Tecnicas De Estudio Flashcards
Mencionar 2 tecnicas de estudio
-con acidos nucleicos
-con proteínas
Tecnicas de trabajo con acidos nucleicos
Ácido desoxirribonucleico, ADN
Ácido ribonucleico, ARN
PCR en tiempo real o cuantitativo
Acido desoxirribonucleicos
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) Técnica que permite amplificar y tener miles o millones de copias de un segmento particular de ADN.
Acido desoxirribonucleicos
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) Técnica que permite amplificar y tener miles o millones de copias de un segmento particular de ADN.
Reaccion de cadena polimerasa :
- mencionar a cual tecnica corresponde
-para que sirve?
-que se necesita(5)
Corresponde a la tecnicas de acidos dexorribonucleicos
-puedo tener millones de copias de ADN
-sirve para ver si un trozo de ADN esta presente o no.
Se necesita: ADN molde, enzima ADN polimerasa termoestable, partidores o cebadores, -dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)-Termociclador
Desnaturalización del ADN : ¿ que ocurre?
Se separa de la doble helice(rompimiento de los puentes de hidrógenos)
Temperatura melting
El 50% de las hebras de ADN de una secuencia especifica estan separadas
Ocurre a 72 grados
Procedimiento de reaccion cadena polimerasa:
-procedimiento
-quien lo realiza?
Finalidad
-La t aumenta a 96 grados para desnaturalizar el ADN ( separar los dos hebras)
-Disminuye la t a 55 grados para templar (unir) los cebadores( obtiendo unos moldes para que puedan unirse los cebadores) ( cebaforas se unen a las secuencias de ADN)
-Se vuelve a aumentar la t a 72 grados para extender los cebadores ( aquí entra la polimerasa la cual nos permite extender los cebadores) (la Taq polimerasa agrega nucleotidos
-Se repite el ciclo 25 a 35 veces
●este proceso lo hace el termociclador
Finalidad: clonar para ADN en un plasmido
Como se visualizan los resultados de pcr
Usando electroforesis en gel
gel de agarosa para un PCR: que hace?
permiten separar moléculas cargadas en función de su tamaño y forma.
Sinonimo de pcr
Reacciòn de cadena polimerasa
Electroforesis en gel:
En que consiste
Composición
Se compone de gel+carga
tengo un gel incrustado en una solución buffer
La solución buffer se compone de agua+sal
Que realiza la solución buffer
Mantiene ph en un rango adecuado.
El ph si sale del rango afectaria el rango.
Escalera de ADN
Es un conjunyo de estandares que se usan para identificar el tamaño aproximaxo de la banda observada en pares.
Tecnica de Acido ribonucleico(ARN) :
¿ con que cosa se genera?
¿ que ocurre?
¿ que muestra?
¿ como se hace?
¿ que enzima participa principalmente?
Ocurre con transcripción reversa
Sintetiza ADN complementario (ADNc) a partir de ARNm con ayuda de la transcriptasa inversa y luego usa la pcr para amplificar las regiones de interes
-muestra la expresión de un gen, no la presencia de uno.
-se extrae ARN de una célula, sigue pasos de pcr convencional se convierte de ARN a ADN complementario.
¿ que contiene el ADN ?
Adn contiene exones e intrones.
¿ que le pasa al ARN al transcribirse?
Tiene splicing, donde se le sacan los intrones
Retro transcripción¿ que se hace? ¿ a partir de que se hace?
Se hace a través de la enzima retro transcriptasa reversa
Se amplifica el ADN a partir de un pcr convencional en donde el templado(hélice molde) va a ser el ADNc
Interpretación de un gen con analisis cuantitativo
Analisis cuantitativo: existe o no el gén de interés
Interpretación deun gen con analisis cualitativo
Responde a que tanto se expresa un gen
¿ que permite el pcr en tiempo real?
¿ que ocurre con la sonda?
-que ocurre con la señal de fluorescencia
Permite ver la generación de ADN, se usa un termociclador para detectar el producto amplificado
-la sonda se une a la doble cadena junto a la alineación del partidor
La señal de fluorescencia aumenta directamente proporcional con el ADN amplificado
Que es el ct
Es un ciclo donde se cruza punto de detección.
Cuando menor es el Ct, mayor es la concentración del parametro estudiado en la muestra
-TÉCNICAS DE TRABAJO CON PROTEÍNAS
Wester Blot
-ELISA
-Inmunohistoquímica-Inmunofluorecencia
Western blot:
función
como se realiza
Permite identificar proteínas por su peso molecular y cuantificar su cantidad relativa de la proteína de la muestra
Proteínas son separadas por un gel según su peso molecular en un gen desnaturalizante, y son transportadas hacia donde tengo el anticuerpo en contra de la proteína de interés.
Primera etapa de western blot
-Separación de proteínas por ELECTROFORESIS
Permite separar moleculas cargadas
Se usa un detergente que da carga negativa a las proteínas(se rompen los enlaces covalentes)
Se aumenta la temperatura para romper puentes de H
Debo sacar las proteinas de su proteina cuaternaria, para ello debo usar un desnaturalizante.
Segunda etapa de western
identificación de proteínas en forma específica algunas de las técnicas que reconocen proteínas es el reconocimiento por anticuerpos, esto debido a la especificidad de la interacción antígeno-anticuerpo.
Analisis cualitativo
La proteina de interes se expresa en todas las células
Analisis cuantitativo
No se puede realizar necesito tener un ensayo WB.
Anticuerpos policlonales
Pueden unirse a muchos epitopos de un solo antigeno.
Anticuerpos monoclonales
Reconocen a un mismo epitopo de un antígeno
Epitopo
Parte de una molecula que sera reconocida por un anticuerpo
ELISA
Un antígeno o anticuerpo inmovilizado se une a un antigeno o anticuerpo, y este despues se une a una enzima que produce una reacción de color.
ELISA ¿ QUE PERMITE?
Permita determinar la presencia de una proteina también cuantifica la cantidad exacta de proteínas
Proteínas inmunohistoquímicas
¿ que anticuerpos se usa y a que se relacionan?
¿ para que sirven?
Se usa un anticuerpo primario especifica para la proteína de interés y un anticuerpo secundario unido a una actividad enzimatica
Se usa para identificar la ubicación de una proteina
Diferencias de ELISA y western blot
Elisa: sencillo, rapido, se usa con antigenos y anticuerpos.
Western blot: mas complejo, toma más tiempo, se usa con antigenos.
