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Biotecnología de la Reproducción Animal > Tema 5.1. FIV. Desarrollo embrionario temprano. > Flashcards

Tema 5.1. FIV. Desarrollo embrionario temprano. Flashcards

1
Q

2 métodos para la

Obtención de ovocitos en mamíferos

y cual tiene un rendimiento medio mayor

A
  • OPU en animales vivos (menos ovocitos pero más maduros)
  • Postmortem (más ovocitos pero en diferentes estados de maduración)

El rendimiento medio será mayor en postmortem

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2
Q

Diferentes técnicas para

Ovum Pick Up

(2-3)

A
  • Laparoscopia/laparotomía abdominal con anestesia general
  • Punción transvaginal ecográfica con anestesia local
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3
Q

Inconveneintes de

Ovum Pick Up

(3)

A
  • Invasiva
  • Laboriosa
  • Se pueden formar adherencias en el sitio de punción
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4
Q

Factores que afectan al éxito de

Ovum Pick Up

(2)

A
  • Presión de aspiración
  • Diámetro de la aguja
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5
Q

3 pasos de la

Recogida postmortem

de ovocitos en mamíferos

A
  • Transporte a 25-30 ºC en suero fisiológico
  • Aspirar con jeringa o con aguja conectada a una bomba de vacío
  • Cortar (slicing) ovarios en una placa con medio de recogida
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6
Q

Según el momento y el lugar de recogida encontraremos diferentes

Estados de maduración del ovocito

en cuanto a su dotación y estado cromosómico

A
  • 4n: arresto meiótico, en el folículo (para reproducción asistida)
  • 2n: MADURO, metafase 2, aparece el primer corpúsculo polar (huso meiótico y cromosomas lo más compatcos posible)
  • n: tras fecundación

No podré fecundar ovocito sin células del cúmulus

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7
Q

Qué ocurre durante la

Maduración nuclear y citoplasmática

del ovocito

A
  • Maduración nuclear: reanudación meiosis (Profase I → Metafase II)
  • Maduración citoplasmática: redistribución orgánulos, migración orgánulos corticales (bloqueo periplasma)
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8
Q

Diferentes métodos de

Evaluación del ovocito

3 con lupa, 4 con otras técnicas

A

LUPA
* 1er corpúsculo polar
* Aspecto
* Células del cúmulus
OTRAS TÉCNICAS
* Integridad de la membrana
* Mitocondrias
* Huso meiótico
* Expresión génica

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9
Q

El 1er corpúsculo polar (CP1) se evalúa con lupa, y es un

Marcador de maduración meiótica y competencia ovocitaria

Que esté degenerado indica

A
  • Envejecimiento del ovocito
  • Bajas tasas de fertilización
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10
Q

Con la lupa podemos comprobar la calidad del ovocito según

La distancia entre el CP1 y el huso meiótico.

A mayor distancia

A

Más envejecido está el ovocito

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11
Q

Qué 3 características del

Aspecto del ovocito

buscamos bajo la lupa

A
  • Citoplasma regular (esférico) y homogéneo
  • Gran tamaño
  • Zona pelúcida espesa

Color normal del citoplasma difiere entre especies (🐎 > oscuro que 🐑)

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12
Q

Con la lupa, la buena calidad ovocitaria se observa si las

Células del cúmulus

han sufrido qué proceso tras la maduración in vitro

A

Expansión

Indicada por la acumulación de ácido hialurónico

Células del cúmulus: imprescindibles para la correcta maduración del citoplasma

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13
Q

Qué fluoróforos empleamos para medir la

Integridad de la membrana ovocitaria

fijándonos en la viabilidad y la apoptosis

A
  • 🔴IP: membrana dañada, inviable
  • 🟢Anexina-V: apoptosis
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14
Q

Qué fluoróforo empleamos para medir el

Potencial mitocondrial

de los ovocitos o de las células del cúmulus

A

🔴JC-1: potencial y distribución mitocondrial

Mayor intensidad roja = mayor potencial mitocondrial

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15
Q

Qué tinción empleamos para observar los

Cromosomas

y en qué fase esperamos que se encuentren

A

🔵 Tinción de Hoeschst

Buscamos que esté en Metafase II (no en vesícula germinal) y compactado

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16
Q

Definición de

Huso meiótico

A

Estructura del citoesqueleto que interviene en la distribución de los cromosomas

Clave para un correcto desarrollo embrionario

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17
Q

Qué método emplearemos para medir la

Expresión génica

A

Real Time qRT-PCR

PCR cuantitativa retrotranscriptasa en tiempo real

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18
Q

Analizamos la

expresión de mRNA

de genes relacionados con (5)

A
  • Estrés oxidativo
  • Apoptosis
  • Actividad mitocondrial
  • Reconocimiento maternal, metabolismo e imprinting
  • Factores de crecimiento asociados a la maduración ovocitaria
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19
Q

Teniendo la misma genética excelente,

¿qué sexo es más rentabilizable

y porqué?

A

Macho

porque la hembra se ve afectada por su fisiología

  • Duración de la gestación (no se puede quedar embarazada cuando ya lo está)
  • 1-2 ovocitos/ciclo
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20
Q

De forma natural, una vaca puede tener

10 terneros en toda su vida

con qué técnicas se puede ampliar este número

A
  • MOET: 30
  • OPU o IVP: 70

Uso de diferente macho por cada lote de ovocitos (consanguinidad?)

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21
Q

Ventajas de la

Producción de embriones in vitro

(3)

A
  • ↑ producción de embriones viables de hembras donantes élite
  • Fertilizar ovocitos de hembras prepúberes (↓ intervalo generacional → acelera progreso genético)
  • Recuperar animales infértiles de alto valor genético
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22
Q

Actualmente, la mayor parte de las

Transferencias de embriones

¿se realizan con embriones obtenidos in vivo o in vitro?

A

In vitro

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23
Q

Componentes de los

Medios para producir embriones in vitro

(7)

A
  • Iones inorgánicos: funciones catalíticas y fisiológicas
  • Fuentes de energía: lactato, piruvato y glucosa
  • Aminoácidos: síntesis proteica, regulación del desarrollo embrionario
  • Vitaminas: metabolismo de los hidratos de carbono y los aminoácidos
  • Fuentes proteicas adicionales: FBS (Fetal Bovine Serum), BSA (Bovine Serum Albumina)
  • Hormonas: LH, FSH y 17B estradiol
  • Antibióticos
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24
Q

Fases de la

Fecundación in vitro

(4)

A
  1. Obtención, selección y maduración de ovocitos
  2. Preparación esperma
  3. Fecundación in vitro
  4. Desarrollo de embriones in vitro
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25
Q

El medio empleado para la

Obtención de ovocitos

consiste en 3 ingredientes

A
  • TCM-199 (tissue culture medium)
  • Heparina: redes de fibrina
  • HEPES: pH
26
Q

Existen 3 posibles niveles empleados en la

Selección de ovocitos

para indicar la calidad de los mismos

A
  1. Capa densa de células del cúmulus
  2. Citoplasma casi homogéneo y 3 capas de células del cúmulus
  3. Sin células del cúmulus
27
Q

A la hora de

Seleccionar ovocitos

Nos fijaremos en 3 parámetros del cúmulus

A
  • Nº capas
  • Compactación
  • Transparencia
28
Q

A la hora de

Seleccionar ovocitos

Nos fijaremos en 2 parámetros del citoplasma

A
  • Color (densidad)
  • Tamaño de granulación
29
Q

Qué hormonas participan en la

Maduración de los ovocitos

A

Gonadotropinas

30
Q

Los componentes del

Medio de maduración de ovocitos

son los siguientes (4 principales, 3 secundarios)

A
  • FSH, LH, estradiol, fluido folicular
  • EGF, Cisteamina, FCS
31
Q

El medio para la

Maduración de ovocitos

debe tener unas condiciones de pH y osmolaridad adecuadas

A
  • pH: 7,2
  • Osmolaridad: 290 mOsm/kg
32
Q

Características de la

Capacitación

(4)

A
  • No es un proceso único sino una suma de múltiples reacciones individuales que ocurren en diferentes momentos
  • Las subpoblaciones espermáticas no se capacitan de forma síncrona
  • Diferente entre especies
  • Reversible in vitro
33
Q

Mecanismos para adquirir el estado de

Capacitación

(4)

A
  • Eliminación del plasma seminal (contiene factores descapacitantes)
  • Pérdida de colesterol de la membrana del esperma
  • ↑ bicarbonato
  • ↑ calcio
34
Q

Qué 2 características adquiere el esperma con la

Hiperactivación

Y con qué fin

A
  • ↑ Velocidad
  • ↑ Desplazamiento lateral de la cabeza (↓ progresividad)

Si se mueve lateralmente, progresa menos hacia delante

Permite al esperma despegarse del epitelio oviductal, penetrar el mucus del oviducto y atravesar las células del cúmulus

35
Q

Para qué sirve la

Reacción acrosómica

y cuándo ocurre

A
  • Es necesaria para atravesar la zona pelúcida y para la unión de las membranas esperma-ovocito
  • Ocurre cuadno el esperma contacta con la zona pelúcida (glicoproteínas).
36
Q

Qué le ocurre al acrosoma al pasar por las células del cúmulus

indicando el inicio de la reacción acrosoma

A

Se abomba

37
Q

Qué tipo de proceso es la

reacción acrosómica

A

Irreversible, exocitosis enzimas acrosomales

38
Q

Pasos de la

Capacitación espermática in vitro

(2)

A
  1. Eliminación del plasma seminal: gradiente de densidad + swim-up
  2. Dilución e incubación con medio capacitante
39
Q

Como medio capacitante emplearemos

SOF (Fluido Oviductal Sintético)

que está compuesto por

A
  • Bicarbonato, calcio 🐭
  • Aceptor de colesterol (albúmina 🐭 o heparina 🐮)
  • Suero de oveja en celo o fluido folicular (2-10%) 🦌🐑🐐 (pequeños rumiantes)
40
Q

Dónde ocurre la

fecundación

y qué condiciones deben cumplirse para que ocurra

A

Ocurre en la ampolla del oviducto

Esperma capacitado + oviductos con células del cúmulus y zona pelúcida

41
Q

Durante la fertilización, las

células del cúmulus

tienen la función de

A

Barrera

42
Q

Las células del cúmulus

regulan la función espermática y favorecen la fertilización

porque aumentan … (2)

A
  • la motilidad
  • la velocidad progresiva
43
Q

Cómo se llama la zona del esperma por la que ocurre la

unión de las membranas esperma-ovocito

A

Segmento ecuatorial

44
Q

Tras la penetración del esperma, ocurren

cambios en la zona pelúcida para evitar la polispermia

en lo que denominamos

A

Reacción cortical

45
Q

Una parte de la maduración ovocitaria ocurre en el feto, pero se paraliza hasta

…

A

la pubertad

46
Q

La hembra nace con un nº determinado de ovocitos, que estarán

…

A

latentes

47
Q

Qué procesos ocurren durante la

fertilización

a nivel cromosómico (2)

A
  • reanudación meiosis ovocitaria (se encuentra en MII)
  • extrusión del CP2
48
Q

Cuándo terminará la

maduración del ovocito

A

Al ser fecundado

49
Q

pasos en la

formación y aproximación de pronúcleos y activación del cigoto

(4)

A
  1. Formación del pronúcleo femenino
  2. Formación del pronúcleo masculino (descondensación de cromatina por factores citoplasmáticos del óvulo)
  3. ANFIMIXIS: migración de pronúcleos al centro y unión
  4. SINGAMIA: descondensación de cromosomas, desaparición de envolturas nucleares y mezcla de cromosomas

Singamia: final fecundación y principio del desarrollo embrionario

50
Q

El medio empleado en la

Fecundación in vitro

tiene 2 ingredientes

A
  • SOF (Fluido Oviductal Sintético)
  • Suero / heparina / BSA
51
Q

Concentración de espermatozoides necesaria para la

fecundación in vitro

A

10^6 espermatozoides / ml

52
Q

Cuántos días tarda el embrión en alcanzar el útero

A

3 - 5

53
Q

En qué estadio de desarrollo se encuentra el embrión cuando llega al útero

A

16 células - mórula

Hasta 16 células nutrición por secreciones oviductales, después uterinas

54
Q

El embrión se divide sin aumentar / aumentando la masa celular

A

Sin aumentar

55
Q

Estadios embrionarios

(4)

A
  1. Zigoto
  2. 2, 4 y 8 células
  3. Mórula
  4. Blastocisto (temprano, normal, eclosionado)
56
Q

Medio para desarrollo embrionario in vitro

(3-4)

A
  • SOF
  • Aporte de aminoácidos
  • BSA (medio definido)
  • se puede añadir FBS
57
Q

Sistemas de cultivo embrionario in vitro

(4)

A
  • Co-cultivo
  • Cultivo con medios definidos
  • Cultivo con medios condicionados
  • Cultivo in vivo en oviductos 🐁🐇🐑
58
Q

Cultio embrionario in vitro

Se puede realizar en grupo o de manera individual en …

A

Microgotas

59
Q

Cual es el contenido de las

vesículas extracelulares

(4)

A
  • mARN
  • miARN
  • proteínas
  • lípidos
60
Q

Tasas estadísticas del desarrollo embrionario in vitro

Tasa de fertilización

Cleavage rate

A

Ovocitos divididos / totales (excluyendo partenogénesis)

A las 48 horas

61
Q

Tasas estadísticas del desarrollo embrionario in vitro

Tasa de blastocistos

Blastocyst yield

A
  • Blastocistos / ovocitos totales a los 7 días
  • Blastocistos / ovocitos divididos a las 48 horas

Biotecnología de la Reproducción Animal (5 decks)

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