pr se lier à une séq. pr pas qu’elle s’apparie avec d’autres séq ds l’ARNm) => brin d’ADN néosynthétisé => on met une amorce d’ADN à l’extrémité où la RT avait fini de synthétiser => amorce pr ADN polymérase et forme l’ADNc jusqu’à tant qu’il n’y ait plus de matrice
ADNc à la chaine qui code pr le brin b
Exemple d’isolation de chaine B de la proinsuline (2 ) suite
après obtenu adn db
doit être amplifié et incorporé ds syst. d’expression
- PCR : amplification
- plasmides (ADN recombinant) ; clonage du produit de PCR ds un vecteur d’xpression (ng)
- Amplification du couple vecteur-insert (mg)
- Incorporation ds hôtes (bactéries / levures)
- PCR
plusieurs cycle => amplification des milliers et milliers de fois
- Introduction de l’ADNc de l’insuline ds un plasmide (production d’un ADN recombinant = définition)
ADN recombinant : adn biologiquement acti qui a été constituée in vitro à partir de segments d’ADN issus de différentes sources
adn => gel d’agarose => va s’arrêter à un certain endroit => retirer et digérer (pcq on sait déjà à quoi l’insert va ressembler pr le mettre ds le vecteur ; on sait où les enzymes vont couper) => digestion du vecteur ak les memes enzymes utilisées ak insert
- faut avoir pensé lors de la séquence d’amorce (pour mettre des segments digestibles par les EdR)
Fonction du promoteur ds le plasmide
-production d’une grande qt d’ARNm codant pr la prot. recombinante
définition plasmide
ptite molécule d’ADN circ. retrouvée chez les bactéries qui se réplique indépendamment du génome bactérien
fonction de l’ORI
permet au plasmide d’être maintenu ds la bactérie
fct sélection ds plasmide
sélectionner les bactéries qui ont reçu le plasmide qui code pr un gène de résistance
choix de la complexité de la ¢ hôte dépend de la complexité de la prot
hôte : eucaryote ou procaryote ?
si prots glycosylée => eucary, sinon => procary
insuline => procaryote
eg : si on utilise des plasmides eucaryotes => machine transcriptionnelle va juste être capable d’amplifier
- Production de l’insuline à partir d’organismes exprimant le plasmide contenant l’ADNc de l’insuline
-croissance faite de façon séparée ( chaine a vs chaine b)
=> séparation et PURIFICATION des polypeptides => on va mettre les 2 chaînes ensemble => pr une rx d’oxydation => création d’insuline recombinante
purification pr se retrouve ds e.coli => endotoxines
hôte vs promoteur
la ¢ hôte va déterminer la nature du promoteur
-la machine transcrip. de l’hôte va permettre de former la prot (machine fctnne si présence de promoteur)
si ¢ hote ak eucaryote => juste amplifier avec le site ORI
Différents syst. de production de prots. recombinantes : ECOLI
- E.coli : pr fabriquer des prots simples
+ : génétique connue, bcp de vecteurs plasmidiques construits et disponibles, EZ, CULTURE DE MASSE, production grande qt de prots
- ; sécrétent mal les prots, doit casser la bactérie pr récupérer la prot
autres - : pas de modif. post-traduc. des prots (condition sine qua non d’Act. de la prot) + s’assurer de l’absence d’endotoxines
Différents syst. de production de prots. recombinantes :
Saccharomyces cerevisiae
Levure : prots complexes
+ : matériel simple et 0 toxicité , bons taux d’expressions des prots (- bons que ecoli, fabriquer des prots complexes + modif. post-tradu
- : prots synthétisées à l’int. du cytoplasme (doit casser la ¢ pr récupérer), bons pr petites prots, moiins bons pour grosses prots, rendement du produit bas (pcq protéases dégradent prots étrangères)
Différents syst. de production de prots. recombinantes :
CHO
chinese hamster ovary
+ : culture de masse en bioréacteur, synthétiser des prots complexes de HMW, capable d’introduire et exprimer gènes humains
- : rendements faibles, fragiles et culture cher
Autres couples vecteurs-hôtes : (3) + et -
¢ d’insectes:
+ : pascher , modifications post-traductionnelles
¢ de plantes
bétail transgénique
+: Pas cher que la culture de ¢ humaines en bioréacteurs
- : Génération d’un animal transgénique
Les gènes s’intègrent où dans l’animal receveur ?
ds les cx des lignées somatique et germinale
retour sur la formation de protéine recombinante (mécanisme)
-Complexe vecteur + insert => amplification => injection ds noyau d’ovule => recombinaison de cet adn avec le matériel génétique => ovule implantée ds mère porteuse => identification des moutons ak la présence du gène ds le g`énome => prots dans le lait de ces animaux
(produire b-lactoglobulin + prot. encodée par le gène d’intérêt)
Caractéristique de l’hormone de croissance recombinante
- 191 AA, régule croissance et développement
- hormones de croissance purifiées à partir d’animaux = > inefficaces chez l’H
2 procédés permettent de produire l’hormone de croissance humaine ds les bactéries
n-sécrétée
sécrétée
Production de l’hormone de croissance avec la forme n-sécrétée
utilisation d’ARNm de ¢ de l’hypophyse => isoler => design d’amoce => RT => ADN complémentaire => mm amorces ont été utilisés par PCR => produit de pcr cloné ds un VECTEUR
(avantage : possibilité d’amplification/réplication de ton gêne d’intéret) =>coupure et mettre ds vecteur
on pourrait directement le mettre dans un vecteur d’EXPRESSION
Production de l’hormone de croissance avec la forme n-sécrétée ( après la formation du vecteur d’expression)
-mettre l’insert en AVAL du promoteur procaryotique sur le MCS => insertion dans l’hôte => production de protéine s’accumule à l’intérieur de la bactérie (cytoplasme ) = n-sécrété
Production de l’hormone de croissance avec la forme SÉCRÉTÉE
Poour que la prot. soit sécrétée dans le périplaste (entre les 2 mbrs) => changement vecteur d’expression => vecteur d’expression sera suivi d’une séquence signal => choc osmotique => ouverture de la bactérie => facile à extraire
Rôles des interférons de type 1 (a/b) et de type (gamma)
cytokines avec des effets paracrines et autocrines modulant les rép. immunitaires innées et adaptatives
Effet sur les ¢ cibles (type1) (3)
- Antiviraux directs ; réponse innée
- Antiviraux indirects : réponse innée
- Maturation des ¢ dendritiques : réponse adaptative
Production recombinante des IFNs
-suit le mm profil de l’insuline (long mécanisme)
Formation de banques d’adnc
arn ¢ total => isolation des arnm (ceux ak polyA)
isoler arnm de l’Arntotal => sur une colonne d’affinité (ak des oligoDT + bille de sucre)
=> par hybridation => élution des autres arns et retenir les arnm retrouvés ds les tissus d’intérêts (design d’amorce pr sous-cloner et former des vecteurs )
=> synthèse du premier brin d’ADNc => traitement à la RNaseH=> synthèse du second brin d’ADNC (adn pol)
virus / vaccins : mécanisme:
-Virus enveloppé par la prot S => lyse ds ¢ et agglomération de prots S ds le sang (déterminant antigénique que notre syst.immuni va essayer de combattre)
formation du plasmide : amplification de la séquence (HBV cloné) par PCR (ADN, pas besoin de passer par la RT) et clonage ds un vecteur (pas directement ds le vecteur d’expression)
=> on veut cloner ds un vecter => sous-cloner/diriger la séq. d’intérêt ds un vecteur d’intérêt (eucaryotique : levure)
Segments ds vecteur d’expression ds levure ( 5)
Promoteur : reconnu par la machine transcriptionnel de la levure
Terminateur de la transcription
origine : répliquer qd la levure se divise
ampr : gène de résistance chez la bactérie
gène de compétence : pr L’AA leucine
virus / vaccins : mécanisme: (mécanisme après la transformation de levure)
- sélectionner les ¢ qui contiennent le plasmide sur un milieu sans leucine ( levures qui poussent vont être capable de coder pr la leucine (colonie a accepté le plasmide)
- bonne levure => production de prots par transcription => casser ¢ (isoler les ¢ par centrifugation) => purifier les particules HBsAg
Anticorps : domaines constants (caractéristiques)
- séquence en AA très proche d’un AC à l’autre
- chaine légère possède un exemplaire noté CL
- Chaines lourdes : 3 domaines csts : CH1, CH2, CH3
Anticorps : domaines variables
- 4 domaines variables situés aux extrémités des 2 bras
- site de reconnaissance de l’antigène est l’association entre un domaine variable chaine lourdre + domaine variable chaine légère.
Anticorps : sites de liaison
-molécule d’immunoglobuline possède 2 sites de liaison à l’antigène (chaque bras) => 2 sites sont identiques
Clivage enzymatique spécifique permet d’isoler différents fragments (4)
fc
fv
fab
f(ab’)2
fragment fc : caractéristiques
- cristallisable
- propriétés biologiques de l’immunoglobuline (capacité à être reconnu par des effecteurs de l’immunité ou à activer le complément)
- constitué de fragments csts de chaines lourdes
- RECONNAIT PAS ANTIGÈNE
FV : caractéristiques
- plus petit fragment gardant les propriétés de l’AC qui possède des domaines immunoglobuline
- constitué JUSTE de régions variables => fixe donc antigène ak mm affinité que l’anticorps complet
- monovalent
Fab: caractéristiques
-mm affinité pr antigène que l’anticorps complet
- formé de chaine légère en entier (VL + CL) + 1 partie lourde (VH + CH1)
- monovalent
f(ab’)2 : caractéristiques
- association de 2 fragments fab reliés par une petite partie des parties constantes des chaînes lourdes (région charnière)
- mm affinité que AC pr antigène
- divalent
Particularités de FC (rép. immunitaire)
- reconnait as Ag
- activation du complément :
a) ensemble de prots dont l’Activation => détruit bactéries par perforation et facilite phagocytose
b) médiateurs de l’inflammation - activation de ¢immunocompétentes :
a) reconnaissance d’un antigène ak sa partie variable, un AC peut se lier à des ¢du syst. immun ak sa partie cst
b) anticorps fixés sur une bactéries peuvent se lier aux macrophages => phagocytose
c) activation des NK ( lyse des bactéries)
Fonction des CDR
Régions déterminant la complémentarité => composés de 12 AA encodés par une séquence d’ADN de 36 pb
Protéines recombinantes (4) des anticorps
- Agonistes (insuline, IFNS)
- Anticorps
- Antigènes
- Biosenseurs : détection
Différentes stratégies pour la production d’AC monoclonaux (3)
- Production AC monoclonaux n-modifiés : AC murins :
- Production AC monoclonaux chimériques ( ACs recombinants)
- Production AC monoclonaux humanisés (ACs recombinants)
- Production AC monoclonaux humains
- Production AC monoclonaux n-modifiés : AC murins :
limitation ?
-utilisation thérapeutique des ACs est la production d’un AC d’intérêt en grande qt.
- Production AC monoclonaux n-modifiés : AC murins :
Technologie des hybridomes (mécanisme avant hybridomes)
- Antigène est injecté chez la souris
- qqes semaines plus tard => prélèvement de ¢
- présence de plasmocytes sécrétant des AC contre cet AG ds les ¢
- Fusion in vitro des plasmocytes avec des myélomes => capacité de se multiplier et obtention hybridomes
- Production AC monoclonaux n-modifiés : AC murins :
à partir des hybridomes
particularités des plasmocytes
et problématique ?
- ¢ hybrides obtenues sont sélectionnées par un culture un milieu HAT = séparer les ¢ myélomes qui ne contient pas l’IG pcq la fusion n’a pas réussi
- ds chaque puit => division clonale => 1 hybridome différent par puit => ¢ vont croitre et se diviser ds son puit
- hybridome va sécréter l’Ig d’intérêt => prélevement d’aliguot d’IG
- Test de ces IG vs l’AG de départ (ELISA, FACS)
mort par sénéscence des plasmocytes (capacité limite de réplication)
problématique : taux de succès de fusio est plutôt faible et varie selon le protocle utilisé
Particularités ¢myélomateuses diapo 88 (caractéristiques x3 de plasmocytes et myléomes et hybridomes)
- ¢ myélo => produisent PAS d’AC => immortelles
- perte de l’enzyme HGPRT ( impliquée ds la synthèse des NTs) => surtout dans la voie de sauvetage (par opposition à la voie de novo)
plasm:
- mort par sénescence
- produisent IgG
- utilisent voie de novo + sauvetage
myélomes :
- immortelles,
- produisent pas Igg
- Voie novo slm
hybridomes :
- immortelles
- Produisent Igg
- voies novo et sauvetage
Particularités
milieu HAT
- présence de composés chimiques (aminoptérine):
- bloquant la synthèse de novo des nucléotides = > oblige les ¢à utiliser la voie de sauvetage
- hybridomes qui ont réussi à fusionner => bloquant la synthèse de novo des NTs => peuvent passer par la voie de sauvetage DES PLASMIDES (AU LIEU D’UTILISER LEUR PROPRE VOIE DE SAUVETAGE, ILS UTILISENT LA VOIE DE SAUETAGE DES PLASMIDES)
- ¢ tumorales n-fusionnées => pas survivre pcq pas capable de former des NTs (absence de HGPRT)
- Production AC monoclonaux chimériques ( ACs recombinants)
principe
problématique ?
-diminuer l’Immunogénicité des ACs monoclonaux de souris.
-fusion des régions variables de l’AC souris ak régions cstes d’un AC humain
=> conserve sa sélectivité de fixation tout en ressemblant à un AC humain naturel
Probl: AC pas entière humanisé car il garde des séquences d’A.A de la protéine de souris
- Production AC monoclonaux chimériques ( ACs recombinants)
mécanisme
- Injection TNF ds la souris
- qqs semaines = > isoler les hybridomes qui produit de l’AC qui réagit contre TNF. Dans cet hybridome, présence de l’ARNm pr chaine H et L pr neutraliser TNF => on vaisoler l’ARNm de cet hybridome
- Design d’amorces qui permettent d’isoler à partir des ¢b humaines/plasmocytes => RTPCR pr aller chercher les parties cstes de la CL et CH
VS
DEsign d’amorce et RTPCR pr aller chercher les parties variables chez la souris - Recombiner ds des vecteurs d’expression (C+V) => formation du chimère ds un vecteur d’Expression => E.Coli
- Transfecter ak une ¢myélome
- Production AC monoclonaux #chimériques ( ACs recombinants)
Détails dans la section de sousclonage
-partie variable => sous cloner en aval du promoteur (pcq c’est lui qui vient en premier)
=> mm chose pr la partie csste
- Production AC monoclonaux humanisés (ACs recombinants) :
concept
- Juste les CDR sont murins
- tout la section humain => fragment amplifié par PCR
- Production AC monoclonaux humanisés (ACs recombinants):
mécanisme
- Lecture des séq pr faire un design d’amorces pr produire les CDR (aussi tenir compte des sites de restrictions à insérer)
- séquençage des ARNm des hybridomes
- Production AC monoclonaux humains
problématiques (3)
- cx humains sont instables lors de la formation de l’hybridome
- pas de lignées humaines de myélome capables de remplacer la lignée de myélome de souris
- considération éthique : injection d’un AG ds humain = > pas trop nice
Xenosouris : mécanisme
- machinerie de production d’ACs de souris a été inactivée
- Tous les locus ig humains (CL et CH) sont intégrés ds le génome de souris
- YAC => sous-cloner délivrer de grandes molécules d’ADN étrangères => YACS contenant les gènes humains d’IG sont introduits ds des ¢ souches pr gén. de souris transgéniques
Faiblesses de la technique des hybridomes (3)
- faible taux de croissance des hybridomes
- ne se cultive pas à haute densité
- $$$$
Alternative (utiliser FAB)
petite prot pas besoin d’être glycosylée
=> preuve de concept que la partie FAB (seule qui est effcace ) fait l’affaire ds notre étude (on pourrait utiliser des bactéries au lieu des ¢myélomes)
=> but : créer une biblio de phages => permet d’isoler les FABS-
Création d’un bibliothèque d’AC
- obtention des ARNm des ¢ (lymphocytes des plasmocytes) de souris immunisées par ecoli
- RT PCR => amplifier les chaines légeres et lourdes ds 2 tubes différents => ADNC
- Bibliothèque ; combinaison de chaines lourdes vs chaines légères aléatoirement => formation de plusieurs couples
- Chaque phage contient une paire aléatoire => infection par e.coli de chaque couple
- observation de l’Expression des anticorps des ¢infectées
- Si sécrétion de FAB => destruction de E.coli (présence de lyse et d’enzmes et de prots) sur le papier filtre
- papier filtre => ajout d’antigène pr voir où est la séquence pr produire le meilleur fab pr résister contre l’AG
- retourne sur le pétri et voir où on produit le meilleur fab
4 systèmes de purification :
chromatographie. ..
- d’affinité
- d’échange d’ions
- d’exclusion
- de partages
Principe d’immunoprécipitation
purification de petites qts => purifier notre prot. recombinante des autres entitées biologies
- AC va réagir ak la prot (complexe lour + bille d’Agarose qui a une haute affinité pr la partie FC) => précipitation de cet immunocomplexe( culot de billes de sucre)
immunoprécipitation par colonne
-bille d’agarose sur colonne => lie partie FC de AC => on verse les extraits ¢laires => protéine voulue reste collée => le reste part => laver pour récolter la protéine
Pas d’existence d’AC pr cette prot?
option1
Ajout d’un TAG (amino ou carboxy terminal)
=> création d’AMORCE mettre une séquence pr coder un polypeptide (tag) qui va reconnaitre FC de l’AC
ensuite vient le site de reconnaissance Des EDR
Pas d’existence d’AC pr cette prot?
option2 : support solide
prots ak très haute affinité ak partie FC des immunoglobulines ( prot. A (staph aureus) ou G(enterococcqes) ou les 2 => permet de lier les IG
Étiquette FLAG
Peptide connu qui est capable de lier des AC FLAG avec un couplage possible avec des billes (billes + FLAG AC)
- ajout de 24 bases `à l’Amorce qui va encore pour ce peptide (étiquette)
- lavage des contaminants
autre existence de tags ?
ha, flag, myc, v5
Purification des ACs monoclonaux (penser à quoi?)
-type d’IG (quelle affinité avec quelle prot ? A, G?)
