Temas 2-3. Enzimas de restricción

Question 1

¿Cuál es a función de la ligasa de DNA?

Answer 1

Unir dos moléculas diferentes de DNA, pero también circularizar moléculas de DNA lineal

Question 2

¿Cuál es la función de la fosfatasa alcalina?

Answer 2

Eliminar los grupos fosfato en extremos 5’ del DNA dejando grupos OH

Question 3

¿Cuál es la función de la quinasa de polinucleótidos?

Answer 3

Añadir grupos fosfato a la secuencia de DNA en extremos 5’, al contrario que la fosfatasa alcalina, lo cual sirve para marcar una molécula concreta mediante fosfato radiactivo por ejemplo

Question 4

¿Qué diferencia hay entre las endonucleasas y las exonucleasas?

Answer 4

Las endonucleasas rompen enlaces fosfodiéster de los ácidos nucleicos mediante cortes internos, las exonucleasas rompen estos enlaces desde los extremos de la secuencia. Unas actúan en sentido 5’–>3’ y otras en el sentido contrario

Question 5

¿Qué es la polimerasa Taq?

Answer 5

Es una enzima que se usa para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Question 6

¿Para qué nos sirve el fragmento de Klenow de la polimerasa I?

Answer 6

Para polimerizar una molécula de DNA a partir del extremo 3’ OH

Question 7

¿Qué hace la transferasa terminal?

Answer 7

A partir del extremo 3’OH de una cadena añade nucleótidos sin la necesidad de un molde.

Question 8

¿Cuál es el problema de las nucleasas inespecíficas?

Answer 8

Que cortan la secuencia de DNA por cualquier punto y dan lugar a la degradación total de la molécula ya que atacan todos sus enlaces fosfodiéster

Question 9

¿Qué diferencia hay entre las nucleasas inespecífica y las enzimas de restricción?

Answer 9

Las enzimas de restrición, aunque también son nucleasas, reconocen una secuencia específica y rompen ese enlace concreto. Una molécula de DNA tratada con una enzima de restricción va a dar lugar siempre el mismo número de fragmentos y con el mismo tamaño

Question 10

¿Cómo son las enzimas de restricción de tipo I y III?

Answer 10

Son muy grandes (tienen muchas subunidades) y son bifuncionales (tienen actividad endonucleasa y metilasa). La actividad metilasa tendrá su mayor eficacia sobre moléculas de DNA semi- o hemi-metilado (es decir, generadas por la replicación de un DNA metilado), por lo que será el sustrato mejor reconocido para colocarle el grupo metilo en la cadena complementaria. La actividad endonucleasa actúa cuando el DNA no está metilado

Question 11

¿Cuál es el problema de las tipo I y III?

Answer 11

Que cortan a una distancia variable del sitio reconocido y por lo tanto no tienen mucha utilidad

Question 12

¿Qué actividad presenta las de tipo II?

Answer 12

Solo tienen actividad endonucleasa y son más pequeñas que las de otros tipos.

Question 13

¿Qué ventaja tienen las de tipo II?

Answer 13

Siempre cortan en el mismo punto (en el mismo sitio de reconocimiento o a una distancia corta y fija de éste), por lo que sirven para obtener siempre el mismo tipo de fragmentos al cortar un DNA

Question 14

¿Qué estructura activa tienen las enzimas de restricción?

Answer 14

Homodímeros, dos moléculas idénticas, ya que las secuencias de reconocimiento son normalmente secuencias palindrómicas (se leen igual en las dos direcciones y presentan un eje de simetría en la región central)

Question 15

¿Cuál es la longitud de secuencia promedio reconocida por las enzimas de restricción?

Answer 15

De 4 a 8 pb

Question 16

Si queremos obtener muchas secuencias pequeñas, ¿qué enzimas usaremos?

Answer 16

Enzimas que reconozcan secuencias de 4 pb

Question 17

Si queremos obtener fragmentos de secuencia mas grandes, ¿cuál usaremos?

Answer 17

Enzimas que reconozcan 8 pb, ya que será menos probable que exista dicha secuencia y habrá menos sitios de corte.

Question 18

Para trabajos rutinarios de clonación, ¿qué enzimas usaremos?

Answer 18

Enzimas que reconozcan 6 pb

Question 19

¿Qué reconoce la gran mayoría de estas enzimas?

Answer 19

Secuencias palindrómicas. Los dos monómeros van a cortar las cadenas en la misma posición

Question 20

¿Cómo puede ser la secuencia reconocida?

Answer 20

Continua o discontinua

Question 21

¿En qué caso de enzima de restricción el sitio de reconocimiento no es palindrómica?

Answer 21

Fok1

Question 22

¿Dónde suele ocurrir el corte de la secuencia de DNA?

Answer 22

Dentro de la secuencia de reconocimiento, pero también puede ocurrir fuera a una distancia determinada. Por ejemplo, Fok1 corta fuera a 9 nt en 5’ y 13 nt en 3’

Question 23

¿Qué necesitamos para formar una molécula de DNA recombinante?

Answer 23

Enzimas de restricción, y la ligasa (que es la única capaz de realizar enlaces fosfodiéster, aparte de la polimerasa)

Question 24

¿Por qué es importante la ligasa?

Answer 24

Porque repara las roturas que ocurren en el DNA con cierta frecuencia (detecta esas roturas y sella el enlace)

Question 25

¿Qué más puede hacer la ligasa?

Answer 25

Puede unir dos moléculas de DNA in vitro siempre que ambas estén lo suficientemente cerca una de la otra

Question 26

¿Cómo se la eficacia con la que la ligasa une fragmentos de DNA con extremos romos?

Answer 26

Es muy baja, ya que ambos fragmentos tienen que estar muy cerca para que actúe la ligasa

Question 27

¿Por qué la eficacia de unión es mayor en extremos cohesivos?

Answer 27

Por la mayor afinidad entre los fragmentos, que les permite acercarse y aparearse transitoriamente, tras lo cual la ligasa cerrará el hueco entre ellos. Lo que hacen las restrictasas que dejan extremos cohesivos es aumentar la posibilidad de que se acerquen

Question 28

¿Cómo podemos aumentar la posibilidad de unión con extremos romos?

Answer 28

Añadiendo a los extremos de esas moléculas pequeños fragmentos de DNA de doble cadena que contengan sitios de corte para enzimas que dejan extremos cohesivos (Ligadores o linkers)

Para ello, ponemos una molécula con extremos romos en presencia de una gran cantidad de linkers (hay que saturar la preparación para que los linkers se unan a nuestra molécula). La ligasa colocará esas secuencias o linkers en los extremos de cada fragmento y, tras ello, usaremos las enzimas de restricción necesarias para cortar la secuencia de los linkers y dejar extremos cohesivos

Una vez hecha esta manipulación, podremos cortar los fragmentos con esa misma enzima que nos permitirá clonar con más facilidad los fragmentos e introducirlos en un vector

Question 29

¿Cuáles son los dos pasos de clonación de genes?

Answer 29

1. Construcción in vitro de la molécula de DNA recombinante usando enzimas de restricción y la ligasa para obtener la secuencia de interés insertada en el plásmido
2. Introducir ese DNA en un huésped para que se replique y obtener miles de copias, esto se conoce como clonación in vivo (amplificación)

Question 30

¿Cuál es el objetivo de la terapia génica y cómo se puede llevar a cabo?

Answer 30

Trata de sustituir el gen enfermo por la versión silvestre, se puede llevar a cabo mediante recombinación homóloga

Question 31

¿Qué diferencia hay en eucariotas y procariotas respecto a la recombinación homóloga?

Answer 31

En procariotas (como E.coli) o en eucariotas sencillos, la recombinación homóloga es muy eficaz y se puede sustituir fácilmente l versión mutante de un gen por la silvestre. Pero no así en células humanas

Question 32

¿Cuál es la forma más eficaz de recombinación homóloga en células humanas?

Answer 32

Es provocar cortes específicas en las secuencias donde queramos que éste e inserte.

Question 33

¿Qué dos mecanismos de reparación existen tras una rotura de doble cadena?

Answer 33

La primera opción ocurre cuando no hay secuencias homólogas intactas que puedan servir como molde para reparar esa rotura: reparación por unión de extremos no homólogos. Participan proteínas que se unen a los extremos rotos del DNA y los vuelven a ensamblar, en este proceso se producen mutaciones porque tienen lugar pequeñas inserciones o deleciones en la secuencia. Se trata del mecanismo más eficaz cuando no hay DNA homólogo

La 2ª opción tiene que ver con la presencia de secuencias con homología en ese zona: recombinación homóloga

Este proceso requiere que haya un DNA con secuencias homólogas que se toma como molde para reparar esa rotura. Una exonucleasa degrada cada una de las cadenas en dirección 5’ -> 3’ haciendo la mella más grande, el DNA con secuencias homólogas invade la zona donde se genera esa mella y los huecos serán rellenados usando esa secuencia homóloga como molde. Tras esto se deshace la interacción y se separan las moléculas, dejando la molécula que estaba rota con ese tramo sustituido por la secuencia donante. De este modo si queremos introducir una región silvestre de un gen, lo que hacemos es romper el gen que tiene la mutación por esa región, generando un hueco en la cadena y, al introducir al mismo tiempo la secuencia silvestre del gen, sustituirá a la secuencia mutante

Question 34

¿Qué peculiaridad presenta Fok1?

Answer 34

Que corta fuera de la secuencia de reconocimiento a una distancia fija

Question 35

¿Qué ocurre en ese tipo de enzimas (Fok1)?

Answer 35

El dominio de unión al DNA está separado del dominio de corte por un tramo de aas muy largo, de tal manera que los dominios se encuentran separados a nivel estructural. La mayoría de las restrictasas no tiene esa región conectora y presentan los dos dominios mucho más juntos

Question 36

¿Cuál es la idea con todo esto?

Answer 36

Que, manteniendo el dominio nucleasa (de corte), unirlo a otro dominio distinto que reconozca otra secuencia de DNA diferente, Queremos crear así una restrictasa artificial que reconozca la secuencia que nos interesa, y para ello hay que conocer los aas esenciales del dominio de unión al DNA que queremos usar. De esta forma, podemos cortar en sitios concretos del DNA, lo que es esencial para manipulaciones que se hacen en organismos superiores a la hora de la obtención de transgénicos o la terapia génica

Question 37

¿Cuáles son los dos dominios de unión al DNA que se usan en Ingeniería Genética?

Answer 37

Dedos de Zinc y TALEN

Question 38

¿Qué son los ZFN?

Answer 38

Son estructuras de 30 aas con una región de hélice alfa que reconoce una secuencia específica de nucleótidos en el DNA, produciéndose una interacción directa aa-nt

Question 39

¿Cómo se da el reconocimiento en los ZFN?

Answer 39

Hay 3 residuos de la hélice alfa que reconocen 3 nt de una cadena y 1 residuo que reconoce otro nt de la cadena complementaria. Los residuos en posiciones -1, 3 y 6 reconocen un triplete concreto en la secuencia de nt, y el de la posición 2 reconoce el nt siguiente en la cadena complementaria. Se pueden reconocer unos nt concretos en la secuencia de DNA

Question 40

¿Cómo es la relación entre la hélice y los nt?

Answer 40

No es perfecta, ya que también depende del resto de aas que forman esa hélice alfa, así que hay millones de posibilidades

Question 41

¿Qué son las TALEN?

Answer 41

Son nucleasas específicas formadas por el dominio nucleasa de Fok1 y el dominio de unión al DNA de las proteínas TALE, producidas por Xanthomonas

Question 42

¿Estructura de TALEN?

Answer 42

El dominio de unión al DNA está constituido por n repeticiones de unos 30 aas para reconocer una secuencia de n nucleótidos consecutivos. Las repeticiones son idénticas excepto en los aas de las posiciones 12 y 13, que les dan la especificidad para interaccionar con los nucleótidos. Cada repetición reconoce un nt dependiendo de los aas en esas dos posiciones. Si el dominio de unión tiene 15 repeticiones, reconocerá una secuencia de 15 nt. Hay un alto grado de preferencia entre aas presentes en esas posiciones con cuál de los 4 nt es reconocido

Question 43

¿Comparación entre ZFN y TALEN?

Answer 43

Los dos tienen el dominio de corte de la nucleasa Fok1. Los dedos de cinc, cada uno reconoce un triplete y dependiendo de la longitud de la secuencia tendremos más o menos dedos de cinc. La TALE, cada repetición reconoce un solo nt, y dependiendo de la longitud de la secuencia tendremos tantas repeticiones. Los ZFN son más usadas que las TALEN pero son más difíciles de diseñar