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Biotecnología de la Reproducción Animal > Tema 4. OMG. Clonación y transgénesis. > Flashcards

Tema 4. OMG. Clonación y transgénesis. Flashcards

1
Q

Definir

Clon

desde un punto de vista Molecular

A

Conjunto de fragmentos idénticos de ácido desoxirribonucleico obtenidos a partir de una misma secuencia original

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Q

Definir

Clon

Desde un punto de vista Celular/de organismo

A

Conjunto de células u organismos genéticamente idénticos, originados por reproducción asexual a partir de una única célula u organismo o por división artificial de estados embrionarios iniciales

Intencional

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3
Q

Define el objetivo de un

Vector

A

Obtener un alto número de copias de una molécula determinada

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4
Q

Nombra las etapas de la clonación molecular con

Vector

(3)

A
  1. Inserción del ADN al vector
  2. Incorporación del vector al hospedador
  3. Selección de células transformadas y multiplicación en cultivo
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5
Q

Año del primer OMG

obtenido mediante clonación molecular

A

1973

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6
Q

Problemas de los plásmidos en la

Clonación molecular en mamíferos

y qué empleamos en su lugar

A

No existen plásmidos que se repliquen de manera autónoma en células de mamíferos, por lo que emplearemos vectores víricos

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7
Q

3 vectores víricos empleados para la

Transformación permanente en células eucarióticas

A
  • SV40 (papiloma de simos)
  • Papiloma bovino
  • Retrovirus
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8
Q

Mecanismos empleados por los

Vectores plasmídicos y fágicos

y cuál es más eficaz

A
  • Vectores plasmídicos –> transfección
  • Vectores fágicos –> infección

La infección es más eficaz

10⁴ - 10⁶ colonias / μg ADN plasmídico
10⁸ halos de lisis / μg ADN fago recombinante

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9
Q

Aplicaciones de la

Clonación molecular

(3)

A
  • Medicina y farmacia: insulina, hormona del crecimiento, factor VIII, vacunas…
  • Industria química y alimentación: enzimas y catalizadores
  • Medioambiente: creación de microorganismos que metabolicen productos tóxicos
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10
Q

En qué año

Secuenciación de insulina humana + introducción en E. coli

A

1978

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11
Q

Problemas en la obtención de

Insulina transgénica

y solución

A

E. coli es gram (-), por lo que no puede secretar insulina al medio y habrá que romper la membrana

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12
Q

Aumento de la esperanza de vida en diabéticos gracias a la

Insulina transgénica

A

Más de 45 años

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13
Q

Funcionamiento de la

Insulina

A

Activa los receptores de insulina de las células, permitiendo la entrada de glucosa en las mismas a través de los transportadores Glut-4

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14
Q

Definición de

PCR

A

Técnica de amplificación de ADN que permite obtener millones de copias iguales (clones) de un fragmento concreto de ADN, partiendo de una cantidad mínima de ADN molde

Proceso catalizado por una ADN polimerasa, basado en la replicación

Aumento exponencial del nº de copias en cada ciclo: las copias nuevas obtenidas en cada ciclo sirven como molde para sintetizar otras nuevas

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15
Q

Tipos de

PCR

A
  • PCR múltiple: amplificar varios fragmentos distintos en una única reacción
  • RT PCR: amplificar ARN
  • PCR a tiempo real: cuantificar la concentración de una molécula concreta de ácido nucleico presente en nuestra muestra
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16
Q

Aplicaciones de la

PCR

(7)

A
  • ⚕️ Diagnóstico de enfermedades
  • 💊 Evolución y respuesta a tratamientos
  • 💀 Medicina forense
  • 🧬 Genotipado
  • 🧪 Estudio de expresión génica
  • ☢️ Mutagénesis
  • 🐵 Estudios filogenéticos: secuenciación de genomas
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17
Q

Mezcla de reacción empleada en la

PCR

Tiene 6 elementos principales:

A
  • Primers o cebadores: oligont monocatenarios cuya secuencia es complementaria a las regiones que flanquean el fragmento a amplificar
  • ADNpol termoestable: enzimas aisladas de arqueobacterias termófilas. Tª óptima: 70-74 ºC
  • DNTps: desoxirribonucleótidos trifosfato
  • MgCl2: cofactor
  • ADN molde: muestra
  • Mix: tampón adecuado que contendrá disueltos todos los reactivos necesarios para la replicación del ADN. Aporta el pH y las sales adecuadas.
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18
Q

Ciclo básico de

PCR

Consta de 3 fases:

A
  • Desnaturalización del ADN molde: 94-95ºC 15-30 seg
  • Hibridación de los cebadores con el ADN molde: 50-65ºC 30-60 seg
  • Extensión de los cebadores: 72ºC Taq polimerasa

  • <1 kb: 30-45 seg
  • 1-1,5 kb: 1 min
  • 1,5-3 kb: 2 min
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19
Q
  • In vivo
  • Secuencias ilimitadas: millones pb
  • Manual: días

¿Se está definiendo Clonación por vectores o PCR?

A

Clonación por vectores

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20
Q
  • In vitro
  • Menor amplificación: hasta 35 kb, cantidad limitada por el nº de ciclos (25-40)
  • Automático: horas

¿Se está definiendo Clonación por vectores o PCR?

A

PCR

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21
Q

Cuántas ovejas hacen falta para la

Transferencia nuclear

A

3

  • Donante de células 2n
  • Donante de células n anucleadas
  • Receptora del embrión
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22
Q

Duración de la

Gestación ovina 🐑

en días

A

152 días

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23
Q

Cómo logramos estimular la

División del zigoto

(2 técnicas)

A
  • Ionomicina
  • Pulsos eléctricos

Imitan el cambio de potencial de membrana que ocurre en el óvulo tras la fecundación y evitan la polispermia

24
Q

Definición del término

Inducción embriológica

acuñado por Hans Spemann, premio Nobel 1935

A

Cambio en el comportamiento de un grupo de células respecto a otro grupo adyacente, provocando un cambio en su forma, su tasa meiótica o su destino

25
# Logros de cada científico en el avance de la transferencia nuclear: 1. Hans Spemann 2. Robert Briggs y Thomas King 3. John Gurdon 4. Wilmut y Campbell 5. Wilmut y Campbell
1. **Inducción embriológica** (mediante división por estrangulación🦎) 2. NT **célula embrionaria** 🐸 3. NT **célula somática** 🐸 4. Cultivo **células embrionarias indiferenciadas** + transferencia 🐑 5. NT **células somáticas diferenciadas** 🐑
26
# Edad genética de nacimiento de la Oveja Dolly
6 años | telómeros cortos
27
# Número de partos de la Oveja Dolly
3
28
# Enfermedades sufridas por la Oveja Dolly
* Artritis * Cáncer de pulmón (retrovirus JSRV)
29
# Edad del sacrificio de la Oveja Dolly | para prevenir el contagio
6 años y medio | Esperanza de vida de su raza: 11-12 años ## Footnote Tener en cuenta que nació con 6 años genéticos (telómeros cortos), por lo que realmente murió con 12 años y medio genéticamente (por enzima de la media de su raza)
30
# La Oveja Dolly | fue 1 de cuántos intentos
277
31
# 2 problemas de la Transferencia nuclear | en mamíferos
* Altas tasas de aborto (meses 5-6) * Mortalidad perinatal (periodo inmediatamente antes y después del nacimiento)
32
# Ejemplos de Células madre | libres de controversia
* Médula ósea * Pulpa dental * Cordón umbilical ## Footnote * Extracción indolora y no invasiva * Tratamiento para 80 enfermedades * Investigación y tratamientos (con permiso)
33
# Cual se considera una Clonación ética en humanos | Entre celular (terapéutiva) y de organismo (reproductiva)
Terapéutica
34
# Definición de OMG
Cualquier organismo, con excepción de los humanos, cuyo material genético ha sido modificado de una manera que no se produce de forma natural en el apareamiento o la recombinación natural, siempre que se utilicen las técnicas que reglamentariamente se establezcan
35
# Tipos de OMG | y ejemplo de la miostatina
* **Knock out**: eliminación de un gen * **Knock down**: disminución de la expresión * **Knock in**: inserción de un gen --> TRANSGÉNICO ## Footnote Miostatina: limita el crecimiento celular. Knock out --> perros más rápidos para carreras
36
# Definición de Animal Transgénico
* Animal en el que se ha producido de forma deliberada una modificación en su genoma en contraste con las mutaciones epontáneas * El ADN es introducido en el animal y después **ha de poder ser transmitido por línea germinal**, por lo que cada célula del individuo contiene el mismo material genético modificado
37
# Técnica de transgénesis: Sperm Mediated Gene Transfer (SPMG) | Cuál es su base y qué complejos se ven implicados
La membrana plasmática post-acrosomal es capaz de captar ADN exógeno ## Footnote * MHC-II: unión al ADN exógeno * CD4: internalización del ADN exógeno
38
# Diferentes técnicas de Transgénesis | De mayor a menor % de descendencia transgénica
1. Transferencia Nuclear de Células Somáticas 2. SMGT (Sperm Mediated Gene Transfer) 3. Microinyección Pronuclear
39
# Aplicaciones de la Transgénesis | (4)
* **Mejora genética** en agricultura y ganadería: animales resistentes a enfermedades y productos tóxicos, más fértiles, más productivos... * **Modelo de enfermedades** humanas: diagnóstico y tratamiento de enfermedades genéticas * **Producción de proteínas de alto valor añadido** * **Xenotrasplantes**: donantes de órganos
40
# Definición de Terapia génica
Transferencia de genes normales a células somáticas para corregir una enfermedad genética | Evita el tratamiento farmacológico de por vida
41
# Aplicaciones de la transgénesis: Mejorar características reproductivas | (5)
* Más calidad y producción * Más desarrollo muscular * Más valor nutritivo * Menos alergias e intolerancias * Protección frente a enfermedades ## Footnote Protección contra enfermedades: * Menos antibióticos * Más bienestar animal * Cría más sencilla * Más producción * Menos riesgo de zoonosis
42
# Ejemplos de Resistencia a enfermedades
* **Mastitis**🐄: Knock-in lisostafina * **Scarpie**🐑: Knock-out PRP (priones) * **Tuberculosis**🐄: Knock-in NRAMP1
43
# Producción de proteínas comerciales Con qué se obtiene más **proteínas recombinantes**: en leche de animales transgénicos o en cultivos celulares | y cuántos g/l se obtienen en cada caso
Leche de animales transgénicos | Hasta 10 veces más ## Footnote * 2-10 g/l proteína recombinante en rumiantes transgénicos * 0,2-1 g/l proteína recombinante en cultivos celulares altamente optimizados
44
# cuando comparamos la producción de proteínas recombinantes entre Leche de animales transgénicos vs otros métodos con igual productividad | los animales transgénicos siguen siendo mejores porque (2)
* Mejor extracción * Modificaciones postraduccionales no afectadas
45
# Ventajas de la glándula mamaria para la producción de Proteínas recombinantes | (5)
* Elevada síntesis proteica * Gran volumen de leche secretada * Fácil recogida y purificación * Capacidad de realizar modificaciones postraduccionales * Riesgo reducido de efectos perjudiciales sobre la salud animal
46
# Aplicaciones de transgénesis: producción de medicamentos Qué es ATryn | y qué promotor regula su expresión
Antitrombina | 🐐 (EMA 2006, FDA 2009) ## Footnote Copias de ADN construido que produce directamente antitrombina humana, insertados en embriones de cabra por **microinyección**, bajo el control de un **promotor** de beta **caseína**
47
# Aplicaciones de transgénesis: producción de medicamentos RUCONEST | Producción de
C1 esterase inhibitor | 🐰 (EMA 2010, FDA 2014) ## Footnote **Angioedema**: asociado a mutaciones en el *gen C1NH*, que codifica una proteína reguladora de la vía del complemento, encargada de regular la respuesta inmune inflamatoria * Ausencia de inhibidor --> dolorosos edemas subcutáneos y en tejidos blandos
48
# Aplicaciones de transgénesis: producción de medicamentos Kanuma | Producción de
Sublipasa alfa | 🐔 (EMA y FDA 2015) ## Footnote **Wolman**: deficiencia de Lipasa Ácida Liposomal (LAL)
49
# Aplicaciones de transgénesis: Modelo de enfermedades humanas | Ejemplo
Retinitis pigmentosa ## Footnote 1. Cerdos expresan gen mutado de rodopsina (Pro347Leu) 2. Pérdida temprana de fotorreceptores tipo bastón 3. Falta de visión en la oscuridad (*ocurre lo mismo en humanos*)
50
# Aplicaciones de transgénesis: definición de Xenotrasplante | heterotrasplante o trasplante heterólogo
Trasplante de células, tejidos u órganos **de una especie a otro, idealmente entre especies próximas para evitar rechazo**, como de cerdos a humanos ## Footnote **Alotrasplante**: trasplante entre individuos de la misma especie
51
# Si España es uno de los países con más donantes de órganos, ¿Por qué son necesarios los xenotrasplantes?
Esperanza de vida larga → listas de espera largas y escasez de órganos
52
# Donantes ideales Simios | (1 ventaja, 5 desventajas)
**Ventaja**: mayor cercanía filogenética ## Footnote **Desventajas** * Poblaciones escasas * Capacidad de crecimiento limitado * Difícil reproducción en cautividad * Portadores de zoonosis graves (retrovirus) * Conflicto social
53
# Donantes ideales Cerdos | (1 desventaja, 5 ventajas)
**Ventajas** * Fácil reproducción * Capacidad de crecimiento * Menor riesto de infecciones cruzadas * Mayor grado de desarrollo (IA, TE, FIV) * Menor controversia ## Footnote **Desventaja**: mayor lejanía filogenética → rechazo
54
# A qué se debe el Rechazo en Xenotrasplantes | y cómo logramos evitarlo
Ataque de los anticuerpos a los **antígenos de carbohidratos** (*galactosa-α-1,3-galactosa*) de las células endoteliales porcinas tras el xenotrasplante | Modificaciones genéticas para evitarlo
55
# Qué técnica se emplea para generar las Modificaciones genéticas para evitar rechazo en Xenotrasplantes | y por qué
Utilizamos **CRISPR-Cas** para suprimir la respuesta inmunológica del receptor | Económico, rápido, sencillo, eficiente y eficaz
56
# Número máximo de kb que se pueden amplificar por PCR | y qué limita éste número
35 kb | cantidad limitada por el nº de ciclos (25-40)

Biotecnología de la Reproducción Animal (5 decks)

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