Tecnologías de secuenciación Flashcards
Primera clasificación de las tecnologías de secuenciación
- Sanger (1ra generación)
- Next generation sequencing technologies (NGS)
Divisiones de las Next generation sequencing technologies
- Síntesis (2da generación)
- Molécula única (3ra generación)
Tipos de secuenciación por síntesis
- Ilumina
- Detección de nucleótidos por iones (ion torrent)
Tipos de secuenciación por molécula única
- Pac Bio
- Oxford nanopore
qué son los ddNTPs
- Di-deoxinucleotidos
- Son formas mutantes de los desoxinucleotidos
como actúan los ddNTPs
- Modifican los grupos funcionales
- Grupo hidroxilo en la dirección 3’ está afectado y ya no pueden continuar
características de la secuenciación Sanger
- Muy precisa
- Secuenciar segmentos pequeños pero de un gen grande
- Va leyendo de 900 pb
Cómo se reportan los resultados de Sanger
Electroferogramas
pasos de la secuenciación de Sanger
- Se colocan dNTPs y ddNTPs en una concentración equimolar
- Se unen a la cadena ddNTPs o dNTPs
- Cuando entran a la cadena nueva aquí se para la replicación
- ddNTP brilla cuando se une para saber hasta donde llega
- Se mete a electroforesis capilar
- Se obtiene el electroferograma
tecnología de secuenciación que se utilizó para el proyecto de secuenciación del genoma humano
Sanger
en qué año se secuenció por primera vez el genoma humano
en el año 2000
qué es un transcriptoma
Todo el conjunto de genes que se expresan en la transcipción
qué es un exoma
Conjunto de exones en el genoma
características de las Next generation sequencing technologies
- No son tan precisas
- Son rápidas
- Secuencian desde 150pb- 300pb
- Abarataron el costo de la secuenciación
características de ilumina
- Síntesis de nuevas cadenas DNA
- En lugar de ddNTPs se ponen flouróforos en el OH 3’
pasos para la secuenciación por ilumina
- Se cortan segmentos de 150pb- 300pb
- Se agregan Bar codes ( como un ID)
- Colocar un adaptador para que los reconozca el aparato
- Se amplifica la biblioteca genómica
- Realizan ciclos de secuenciación y se colecta la data
- Análisis de variantes y ensamblaje de secuencia
pasos para la detección de nucleótidos por iones (ion torrent)
- se fragmenta el ADN
- preparación de bibliotecas genómicas
- los segmentos tienen adaptadores que serán reconocidos por perlas
- se incorporan dNTPs que libera un H+ en el extremo 3´
- Cambia el pH de la solución (tiene que bajar el pH)
- Agregas la adenina y si sí se le pega si seguía una adenina
tienen que ir probando nucleótidos
características de Pac Bio
- Ensamblaje de genomas nuevos
- Secuencia lecturas largas (2 - 50 Kb)
- Es más preciso
funcionamiento característico de Pac Bio
- No realizan copias para inferir la secuencia del genoma, lo hacen al momento
- El aparato detecta los nucleótidos agregados a la par de que la pol está trabajando
- Los nucleótidos tienen flouróforos
características de oxford nanopore
- Lecturas largas (Mb)
- Ensamblaje de genomas nuevos, sin genoma de referencia
- Se arma fácil
- Menor precisión
concentración mínima de DNA que necesita una muestra para poder ser analizada
20 ng
