Tema 5. Vectores procarióticos Flashcards
¿Cómo se obtienen los insertos de DNA?
En los experimentos de clonación, hay que elegir el material de partida según queramos obtener una genoteca o un clon específico
Cuando queremos obtener un clon específico (una molécula recombinante con una secuencia concreta), partimos ya de un fragmento clonado
- Podemos realizar una digestión con restrictasa de ese fragmento clonado para purificar la parte de la secuencia que nos interesa
- También podemos aislar esa parte de interés mediante PCR. Podemos partir directamente de un genoma completo si conocemos su localización
- Podemos obtener el cDNA y clonarlo directamente en un vector
Para obtener una genoteca (una colección de plásmidos que representen todos los fragmentos del organismo donante, a partir de ella se pueden identificar clones), partimos de todo el DNA del organismo en cuestión. Lo podemos fragmentar mediante restricción o métodos físicos como la sonicación (con ondas) y obtendremos una colección de fragmentos de todo el genoma, obteniendo así una colección de clones que en su conjunto representen todo el genoma del organismo (genoteca)
¿Qué son los vectores procarióticos de clonación de DNA?
Son moléculas de DNA que permiten el transporte, la replicación y ell almacenamiento de fragmentos de DNA de interés en una célula hospedadora determinada
Una vez decidido cómo aislar los insertos, tenemos que introducirlos en el vector adecuado. Los requisitos de un vector de clonación son los siguientes:
- Moléculas pequeñas, fáciles de manipular
- Replicación autónoma y fácil introducción en la célula hospedadora
- Puntos de corte únicos para una o varias enzimas de restricción
- Fácilmente seleccionables
- Fácil distinción entre vector no modificado y vector quimérico
¿Cómo funcionan los plásmidos como vectores de clonación?
Un plásmido debe tener un origen de replicación, un gen de resistencia a antibióticos y un sitio de clonación múltiple (SCM) o polyylinker (con sitios de corte únicos para varias enzimas de restricción)
En el caso de los plásmidos pUC8, su sitio de clonación múltiple es una región del gen lacZ, con puntos de corte para varias enzimas que solamente cortan en ese tramo. Dentro se sitúa el polylinker
Podemos cortar el vector con una enzima de restricción y hacemos la ligación in vitro entre el vector y el inserto
Para distinguir bacterias transformadas de otras que no hayan incorporado el plásmido, sembramos con ampicilina, de forma que solo crezcan aquellas que hayan incorporado el plásmido, ya que tiene un gen R
Para distinguir bacterias que hayan incorporado DNA recombinante de bacterias que tengan plásmidos autoligados, añadimos X-Gal al medio. Las bacterias que hayan incorporado el DNA recombinante tendrán el gen lacZ del plásmido interrumpido por el inserto y se verán colonias blancas. Solamente las colonias que tengan plásmidos autoligados tendrán actividad beta-galactosidasa, que les permite romper X-Gal en indol, un compuesto azul, por lo que las colonias serán azules
¿Cómo funciona el fago lambda como vector de DNA?
Los fagos son vehículos muy buenos para transportar material genético. Observamos en la placa de cultivo calvas o halos de lisis que son zonas donde no hay bacterias: el fago las ha infectado y se ha reproducido provocando su lisis, por lo que estas zonas están llenas de fagos.
El fago más utilizado para esto es el fago lambda, sus ventajas son que admite mayor tamaño de inserto y sabe introducir el DNA dentro de la célula, siendo más fácil que con los plásmidos, donde tenemos que forzar esa entrado haciendo que sean células competentes.
En el fago se va a empaquetar una molécula de DNA lineal que contiene genes implicados en la síntesis de la cabeza y tallo, otros implicados en la integración (ciclo lisogénico) y escisión, y otros implicado en la replicación y lisis. Además. tienen unos extremos protuberantes cos complementarios entre sí, por lo que cuando se mete en la célula se recirculariza por esos extremos
Los genes implicados en la integración y escisión del fago no son necesarios, porque no queremos que el fago entre en ciclo lisogénico, por tanto, los eliminamos mediante una enzima de restricción. Ahora digerimos el DNA de interés y mediante ligación los introducimos en ese espacio. El tamaño total de material genético que podemos introducir está limitado ya que debe tener el mismo tamaño que hemos quitado
El DNA foráneo tendrá que estar digerido con la misma enzima de restricción. Si yo quiero construir una genoteca, hago esto para muchos DNAs distintos. Puede ocurrir que haya una autoligación, ya que cortamos con la misma enzima
Para ello, puedo empaquetar los fagos in vitro si tengo las proteínas necesarias para introducir el DNA en la cabeza, ensamblaje… Estos pueden entrar en ciclo lítico, pero no en lisogénico. Una vez tengo la colección de fagos con los insertos, infecto E. coli y cada fago producirá un halo de lisis con un solo inserto
¿Cómo funcionan los cósmidos como vectores de clonación?
Los cósmidos son plásmidos que contienen las secuencias cos del fago lambda, su origen de replicación y un gen R
El cósmido se digiere con una enzima de restricción concreta al lado de la región Cos. Esto lo ponemos en contacto con el DNA genómico que lo digerimos con la misma enzima restricción, como son extremos cohesivos se generan concatámeros. Admite tamaños más grandes porque no necesito los genes e la cabeza, cola…
Como en los sistemas de empaquetamiento in vitro le proporcionamos las proteínas necesarias para el ensamblaje del DNA, podemos introducir un concatámero dentro de un fago. Las proteínas de empaquetamiento reconocen las secuencias cos, no el DNA entre ellas
La diferencia con los fagos lambda es que cuando este pseudofago infecte a la bacteria introduce dentro el DNA recombinante que únicamente contiene un fragmento de DNA unido al DNA del cósmido, flanqueados por extremos cos: no presenta genes del ciclo lítico y no funciona como un fago; el fragmento se circulariza y se replica dentro como un plásmido sin acabar con el hospedador, ya que tiene el origen de replicación del plásmido. Después selecciono estas colonias porque serán resistentes al antibiótico
¿Cómo funciona el crosomoma artificial bacteriano (BAC) como vector de clonación?
Estos pueden albergar gran cantidad de DNA y son usados para hacer genotecas genómicas. Los vectores BAC se basan en la transmisión sexual bacteriana. Las bacterias F+ pueden transferir información a las F- por un puente citoplasmático: les pasan un plásmido
Ese plásmido F es bastante grande, y puede transferir DNA del propio cromosoma bacteriano, por lo que es muy adecuado para introducir grandes cantidades de DNA en una bacteria. Este plásmido F tiene un gen de resistencia a antibiótico, el origen de replicación (oriS), otros elementos naturales de este plásmido como los genes repE, parA, parB, que son esenciales para la regulación del número de copias y la segregación (reparto de los plásmidos a las células hijas cuando se dividen). Además, se introduce un polylinker donde voy a poder ligar el inserto de interés que puede ser de hasta 300 kb
¿Qué es un vector de expresión bacteriano?
Para la superproducción de proteínas, se utilizan plásmidos (los fagos no podemos usarlos porque lisan y matan a las bacterias). Tiene su origen de replicación específico del huésped; un gen marcador para asegurarme de que todas las bacterias con las que trabajo poseen el plásmido, normalmente de resistencia a un antibiótico, y, por último, unos elementos que lo diferencian del vector de clonación: un sitio de clonación múltiple donde colocaremos el inserto rodeado de un promotor constitutivo o regulable que inicia la transcripción de un gen reconocido por las RNA polimerasas de E. coli, y por un terminador de la transcripción, que son secuencias palindrómicas que generan hibridaciones intracatenarias
En procariotas, a partir del DNA se transcribe a un mRNA que ahora se traduce del origen de la traducción a una proteína
En eucariotas hay 2 compartimentos: núcleo y citoplasma. Además, contiene exones e intrones, estos últimos se eliminan posteriormente a la transcripción. Por tanto, quedan solo los exones con una caperuza y la cola de polyA formando el mRNA maduro, después se transporta al citoplasma y el ribosoma reconoce la caperuza, se une y en el sitio de inicio de la traducción comienza a sintetizar la proteína
Si el gen que yo quiero superproducir tiene un origen eucariota y lo quiero hacer en E. coli (procariota) debo hacer ciertas modificaciones, ya que la bacteria no tiene mecanismos de procesamiento necesarios para eliminar los intrones, por lo que no obtendremos la proteína correspondiente. Se transcribe y se procesa el RNA producido para que solo contenga los exones, después se retrotranscribe a cDNA, se amplifica por PCR y se introduce como inserto. Tampoco usamos el DNA genómico cuando usamos células eucariotas como huésped, ya que estos genes ocupan mucho espacio y para tenerlo completo hay que clonar un fragmento muy grande que hace que los plásmidos sean muy inestables. Por ello, es mejor usar el cDNA que lleva la misma información que la molécula del mensajero
Al ser un promotor tan fuerte, la bacteria puede acabar muriendo por la elevada cantidad de transcripción o por la superproducción de esa proteína. Para solucionar esto se usa un promotor regulable
¿Cómo funciona un vector de expresión regulable basado en el operón lac?
Este sistema está constituido por un operador al que se unirá la proteína represora y un promotor donde se unirá la polimerasa para expresar el gen de interés. Al operador se une el represor lac, que está cifrado por el gen lacI; por lo que en este mismo plásmido está contenida la secuencia para expresar el represor. El operón lac solo se expresa cuando hay lactosa en el medio. El represor lacI en ausencia de lactosa se une al operador e impide que se transcriba, pero en presencia de lactosa por regulación alostérica, el represor no se puede unir y se expresa en gran cantidad
Justo aguas arriba de donde voy a colocar mi gen, pongo el promotor/operador lac y e gen LacI que determina el represor, así consigo que si no añado IPTG (muy parecido a la lactosa y que las células no pueden transformarlo) no habrá expresión del gen, pero si añado IPTG modifica al represor que ya no se puede unir al operador y se expresará el gen en gran cantidad
Primero se mantiene el gen reprimido para que crezcan muchas células y después cuando ya hay muchas ponemos el IPTG para que se sobreproduzca la proteína
¿Cómo funciona el promotor de alta expresión del fago T7?
Uno de los sistemas más usados usa una combinación entre el operador del operón lac y un promotor reconocido por la polimerasa del fago T7, en lugar del promotor Lac
El plásmido en el que se ha clonado el gen que queremos expresar lo vamos a introducir en una cepa modificada de E. coli, a la que le hemos introducido en su DNA cromosómico el gen que cifra la polimerasa de RNA del fago T7. En este sistema se han mejorado los niveles de expresión/no expresión, ya que se trata de un mecanismo de doble regulación:
- La expresión del gen está regulada por la región operadora lac (si el represor lac se expresa, se unirá al operón lac e impedirá que la polimerasa se una al promotor para expresar el gen)
- La expresión de la polimerasa del fago T7 está regulada por la región operadora lac (si el represor lac se expresa, se unirá al operón lac e impedirá que se exprese la polimerasa)
De esta manera, si no hay IPTG, la proteína LacI se va a unir al operador Lac y non habrá polimerasa del fago T7, y por tanto tampoco se expresará el gen per además tampoco se podría expresar porque también reprime el operador del plásmido. Es un sistema de doble regulación
Si añadimos IPTG, se unirá a los dos represores y evitará la represión, produciendo polimerasas del fago T7 que se unirán a su promotor que además tampoco estará reprimido, y se conseguirán grandes cantidades de expresión
¿Cómo funciona el promotor basado en un mutante termosensible del represor CI del fago lambda?
El represor es activo a 30ºC y a 42ºC no, porque es termosensible. A 30ºC tendré represor que se unirá a su operador y no habrá expresión y al subir la temperatura no hace falta usar ningún compuesto, directamente el represor está inactivo y se expresará en grandes cantidades el gen¿
¿Cómo funciona el promotor inducible por vanilato?
Se basa en el uso de una proteína represora que se une en ausencia de vanilato. Contienen el promotor del vanilato que son reprimidos por la proteína vanR (represora). Simplemente añadiendo vanilato al medio, se une al represor vanR que ya no se puede unir al promotor y se expresa el gen de interés
Lo bueno de este sistema de vanilato es que se puede regular muy bien, ajustando las cantidades de vanilato y así se controla la cantidad de gen que se va a expresar
¿Cómo funciona el promotor reprimible por Trp junto al represor CI del fago lambda?
El represor de Trp no puede unirse sin el Trp.
Se usa un doble sistema de control donde si no hay Trp, el represor no se unirá y se producirán grandes cantidades de represor CI que impedirá la transcripción del gen de interés. Si hay Trp el represor impedirá que se produzca el represor CI y se transcribirá el gen de interés
¿Qué problemas puede haber en la expresión de proteínas en bacterias?
Insertar un gen en un vector de expresión no asegura la adecuada producción de la proteína correspondiente, sobre todo si pensamos en el rendimiento que exigen las demandas comerciales:
Algunos aspectos a considerar son:
- La estabilidad de la propia construcción quimérica de la célula
- La intensidad y el control de la transcripción
- La eficacia de la traducción (la relación contenido en G+C con el uso de codones)
- La toxicidad de la proteína foránea, per se o por el efecto de la superproducción
- Las posibles modificaciones post-traduccionales de la proteína
¿Cómo se pueden utilizar cepas bacterianas modificadas para una mayor producción de tRNAs?
El código genético es universal y degenerado, la mayoría de codones que hay para un determinado aa solamente difieren en la última base. Entonces cuando el mensajero necesite conservar un % concreto de G+C pondrá la base que necesite al final para cumplir ese %. Por eso, si tenemos un gen con muchos codones poco habituales en E. coli se va a traducir muy mal
Una solución es construir genes sintéticos, les cambiamos los codones que son poco frecuentes en E. coli por otros que sinteticen el mismo aa pero que sean más comunes, formamos una secuencia artificial del gen
Otra solución sería utilizar cepas bacterianas modificadas para una mayor producción de ciertos tRNAs. Para ello, se generan cepas de E. coli a las que se le incorporan genes artificiales con las secuencias de determinados tRNAs que puedan leer los codones poco frecuentes
¿Cómo se lleva a cabo la producción de insulina por Ingeniería Genética’
La insulina fuer una de las primeras proteínas que se comercializó una vez producida por ingeniería genética
La secuencia del gen de la insulina está constituida por 3 exones, se fabrica el mRNA correspondiente que dará lugar a la preproinsulina (de 108 aa), la cual tiene un péptido señal en el N-t, cadena B, cadena C y cadena A, además tiene 6 Cys. Sufre un procesamiento donde se elimina el péptido señal y se forman puentes disulfuro entre la cadena A y B, dando lugar a la proinsulina de 84 aa, Por último, para formar la insulina madura, la proteasa corta y elimina la cadena C, quedando solo las cadenas B y A unidas
Se ha logrado diseñar una estrategia para producir la insulina en bacterias recombinantes:
Si nosotros expresamos en E. coli el mRNA de la insulina se producirá la preproinsulina pero ésta no tiene la actividad adecuada para dar lugar a la proteína madura. Por lo tanto, para producir insulina en procariotas, se expresaba en bacterias distintas específicamente la cadena A (de 21 aa) y en otras la cadena B (de 20 aa). Como esta cadenas son muy pequeñas se expresaron como proteínas de fusión unidas a la proteína beta-galactosidasa que es muy estable en E. coli. Se formaron plásmidos de fusión regulables con cada una e las cadenas y se introdujeron en el huésped, obteniendo grandes niveles de las proteínas que tenían que ser purificadas
Se sabía que tanto la cadena A como la cadena B no contenían Met, solo la inicial. Mediante un tratamiento con CNBr, rompe la cadena justo donde se encuentra la Met y así separamos las cadenas A y B de la galactosidasa. Si ahora en un tubo de ensayo in vitro ponemos las 2 cadenas en condiciones óptimas de renaturalización y en condiciones oxidantes, se pliegan correctamente y se forman los puentes disulfuro, obteniendo así la insulina
