Tema 6. Vectores eucarióticos Flashcards
¿Qué es el cromosoma artificial de levadura (YAC?
Las levaduras tienen su material genético repartido en cromosomas lineales con centrómero y telómeros. Puedo usar un plásmido con un origen de replicación y marcador de E. coli pero que también contiene una secuencia centromérica, secuencias teloméricas, origen de replicación de levaduras y un marcador eucariótico que no será un antibiótico sino marcadores de auxotrofía
Las levaduras silvestres son protótrofas y tienen los genes necesarios para sintetizar los compuestos. En este caso, se crea una mutante auxótrofa para uracilo y triptófano, por lo que, si se lo quitamos del medio, no podrá crecer. Si yo a esa célula recipiente auxótrofa le incorporo mi vector con genes para uracilo y Trp, en caso de haberlo cogido sí podrán crecer y así puedo seleccionar
Utilizaremos levaduras mutantes en el gen Ade-2, implicado en el metabolismo de la adenina, dando lugar a colonias rojas. El gen SUP4 restaura el efecto de la mutación en ade-2 haciendo que las colonias sean blancas. El sitio de clonación será SnaB1 que está en medio del gen SPU4 pero no impide la formación de la proteína a menos que se haya introducido el inserto
Si corto con las enzimas SnaB1 y BamH1 se generan 3 fragmentos lineales, de los cuales me interesan los 2 más grandes. Estos 2 brazos están cortados con SnaB1, así que yo corto con esa misma enzima el DNA de interés para que se una en medio del gen SPU4. Si se une en un solo brazo se comprueba al tener 2 marcadores, uno de Trp y otro de Uracilo, ya que, si no podemos ninguno de los 2 compuestos solo crecerán los que llevan los 2 brazos
En caso de autoligación, la célula será blanca porque el gen SUP4 está funcional mientras que si se introdujo el inserto serán rojas, ya que la proteína SUP4 no podrá revertir la mutación
¿Cómo funcionan los baculovirus como vectores de expresión en eucariotas?
Si una proteína requiere alguna modificación concreta se suelen usar vectores para expresarla en células eucarióticas. Actualmente se usan células cultivadas de insectos usando Baculovirus como vector, ya que estas proteínas eucarióticas se deben modificar post-traduccionalmente y en procariotas esto no ocurre, por ello se usan baculovirus. Este virus infecta a invertebrados (lepidópteros), tiene una cápside cilíndrica, dsDNA y envoltura
En la fase tardía forma unas estructuras donde se rodea de un cuerpo de inclusión proteico, formado por poliedrina. Lo hacen para resistir a condiciones adversas. Esta poliedrina es muy abundante y el 25% del RNA que se producen en la célula eucariota va a dar lugar a la poliedrina. Por tanto, el gen de la poliedrina va a tener un promotor muy fuerte que puede ser usado en ingeniería genética, ya que solamente se expresa al final de la infección y da lugar a niveles de expresión muy elevados
La estrategia sería eliminar el gen de la polimerasa que no es esencial para la replicación del virus e introducir en su lugar el gen de interés. La expresión será muy abundante en la fase tardía de infección
Las ventajas del uso de baculovirus son:
a) Seguro (rango de huéspedes muy estrecho, no infectan a mamíferos ni a plantas)
b) Líneas celulares aptas para cultivos en suspensión (biorreactores)
c) Altos niveles de expresión de la proteína recombinante (hasta 500 mg/L)
d) Plegamiento y modificaciones post-traduccionales similares a las de mamífero (muy usado para glucoproteínas)
El plásmido contiene un origen de replicación para E. coli, gen de resistencia a ampicilina y otro a gentamicina, el Pph es el promotor de la poliedrina y aguas abajo está el sitio de clonación múltiple (SV40 pA) con varias secuencias reconocidas por las enzimas de restricción. Tiene también un sistema de poliadenilación y el Tn7L que es un fragmento de transposón.
¿Cómo se lleva a cabo la transposición del gen de interés en el bácmido (baculovirus)?
Se va a transformar un E. coli especial que tiene un bácmido (genoma de baculovirus modificado). Además, tiene una región que permite su replicación, y segregación para que el plásmido se perpetúe, también tiene un gen de resistencia a kanamicina y el gen LacZ que posee una región llamada miniattTn7 donde se va a permitir que esa zona transponible del plásmido entre Tn7L y Tn7R se introduzca allí específica. Posee un plásmido auxiliar con el gen de la transposasa que posibilita la incorporación de ese fragmento al locus mini-attTn7
De esta manera he generado un bácmido recombinante con mi gen de interés. Si yo introduzco esa región con mi gen de interés en el sitio transponible, se interrumpe el gen lacZ, y las colonias se verán blancas, mientras que si no lo han incorporado se verán azules, por lo que no me interesan estas últimas. La kanamicina sirve para seleccionar los E. coli que han cogido el plásmido
El proceso en el laboratorio sería el siguiente:
Primeramente, siembro las células de insecto para después hacer una transfección con un reactivo que ayuda a que ese bácmido se introduzca dentro de las células. Tras 96 horas, tengo cultivos de las células de insecto infectadas por el baculovirus. Tras centrifugar, en el sobrenadante habrá muchos baculovirus con nuestro gen de interés. Si quiero expresar la proteína a gran escala infecto con este stock de virus a gran cantidad de células. Por último, se purifica la proteína
¿Cómo se pueden usar las células de mamífero como factorías de proteínas?
a) Por transfección transitoria, es decir, fácil de manipular y transfectar
- Células COS (de riñón de mono ver africano)
- Células BHK (riñón de hámster)
- Células HEK293 (riñón embrionario humano)
b) Transfección estable (difícil de manipular, pero se producen mayores cantidades de proteína)
- Células CHO (ovario de hámster chino)
- Células de mieloma de ratón
¿Qué secuencias podemos utilizar para mejorar la producción de proteínas de interés en células eucariotas?
Al gen de interés podemos añadirle ciertos elementos genéticos para aumentar la producción de la proteína:
a) K es una etiqueta que facilita la traducción de la proteína
b) S facilita la secreción
c) T es una etiqueta para la purificación
d) P es una secuencia reconocida por la proteasa para eliminar esa etiqueta
e) SC es el codón STOP
f) 5’ y 3’ UTR son secuencias que facilitan la estabilidad del mensajero
¿Cómo funciona un vector de expresión estándar para células de mamífero?
Lleva un origen y marcador de E. coli, ya que, la parte de introducir el gen el vector (corta y pega) es más fácil en procariotas. En el sitio de clonación múltiple introducimos el gen de interés, aguas arriba tenemos el promotor eucariótico y aguas abajo la secuencia de poliadenilación para crear la cola de poli-A en el mensajero y un terminador de la transcripción. Además, puede llevar un intrón que se debe eliminar y que facilita la producción de proteínas
Este vector, además de ser seleccionable en E. coli, debe tener un marcador seleccionable en eucariotas con su promotor, secuencia de poliadenilación y el terminador de la transcripción
En cuando al origen de replicación en eucariotas, se usan orígenes de replicación de virus animales para la replicación del vector, y por ello necesitan expresar en trans (en estas células hospedadoras) los componentes virales que llevan a cabo dicha replicación
¿Cómo funciona un vector para expresar subunidades proteicas?
Si queremos que una proteína se exprese más que la otra, se pone un promotor más fuerte para que produzca el doble de proteína y que el complejo esté equilibrado biológicamente, ya que contiene 2 monómeros de beta y uno de alfa
Si necesitamos la misma cantidad podemos controlarlo con el mismo promotor e introducir el IRES, una secuencia interna que determina u inicio de la traducción. Generamos u mRNA policistrónico que produce cantidades equimolares de las 2 proteínas
¿Cómo mejoramos genéticamente las células usadas en biorreactores?
Estas células pueden sufrir estrés por falta de oxígeno, nutrientes… Cuando esto ocurre provoca la expresión del factor p53 que activa genes implicados en la apoptosis y con ello la muerte celular. Para solucionar esto, se introduce el gen MDM2 que determina una ligasa de ubiquitina E3 que se une a p53 e inhibe su acción, por lo que no se expresarán los genes de la apoptosis y no habrá muerte celular
Hay vectores que no se replican sino que se integran mediante recombinación homóloga en el genoma de la célula. Es el caso del vector suicida que se integra o desaparece. Para ello, se le coloca un tramo de 1 kb aproximadamente, con una secuencia homóloga a un tramo del cromosoma para que se integre. Se introduce todo el plásmido, para ello se usa el sistema lox-Cre. 2 repeticiones directas se enfrentan y pueden recombinar haciendo que la parte de en medio se pierda. Esto se utiliza para eliminar algo que hayamos introducido previamente. Al vector le meto una región homóloga al sitio donde quiero integrarlo y selecciono las células con un gen marcador también integrado
Una vez que tengo las células seleccionadas, en algunos casos, interesa quitar el gen marcador, bien porque no queremos que tenga resistencia a antibiótico o porque queremos usar otro marcador. Usaríamos el sistema lox-Cre que tiene 2 secuencias directas que cuando se ponen en contacto y en presencia de recombinasa Cre producen recombinación y se elimina lo de en medio. Ahora estas células no son resistentes a ese marcador
El gen de la recombinasa está bajo un promotor inducible por IPTG, lacI (represor) se une al operador lacO y bloquea al promotor, por lo que no habrá recombinasa. IPTG secuestra a lacI y se expresa la recombinasa Cre, escindiendo lo de en medio
El vector tiene un replicón sensible a la temperatura, por lo que el plásmido se mantiene en la célula a 30ºC pero a 37ºC el replicón no es funcional y pierde el plásmido. Esto se hace porque puede haber una expresión basal aunque quitemos el IPTG y la recombinasa puede causar problemas cromosómicos
