Tema 4. OMG. Clonación y transgénesis. Flashcards
Definir
Clon
desde un punto de vista Molecular
Conjunto de fragmentos idénticos de ácido desoxirribonucleico obtenidos a partir de una misma secuencia original
Definir
Clon
Desde un punto de vista Celular/de organismo
Conjunto de células u organismos genéticamente idénticos, originados por reproducción asexual a partir de una única célula u organismo o por división artificial de estados embrionarios iniciales
Intencional
Define el objetivo de un
Vector
Obtener un alto número de copias de una molécula determinada
Nombra las etapas de la clonación molecular con
Vector
(3)
- Inserción del ADN al vector
- Incorporación del vector al hospedador
- Selección de células transformadas y multiplicación en cultivo
Año del primer OMG
obtenido mediante clonación molecular
1973
Problemas de los plásmidos en la
Clonación molecular en mamíferos
y qué empleamos en su lugar
No existen plásmidos que se repliquen de manera autónoma en células de mamíferos, por lo que emplearemos vectores víricos
3 vectores víricos empleados para la
Transformación permanente en células eucarióticas
- SV40 (papiloma de simos)
- Papiloma bovino
- Retrovirus
Mecanismos empleados por los
Vectores plasmídicos y fágicos
y cuál es más eficaz
- Vectores plasmídicos –> transfección
- Vectores fágicos –> infección
La infección es más eficaz
10⁴ - 10⁶ colonias / μg ADN plasmídico
10⁸ halos de lisis / μg ADN fago recombinante
Aplicaciones de la
Clonación molecular
(3)
- Medicina y farmacia: insulina, hormona del crecimiento, factor VIII, vacunas…
- Industria química y alimentación: enzimas y catalizadores
- Medioambiente: creación de microorganismos que metabolicen productos tóxicos
En qué año
Secuenciación de insulina humana + introducción en E. coli
1978
Problemas en la obtención de
Insulina transgénica
y solución
E. coli es gram (-), por lo que no puede secretar insulina al medio y habrá que romper la membrana
Aumento de la esperanza de vida en diabéticos gracias a la
Insulina transgénica
Más de 45 años
Funcionamiento de la
Insulina
Activa los receptores de insulina de las células, permitiendo la entrada de glucosa en las mismas a través de los transportadores Glut-4
Definición de
PCR
Técnica de amplificación de ADN que permite obtener millones de copias iguales (clones) de un fragmento concreto de ADN, partiendo de una cantidad mínima de ADN molde
Proceso catalizado por una ADN polimerasa, basado en la replicación
Aumento exponencial del nº de copias en cada ciclo: las copias nuevas obtenidas en cada ciclo sirven como molde para sintetizar otras nuevas
Tipos de
PCR
- PCR múltiple: amplificar varios fragmentos distintos en una única reacción
- RT PCR: amplificar ARN
- PCR a tiempo real: cuantificar la concentración de una molécula concreta de ácido nucleico presente en nuestra muestra
Aplicaciones de la
PCR
(7)
- ⚕️ Diagnóstico de enfermedades
- 💊 Evolución y respuesta a tratamientos
- 💀 Medicina forense
- 🧬 Genotipado
- 🧪 Estudio de expresión génica
- ☢️ Mutagénesis
- 🐵 Estudios filogenéticos: secuenciación de genomas
Mezcla de reacción empleada en la
PCR
Tiene 6 elementos principales:
- Primers o cebadores: oligont monocatenarios cuya secuencia es complementaria a las regiones que flanquean el fragmento a amplificar
- ADNpol termoestable: enzimas aisladas de arqueobacterias termófilas. Tª óptima: 70-74 ºC
- DNTps: desoxirribonucleótidos trifosfato
- MgCl2: cofactor
- ADN molde: muestra
- Mix: tampón adecuado que contendrá disueltos todos los reactivos necesarios para la replicación del ADN. Aporta el pH y las sales adecuadas.
Ciclo básico de
PCR
Consta de 3 fases:
- Desnaturalización del ADN molde: 94-95ºC 15-30 seg
- Hibridación de los cebadores con el ADN molde: 50-65ºC 30-60 seg
- Extensión de los cebadores: 72ºC Taq polimerasa
- <1 kb: 30-45 seg
- 1-1,5 kb: 1 min
- 1,5-3 kb: 2 min
- In vivo
- Secuencias ilimitadas: millones pb
- Manual: días
¿Se está definiendo Clonación por vectores o PCR?
Clonación por vectores
- In vitro
- Menor amplificación: hasta 35 kb, cantidad limitada por el nº de ciclos (25-40)
- Automático: horas
¿Se está definiendo Clonación por vectores o PCR?
PCR
Cuántas ovejas hacen falta para la
Transferencia nuclear
3
- Donante de células 2n
- Donante de células n anucleadas
- Receptora del embrión
Duración de la
Gestación ovina 🐑
en días
152 días
Cómo logramos estimular la
División del zigoto
(2 técnicas)
- Ionomicina
- Pulsos eléctricos
Imitan el cambio de potencial de membrana que ocurre en el óvulo tras la fecundación y evitan la polispermia
Definición del término
Inducción embriológica
acuñado por Hans Spemann, premio Nobel 1935
Cambio en el comportamiento de un grupo de células respecto a otro grupo adyacente, provocando un cambio en su forma, su tasa meiótica o su destino
Logros de cada científico en el avance de la transferencia nuclear:
- Hans Spemann
- Robert Briggs y Thomas King
- John Gurdon
- Wilmut y Campbell
- Wilmut y Campbell
- Inducción embriológica (mediante división por estrangulación🦎)
- NT célula embrionaria 🐸
- NT célula somática 🐸
- Cultivo células embrionarias indiferenciadas + transferencia 🐑
- NT células somáticas diferenciadas 🐑
Edad genética de nacimiento de la
Oveja Dolly
6 años
telómeros cortos
Número de partos de la
Oveja Dolly
3
Enfermedades sufridas por la
Oveja Dolly
- Artritis
- Cáncer de pulmón (retrovirus JSRV)
Edad del sacrificio de la
Oveja Dolly
para prevenir el contagio
6 años y medio
Esperanza de vida de su raza: 11-12 años
Tener en cuenta que nació con 6 años genéticos (telómeros cortos), por lo que realmente murió con 12 años y medio genéticamente (por enzima de la media de su raza)
La
Oveja Dolly
fue 1 de cuántos intentos
277
2 problemas de la
Transferencia nuclear
en mamíferos
- Altas tasas de aborto (meses 5-6)
- Mortalidad perinatal (periodo inmediatamente antes y después del nacimiento)
Ejemplos de
Células madre
libres de controversia
- Médula ósea
- Pulpa dental
- Cordón umbilical
- Extracción indolora y no invasiva
- Tratamiento para 80 enfermedades
- Investigación y tratamientos (con permiso)
Cual se considera una
Clonación ética en humanos
Entre celular (terapéutiva) y de organismo (reproductiva)
Terapéutica
Definición de
OMG
Cualquier organismo, con excepción de los humanos, cuyo material genético ha sido modificado de una manera que no se produce de forma natural en el apareamiento o la recombinación natural, siempre que se utilicen las técnicas que reglamentariamente se establezcan
Tipos de
OMG
y ejemplo de la miostatina
- Knock out: eliminación de un gen
- Knock down: disminución de la expresión
- Knock in: inserción de un gen –> TRANSGÉNICO
Miostatina: limita el crecimiento celular.
Knock out –> perros más rápidos para carreras
Definición de
Animal Transgénico
- Animal en el que se ha producido de forma deliberada una modificación en su genoma en contraste con las mutaciones epontáneas
- El ADN es introducido en el animal y después ha de poder ser transmitido por línea germinal, por lo que cada célula del individuo contiene el mismo material genético modificado
Técnica de transgénesis:
Sperm Mediated Gene Transfer (SPMG)
Cuál es su base y qué complejos se ven implicados
La membrana plasmática post-acrosomal es capaz de captar ADN exógeno
- MHC-II: unión al ADN exógeno
- CD4: internalización del ADN exógeno
Diferentes técnicas de
Transgénesis
De mayor a menor % de descendencia transgénica
- Transferencia Nuclear de Células Somáticas
- SMGT (Sperm Mediated Gene Transfer)
- Microinyección Pronuclear
Aplicaciones de la
Transgénesis
(4)
- Mejora genética en agricultura y ganadería: animales resistentes a enfermedades y productos tóxicos, más fértiles, más productivos…
- Modelo de enfermedades humanas: diagnóstico y tratamiento de enfermedades genéticas
- Producción de proteínas de alto valor añadido
- Xenotrasplantes: donantes de órganos
Definición de
Terapia génica
Transferencia de genes normales a células somáticas para corregir una enfermedad genética
Evita el tratamiento farmacológico de por vida
Aplicaciones de la transgénesis:
Mejorar características reproductivas
(5)
- Más calidad y producción
- Más desarrollo muscular
- Más valor nutritivo
- Menos alergias e intolerancias
- Protección frente a enfermedades
Protección contra enfermedades:
- Menos antibióticos
- Más bienestar animal
- Cría más sencilla
- Más producción
- Menos riesgo de zoonosis
Ejemplos de
Resistencia a enfermedades
- Mastitis🐄: Knock-in lisostafina
- Scarpie🐑: Knock-out PRP (priones)
- Tuberculosis🐄: Knock-in NRAMP1
Producción de proteínas comerciales
Con qué se obtiene más proteínas recombinantes: en leche de animales transgénicos o en cultivos celulares
y cuántos g/l se obtienen en cada caso
Leche de animales transgénicos
Hasta 10 veces más
- 2-10 g/l proteína recombinante en rumiantes transgénicos
- 0,2-1 g/l proteína recombinante en cultivos celulares altamente optimizados
cuando comparamos la producción de proteínas recombinantes entre
Leche de animales transgénicos vs otros métodos con igual productividad
los animales transgénicos siguen siendo mejores porque (2)
- Mejor extracción
- Modificaciones postraduccionales no afectadas
Ventajas de la glándula mamaria para la producción de
Proteínas recombinantes
(5)
- Elevada síntesis proteica
- Gran volumen de leche secretada
- Fácil recogida y purificación
- Capacidad de realizar modificaciones postraduccionales
- Riesgo reducido de efectos perjudiciales sobre la salud animal
Aplicaciones de transgénesis: producción de medicamentos
Qué es ATryn
y qué promotor regula su expresión
Antitrombina
🐐 (EMA 2006, FDA 2009)
Copias de ADN construido que produce directamente antitrombina humana, insertados en embriones de cabra por microinyección, bajo el control de un promotor de beta caseína
Aplicaciones de transgénesis: producción de medicamentos
RUCONEST
Producción de
C1 esterase inhibitor
🐰 (EMA 2010, FDA 2014)
Angioedema: asociado a mutaciones en el gen C1NH, que codifica una proteína reguladora de la vía del complemento, encargada de regular la respuesta inmune inflamatoria
- Ausencia de inhibidor –> dolorosos edemas subcutáneos y en tejidos blandos
Aplicaciones de transgénesis: producción de medicamentos
Kanuma
Producción de
Sublipasa alfa
🐔 (EMA y FDA 2015)
Wolman: deficiencia de Lipasa Ácida Liposomal (LAL)
Aplicaciones de transgénesis:
Modelo de enfermedades humanas
Ejemplo
Retinitis pigmentosa
- Cerdos expresan gen mutado de rodopsina (Pro347Leu)
- Pérdida temprana de fotorreceptores tipo bastón
- Falta de visión en la oscuridad (ocurre lo mismo en humanos)
Aplicaciones de transgénesis: definición de
Xenotrasplante
heterotrasplante o trasplante heterólogo
Trasplante de células, tejidos u órganos de una especie a otro, idealmente entre especies próximas para evitar rechazo, como de cerdos a humanos
Alotrasplante: trasplante entre individuos de la misma especie
Si España es uno de los países con más donantes de órganos,
¿Por qué son necesarios los xenotrasplantes?
Esperanza de vida larga → listas de espera largas y escasez de órganos
Donantes ideales
Simios
(1 ventaja, 5 desventajas)
Ventaja:
mayor cercanía filogenética
Desventajas
- Poblaciones escasas
- Capacidad de crecimiento limitado
- Difícil reproducción en cautividad
- Portadores de zoonosis graves (retrovirus)
- Conflicto social
Donantes ideales
Cerdos
(1 desventaja, 5 ventajas)
Ventajas
- Fácil reproducción
- Capacidad de crecimiento
- Menor riesto de infecciones cruzadas
- Mayor grado de desarrollo (IA, TE, FIV)
- Menor controversia
Desventaja:
mayor lejanía filogenética → rechazo
A qué se debe el
Rechazo en Xenotrasplantes
y cómo logramos evitarlo
Ataque de los anticuerpos a los antígenos de carbohidratos (galactosa-α-1,3-galactosa) de las células endoteliales porcinas tras el xenotrasplante
Modificaciones genéticas para evitarlo
Qué técnica se emplea para generar las
Modificaciones genéticas para evitar rechazo en Xenotrasplantes
y por qué
Utilizamos CRISPR-Cas para suprimir la respuesta inmunológica del receptor
Económico, rápido, sencillo, eficiente y eficaz
Número máximo de kb que se pueden amplificar por
PCR
y qué limita éste número
35 kb
cantidad limitada por el nº de ciclos (25-40)
