Tema 8. Aplicaciones de la PCR en clonación, diagnóstico y análisis de polimorfismos Flashcards
¿Qué es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y cuáles son sus componentes?
Es una técnica que permite generar múltiples copias de un tramo concreto de DNA. Los componentes son:
a) DNA molde que contiene el tramo que queremos amplificar
b) Utilizamos cebadores que dirigimos a regiones específicas para que tengan lugar múltiples sucesos de replicación. Son oligonucleótidos de cadena sencilla. Su diseño es muy importante para amplificar únicamente la región que queremos, por lo que normalmente tenemos que analizar una región amplia adyacente a la zona que queremos amplificar
c) Polimerasa de DNA (termoestable), para poder someterla a altas temperaturas y que no se desnaturalice
d) Desoxinucleótidos trifosfatados (dTTP, dATP, dCTP y dGTP)
e) Iones (Mg), sustancias tamponadoras y coadyuvantes de la reacción (BSA, DMSO), que van a facilitar la interacción cebador-molde y la reacción de polimerización. El DMSO ayuda a amplificar las zonas ricas en G+C, haciendo que las cadenas sean más flexibles y la polimerasa tenga más accesibilidad a la cadena molde
¿Cómo es el proceso de la reacción de PCR en un termociclador?
Este proceso se lleva a cabo en un termociclador, que sometemos a ciclos con cambios de temperatura:
1) Desnaturalización: ponemos el DNA a 95ºC unos 5 min para que se separen las dos cadenas de DNA
2) Renaturalización. Bajamos la temperatura para permitir la hibridación de los cebadores con la cadena molde. Esta temperatura va a ser variable y depende de la secuencia específica de los cebadores que usemos: la temperatura óptima de hibridación de cada grupo de cebadores viene dada por el % G+C de cada uno. Si la T es muy baja, el apareamiento cebador-molde no es muy restrictivo, y habrá gran probabilidad de que se hibriden con otra parte de la secuencia. Debemos usar temperaturas cercanas a 60ºC
3) Polimerización: volvemos a subir la temperatura hasta unos 72ºC para que la polimerasa comience a sintetizar la cadena complementaria a partir del cebador
Después del 1º ciclo de amplificación, ninguna de las dos moléculas hijas resultantes va a tener el tamaño del fragmento que queremos obtener. Cuando se realiza el 2º ciclo repitiendo los mismos pasos, ninguna de las 4 moléculas tendrá tampoco el tamaño final deseado, pero una de las cadenas de dos de ellas sí que presente la longitud final deseada. No es hasta el 3º ciclo cuando 2 de las 8 moléculas generadas tienen el tamaño final deseado. Por tanto, una vez que pasamos este tercer ciclo, la cantidad de moléculas con el tamaño no deseado se mantendrá más o menos fija, mientras crece de forma exponencial la proporción de moléculas que presentan el tamaño final deseado
¿Qué parámetros varían en la PCR?
a) La temperatura de hibridación. Nos va a definir la especificidad, con una T alta se va a amplificar solamente el fragmento deseado, mientras que a una T baja se permiten amplificaciones inespecíficas. Este parámetro va a depender de la longitud del cebador y su contenido en G+C; si se tiene que aparear con una región rica en A+T (que a T elevadas no hibridaría) podemos solucionar esto haciendo cebadores más largos y así aumentar su especificidad
b) Tiempo de elongación: depende de la longitud del fragmento a amplificar. Cada polimerasa tiene su propio tiempo de elongación, no es conveniente dejar mucho más tiempo del requerido porque pueden aparecer productos inespecíficos
c) Número de ciclos: depende de la cantidad de DNA amplificado necesaria y de la cantidad de DNA molde de partida
¿Qué polimerasas se usan en la PCR?
a) Taq (de Thermus aquaticus)
- Es muy buena en cuanto a la alta procesividad (1 kb/min)
- Pero no presenta actividad exonucleasa correctora de errores, por lo que si el fragmento es mu grande tenemos la seguridad de que se va a amplificar entero pero presentará mutaciones probablemente
b) Pfu (Pyrococcus furiosus)
- Actividad correctora (fidelidad aproximadamente 10 veces superior a Taq)
- Menos procesiva que la Taq (0,5 kb/min), por lo que si son fragmentos grandes es difícil obtener mucha cantidad de ese fragmento
c) KOD (Thermus kodakaraensis)
- Presenta alta procesividad (4 kb/min o 1 kb/15 s)
- Actividad exonucleasa 3’->5’ (fidelidad superior a Pfu)
Hay diversidad variaciones aún así:
d) Long-range DNA polimerasas (hasta 20 kb/min)
- Hot-start DNA polimerasas (se activan en el primer paso de desnaturalización). Estas polimerasas hot-start como se activan cuando hay un choque térmico de temperatura, no es necesario trabajar con hielo, que sí se usaba con el resto de polimerasas para que no empiecen a trabajar antes de meterlas en el termociclador
¿Cómo se usa la PCR en la clonación de DNA en vectores?
En los extremos de los cebadores podemos colocar lo que queramos: promotor, sitio de unión a ribosoma, codón de iniciación, codón de stop… por lo tanto, lo que amplifiquemos de aquí lo vamos a poder expresar directamente. A ese fragmento amplificado le podemos añadir una RNA polimerasa y nos producirá los mRNA correspondientes (por expresión in vitro)
¿Cómo se usa la PCR en la determinación del sexo en embriones?
Se puede determinar el sexo de los embriones, extrayendo el material genético de una célula y amplificamos por PCR un tramo específico del cromosoma Y, si hay amplificación es sexo masculino y si no hay es femenino
¿Cómo se usa la PCR en el diagnóstico molecular directo en enfermedades monogénicas humanas?
Las enfermedades monogénicas humanas se producen cuando la mutación de un solo gen lo hacen que sea no funcional. El diagnóstico se hace en el gen que puede estar afectado. Estas enfermedades pueden ser autosómicas recesivas (fibrosis quística), dominantes (Huntington) o ligadas al cromosoma X (Distrofia muscular de Duchenne y de Becker)
¿Cómo es la PCR en el diagnóstico molecular directo en la enfermedad de Hungtinton?
Es una enfermedad autosómica dominante, si un alelo está afectado se produce enfermedad. Se debe a que en el gen de la hungtintina hay un trinucleótido CAG que se repite en tándem. Ese triucleótido cuando se traduce da lugar a Gln y cuando hay muchas repeticiones seguidas (poli-Gln) se agregan y crean cuerpos de inclusión. Al cabo del tiempo se van acumulando y se generan los problemas de la enfermedad
Para determinar si tiene un alelo afectado se usa la PCR. Se diseñan cebadores en las zonas adyacentes a las repeticiones. Cuando se haga la PCR, dependiendo de las repeticiones que tengan será un producto más pequeño o grande. Esta diferencia de tamaño se distingue en un gel de agarosa. Si tiene más de 36 repeticiones en uno de sus alelos tendrá la enfermedad, lo que no sabemos es a qué edad manifestará la enfermedad
¿Cómo es la PCR en el diagnóstico molecular directo de enfermedades monogénicas con mutaciones en un solo nucleótido?
La fibrosis quística es una enfermedad autosómica recesiva que conlleva la formación y acumulación de mucosidad espesa en pulmones, páncreas, intestinos e hígado
La fibrosis quística aparece cuando un individuo posee sus dos alelos mutados para el gen CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator). Muchas de estas mutaciones son mutaciones en un solo nucleótido. Para saber la probabilidad de que tenga la enfermedad el hijo de unos padres portadores se hace un diagnóstico molecular directo mediante PCR específica de alelo y se implanta un embrión sano en el útero
¿Cómo se detecta mutaciones puntuales por PCR con oligos específicos de alelo (ASO, Allele Specific Oligonucleotide)?
Podemos seguir 2 estrategias distintas:
1) Se diseñan cebadores específicos para la mutación
a) Oligo común que hibrida en los dos alelos (sano y enfermo)
2) Dos oligos que se diferencian en el último nt (extremo 3’), uno mutado y otro normal. Si hibrida el mutado se sabe que el alelo está también mutado
El alelo mutado hibrida, pero el último nt no, y eso es un problema para la polimerasa, por lo que no amplifica. Si el último nt en extremo 3’ no hibrida la polimerasa no puede amplificar aunque el resto del cebador sí hibride
Realizamos 2 PCR, en un tubo los cebadores normal y común y en el otro el mutado y el común. Cuando hagamos electroforesis en el gen de agarosa, se ven 3 posibilidades:
- Homocigótico normal: producto en el tubo 1
- Heterocigótico: producto en los 2 tubos (tiene los 2 alelos)
- Homocigótico mutante: producto en el tubo 2, solo hay alelos mutantes
2) Lo usamos para detectar mutaciones puntuales. Para ello, diseñamos 2 cebadores comunes que hibriden uno en cada cadena y hago una PCR, y sea el alelo C o T, obtendré un fragmento del mismo tamaño (600 pb). Ahora creo dos cebadores específicos para el alelo C y T, si el cebador C hibrida se amplifica y forma un producto de 300 pb, además del de 600 pb común, indicando que tengo el alelo C en el genoma. Si tengo el alelo T el producto de 300 pb no se formará porque el nt del extremo 3’ del cebador C no hibrida y no se puede amplificar.
Después añado también un cebador para el alelo T que dé un producto de un tamaño distinto como 400 pb, si hay alelo T se formarán 2 productos de 600 pb y 400 pb. En el caso de que sea heterocigótico (alelo T y C) se formarán los 3 productos de 600 pb, 400 pb y 300 pb
¿Cómo se utiliza la PCR en el análisis de enfermedades genéticas causadas por grandes deleciones?
Hay 2 enfermedades importantes causadas por la presencia de grandes deleciones:
a) Distrofia muscular de Duchenne (DMD); Afecta a 1 de cada 3.500 varones, siendo recesiva ligada al cromosoma X. Entre sus síntomas destacan degeneración muscular antes de los 5 años, parálisis a los 11, muerte antes de los 25
b) Distrofia muscular de Becker (BMD): afecta a 1 de cada 8.000 varones, es recesiva ligada al cromosoma X y de progresión más lenta
Ambas enfermedades son causa de mutaciones en el gen de la distrofina, componente esencial del músculo esquelético. En la célula muscular la distrofina conecta el citoesqueleto de actina con la matriz extracelular a través de la membrana citoplasmática
Los individuos que padecen la enfermedad tienen deleciones de distinto tamaño y causan el mismo fenotipo severo (DMD). En la BMD también es producida por deleciones, pero no tienen un fenotipo tan grave, esto se debe a que en el caso anterior, las deleciones además producen desfases siendo más grave
Diseñamos cebadores que hibriden en la zona de los intrones que está alrededor de cada exón. Si tenemos producto de PCR para cada exón es que está, si no hay es que el exón no está y ha habido deleción. De esta manera se puede determinar qué exones tienen deleciones
¿Cómo podemos hacer uso de la PCR en el análisis de polimorfismos moleculares?
Un locus polimórfico es aquel para el que existen dos o más alelos, siendo la frecuencia del alelo más común menor del 95%
Los SNPs (polimorfismos en un solo nucleótido) son cambios de un solo nt; por ejemplo, en una determinada región cromosómica de unos individuos hay un par A-T en una posición mientras que en otros individuos hay un par G-C. Estos polimorfismos se suelen encontrar en regiones no codificantes del genoma y se pueden usar como marcadores moleculares
Los VNTRs son minisatélites y los STRs microsatélites. Ambos son secuencias cortas repetidas en tándem un número variable de veces. Si la unidad que se repite es menor de 10 se les considera microsatélites y si es de más de 10 minisatélites
Las pruebas de DNA se van a basar en estos polimorfismos, ya que el genoma humano se diferencia solo en un 0,1%, el resto es idéntico
¿Qué uso le podemos dar a la PCR en el análisis de polimorfismos moleculares del tipo RFLP?
Los SNPs que afectan a sitios de corte de enzimas de restricción se denominan RFLPs (Polimorfismos en la longitud de Fragmentos de Restricción)
Los individuos pueden presentar el alelo 1 con el par A-T en esa posición que permite el corte por la enzima EcoRI, o pueden presentar el alelo 2 donde se cambia por el par G-C y ya la enzima no reconoce ese sitio. Para detectar si los individuos son homocigóticos o heterocigóticos vamos a aislar su DNA y mediante PCR con cebadores que reconozcan ese sitio polimórfico, vamos a amplificar ese fragmento
Una vez amplificados, cortamos con la restrictasa EcoRI y si el individuo tiene el alelo 1 el fragmento se cortará obteniendo 2 con un tamaño más pequeño, por el contrario el fragmento no presenta ese punto de corte obtendremos el mismo tamaño después de la digestión, que corresponde al alelo 2. Hay 3 posibles casos:
a) Si aparecen dos bandas de 1 y 0,4 kb será homocigótico del alelo 1
b) Si hay 3 bandas de 1,4, 1 y 0,4 kb será heterocigótico
c) Si solo hay 1 banda de 1,4 kb será homocigótico del alelo 2
¿Cómo podemos hacer uso de la PCR en el análisis de polimorfismos moleculares de tipo STR o VNTR?
En este caso, la diferencia entre el genotipo de los individuos va a depender de nº de repeticiones presentes en un locus variable. Hay muchos alelos distintos en la población dependiendo de las repeticiones que haya en una secuencia concreta. Tenemos un STR (repetición corta). Para diferenciar los distintos alelos se hacen unos cebadores que hibriden con las zonas adyacentes a la STR. Estos oligos hibridarán en todos los alelos porque son zonas comunes. Cuando se haga la PCR, obtendremos productos de tamaño variable según las repeticiones que posee el alelo
¿Cómo usamos la PCR en el análisis simultáneo de varios polimorfismos moleculares del tipo STR o VNTR: PCR múltiple?
Si realizamos una PCR múltiple, es decir, analizamos varios loci polimórficos situados en varios cromosomas, tendremos la huella genética de ese individuo. Una aplicación sería comparando una muestra de crimen con los individuos sospechosos para averiguar de quién es
A la misma vez, podemos hacer PCR para otras VNTR para aumentar la eficacia llegando a hacer una huella molecular del individuo (PCR múltiple). Para ello podemos diseñar cebadores específicos para cada una de esas regiones. La fiabilidad del resultado depende del número de VNTR que analicemos
