Tema 5.1. FIV. Desarrollo embrionario temprano. Flashcards
2 métodos para la
Obtención de ovocitos en mamíferos
y cual tiene un rendimiento medio mayor
- OPU en animales vivos (menos ovocitos pero más maduros)
- Postmortem (más ovocitos pero en diferentes estados de maduración)
El rendimiento medio será mayor en postmortem
Diferentes técnicas para
Ovum Pick Up
(2-3)
- Laparoscopia/laparotomía abdominal con anestesia general
- Punción transvaginal ecográfica con anestesia local
Inconveneintes de
Ovum Pick Up
(3)
- Invasiva
- Laboriosa
- Se pueden formar adherencias en el sitio de punción
Factores que afectan al éxito de
Ovum Pick Up
(2)
- Presión de aspiración
- Diámetro de la aguja
3 pasos de la
Recogida postmortem
de ovocitos en mamíferos
- Transporte a 25-30 ºC en suero fisiológico
- Aspirar con jeringa o con aguja conectada a una bomba de vacío
- Cortar (slicing) ovarios en una placa con medio de recogida
Según el momento y el lugar de recogida encontraremos diferentes
Estados de maduración del ovocito
en cuanto a su dotación y estado cromosómico
- 4n: arresto meiótico, en el folículo (para reproducción asistida)
- 2n: MADURO, metafase 2, aparece el primer corpúsculo polar (huso meiótico y cromosomas lo más compatcos posible)
- n: tras fecundación
No podré fecundar ovocito sin células del cúmulus
Qué ocurre durante la
Maduración nuclear y citoplasmática
del ovocito
- Maduración nuclear: reanudación meiosis (Profase I → Metafase II)
- Maduración citoplasmática: redistribución orgánulos, migración orgánulos corticales (bloqueo periplasma)
Diferentes métodos de
Evaluación del ovocito
3 con lupa, 4 con otras técnicas
LUPA
* 1er corpúsculo polar
* Aspecto
* Células del cúmulus
OTRAS TÉCNICAS
* Integridad de la membrana
* Mitocondrias
* Huso meiótico
* Expresión génica
El 1er corpúsculo polar (CP1) se evalúa con lupa, y es un
Marcador de maduración meiótica y competencia ovocitaria
Que esté degenerado indica
- Envejecimiento del ovocito
- Bajas tasas de fertilización
Con la lupa podemos comprobar la calidad del ovocito según
La distancia entre el CP1 y el huso meiótico.
A mayor distancia
Más envejecido está el ovocito
Qué 3 características del
Aspecto del ovocito
buscamos bajo la lupa
- Citoplasma regular (esférico) y homogéneo
- Gran tamaño
- Zona pelúcida espesa
Color normal del citoplasma difiere entre especies (🐎 > oscuro que 🐑)
Con la lupa, la buena calidad ovocitaria se observa si las
Células del cúmulus
han sufrido qué proceso tras la maduración in vitro
Expansión
Indicada por la acumulación de ácido hialurónico
Células del cúmulus: imprescindibles para la correcta maduración del citoplasma
Qué fluoróforos empleamos para medir la
Integridad de la membrana ovocitaria
fijándonos en la viabilidad y la apoptosis
- 🔴IP: membrana dañada, inviable
- 🟢Anexina-V: apoptosis
Qué fluoróforo empleamos para medir el
Potencial mitocondrial
de los ovocitos o de las células del cúmulus
🔴JC-1: potencial y distribución mitocondrial
Mayor intensidad roja = mayor potencial mitocondrial
Qué tinción empleamos para observar los
Cromosomas
y en qué fase esperamos que se encuentren
🔵 Tinción de Hoeschst
Buscamos que esté en Metafase II (no en vesícula germinal) y compactado
Definición de
Huso meiótico
Estructura del citoesqueleto que interviene en la distribución de los cromosomas
Clave para un correcto desarrollo embrionario
Qué método emplearemos para medir la
Expresión génica
Real Time qRT-PCR
PCR cuantitativa retrotranscriptasa en tiempo real
Analizamos la
expresión de mRNA
de genes relacionados con (5)
- Estrés oxidativo
- Apoptosis
- Actividad mitocondrial
- Reconocimiento maternal, metabolismo e imprinting
- Factores de crecimiento asociados a la maduración ovocitaria
Teniendo la misma genética excelente,
¿qué sexo es más rentabilizable
y porqué?
Macho
porque la hembra se ve afectada por su fisiología
- Duración de la gestación (no se puede quedar embarazada cuando ya lo está)
- 1-2 ovocitos/ciclo
De forma natural, una vaca puede tener
10 terneros en toda su vida
con qué técnicas se puede ampliar este número
- MOET: 30
- OPU o IVP: 70
Uso de diferente macho por cada lote de ovocitos (consanguinidad?)
Ventajas de la
Producción de embriones in vitro
(3)
- ↑ producción de embriones viables de hembras donantes élite
- Fertilizar ovocitos de hembras prepúberes (↓ intervalo generacional → acelera progreso genético)
- Recuperar animales infértiles de alto valor genético
Actualmente, la mayor parte de las
Transferencias de embriones
¿se realizan con embriones obtenidos in vivo o in vitro?
In vitro
Componentes de los
Medios para producir embriones in vitro
(7)
- Iones inorgánicos: funciones catalíticas y fisiológicas
- Fuentes de energía: lactato, piruvato y glucosa
- Aminoácidos: síntesis proteica, regulación del desarrollo embrionario
- Vitaminas: metabolismo de los hidratos de carbono y los aminoácidos
- Fuentes proteicas adicionales: FBS (Fetal Bovine Serum), BSA (Bovine Serum Albumina)
- Hormonas: LH, FSH y 17B estradiol
- Antibióticos
Fases de la
Fecundación in vitro
(4)
- Obtención, selección y maduración de ovocitos
- Preparación esperma
- Fecundación in vitro
- Desarrollo de embriones in vitro
El medio empleado para la
Obtención de ovocitos
consiste en 3 ingredientes
- TCM-199 (tissue culture medium)
- Heparina: redes de fibrina
- HEPES: pH
Existen 3 posibles niveles empleados en la
Selección de ovocitos
para indicar la calidad de los mismos
- Capa densa de células del cúmulus
- Citoplasma casi homogéneo y 3 capas de células del cúmulus
- Sin células del cúmulus
A la hora de
Seleccionar ovocitos
Nos fijaremos en 3 parámetros del cúmulus
- Nº capas
- Compactación
- Transparencia
A la hora de
Seleccionar ovocitos
Nos fijaremos en 2 parámetros del citoplasma
- Color (densidad)
- Tamaño de granulación
Qué hormonas participan en la
Maduración de los ovocitos
Gonadotropinas
Los componentes del
Medio de maduración de ovocitos
son los siguientes (4 principales, 3 secundarios)
- FSH, LH, estradiol, fluido folicular
- EGF, Cisteamina, FCS
El medio para la
Maduración de ovocitos
debe tener unas condiciones de pH y osmolaridad adecuadas
- pH: 7,2
- Osmolaridad: 290 mOsm/kg
Características de la
Capacitación
(4)
- No es un proceso único sino una suma de múltiples reacciones individuales que ocurren en diferentes momentos
- Las subpoblaciones espermáticas no se capacitan de forma síncrona
- Diferente entre especies
- Reversible in vitro
Mecanismos para adquirir el estado de
Capacitación
(4)
- Eliminación del plasma seminal (contiene factores descapacitantes)
- Pérdida de colesterol de la membrana del esperma
- ↑ bicarbonato
- ↑ calcio
Qué 2 características adquiere el esperma con la
Hiperactivación
Y con qué fin
- ↑ Velocidad
- ↑ Desplazamiento lateral de la cabeza (↓ progresividad)
Si se mueve lateralmente, progresa menos hacia delante
Permite al esperma despegarse del epitelio oviductal, penetrar el mucus del oviducto y atravesar las células del cúmulus
Para qué sirve la
Reacción acrosómica
y cuándo ocurre
- Es necesaria para atravesar la zona pelúcida y para la unión de las membranas esperma-ovocito
- Ocurre cuadno el esperma contacta con la zona pelúcida (glicoproteínas).
Qué le ocurre al acrosoma al pasar por las células del cúmulus
indicando el inicio de la reacción acrosoma
Se abomba
Qué tipo de proceso es la
reacción acrosómica
Irreversible, exocitosis enzimas acrosomales
Pasos de la
Capacitación espermática in vitro
(2)
- Eliminación del plasma seminal: gradiente de densidad + swim-up
- Dilución e incubación con medio capacitante
Como medio capacitante emplearemos
SOF (Fluido Oviductal Sintético)
que está compuesto por
- Bicarbonato, calcio 🐭
- Aceptor de colesterol (albúmina 🐭 o heparina 🐮)
- Suero de oveja en celo o fluido folicular (2-10%) 🦌🐑🐐 (pequeños rumiantes)
Dónde ocurre la
fecundación
y qué condiciones deben cumplirse para que ocurra
Ocurre en la ampolla del oviducto
Esperma capacitado + oviductos con células del cúmulus y zona pelúcida
Durante la fertilización, las
células del cúmulus
tienen la función de
Barrera
Las células del cúmulus
regulan la función espermática y favorecen la fertilización
porque aumentan … (2)
- la motilidad
- la velocidad progresiva
Cómo se llama la zona del esperma por la que ocurre la
unión de las membranas esperma-ovocito
Segmento ecuatorial
Tras la penetración del esperma, ocurren
cambios en la zona pelúcida para evitar la polispermia
en lo que denominamos
Reacción cortical
Una parte de la maduración ovocitaria ocurre en el feto, pero se paraliza hasta
…
la pubertad
La hembra nace con un nº determinado de ovocitos, que estarán
…
latentes
Qué procesos ocurren durante la
fertilización
a nivel cromosómico (2)
- reanudación meiosis ovocitaria (se encuentra en MII)
- extrusión del CP2
Cuándo terminará la
maduración del ovocito
Al ser fecundado
pasos en la
formación y aproximación de pronúcleos y activación del cigoto
(4)
- Formación del pronúcleo femenino
- Formación del pronúcleo masculino (descondensación de cromatina por factores citoplasmáticos del óvulo)
- ANFIMIXIS: migración de pronúcleos al centro y unión
- SINGAMIA: descondensación de cromosomas, desaparición de envolturas nucleares y mezcla de cromosomas
Singamia: final fecundación y principio del desarrollo embrionario
El medio empleado en la
Fecundación in vitro
tiene 2 ingredientes
- SOF (Fluido Oviductal Sintético)
- Suero / heparina / BSA
Concentración de espermatozoides necesaria para la
fecundación in vitro
10^6 espermatozoides / ml
Cuántos días tarda el embrión en alcanzar el útero
3 - 5
En qué estadio de desarrollo se encuentra el embrión cuando llega al útero
16 células - mórula
Hasta 16 células nutrición por secreciones oviductales, después uterinas
El embrión se divide sin aumentar / aumentando la masa celular
Sin aumentar
Estadios embrionarios
(4)
- Zigoto
- 2, 4 y 8 células
- Mórula
- Blastocisto (temprano, normal, eclosionado)
Medio para desarrollo embrionario in vitro
(3-4)
- SOF
- Aporte de aminoácidos
- BSA (medio definido)
- se puede añadir FBS
Sistemas de cultivo embrionario in vitro
(4)
- Co-cultivo
- Cultivo con medios definidos
- Cultivo con medios condicionados
- Cultivo in vivo en oviductos 🐁🐇🐑
Cultio embrionario in vitro
Se puede realizar en grupo o de manera individual en …
Microgotas
Cual es el contenido de las
vesículas extracelulares
(4)
- mARN
- miARN
- proteínas
- lípidos
Tasas estadísticas del desarrollo embrionario in vitro
Tasa de fertilización
Cleavage rate
Ovocitos divididos / totales (excluyendo partenogénesis)
A las 48 horas
Tasas estadísticas del desarrollo embrionario in vitro
Tasa de blastocistos
Blastocyst yield
- Blastocistos / ovocitos totales a los 7 días
- Blastocistos / ovocitos divididos a las 48 horas
