Technologies de l'ADN - Rokeach Flashcards
Qu’est-ce qu’une enzyme de restriction?
C’est une endonucléase qui clive l’ADN bicaténaire à des endroits qui comportent des séquences nucléotidiques spécifiques appelées sites de restriction.
À compléter: Les enzymes de restriction clivent l’ADN à des 1)________ qui comportent souvent des séquences 2)___________, c’est-à-dire qui se lisent 3)____________.
1) Sites de restriction
2) Palindromiques
3) De la même façon dans les mêmes directions
Les enzymes de restriction sont propres à quel type d’organisme? Pourquoi?
Les bactéries parce qu’elles agissent comme système de défense contre les virus des bactéries en coupant l’ADN étranger.
Quels types de fragments d’ADN peuvent résulter d’une digestion par une enzyme de restriction? Lesquels sont plus difficiles à religuer?
1) Bouts collants
2) Bouts francs; plus difficiles à religuer
À compléter: Les bactéries renferment des 1)______ qui leurs sont propres.
Enzyme de restriction
Vrai ou faux. Les enzymes de restriction sont des exonucléases.
Faux.
Expliquez le principe derrière l’électrophorèse sur gel.
D’abord, le gel d’agarose est doté d’un champ électrique. L’ADN chargé négativement va donc migrer vers le pôle positif du champ électrique. Puis, plus les fragments sont longs, plus ils migreront lentement, alors que plus les fragments sont courts, plus ils migreront rapidement. Ultimement, chaque fragment d’ADN sera représenté par une bande sur le gel d’agarose qui ne sera visible que lorsque l’ADN est mélangé à un agent intercalant (ex. bromure d’éthidium), puis placé sous une lumière UV.
À compléter: Une fois coupés par des 1)______, les fragments d’ADN pourront être 2)_______ en fonction de leur 3)_______ par électrophorèse sur gel.
1) Enzymes de restriction
2) Séparés
3) Taille
Que permet de former la ligation de l’ADN? Comment se fait-elle?
Elle permet de créer de l’ADN recombinant en liant 2 ou plusieurs fragments d’ADN via une ADN ligase qui utilise de l’ATP
Qu’est-ce que le clonage?
Insertion d’un fragment d’ADN (= insert) dans un vecteur
Qu’est-ce qu’un plasmide? Que contient-il?
ADN bicaténaire présent sous forme circulaire qui peut se répliquer de façon autonome dans un organisme hôte.
Il comporte une origine de réplication + des gènes codants pour des protéines nécessaires à sa réplication autonome dans l’organisme hôte.
Qu’est-ce qu’un vecteur? Que contient-il?
Plasmique qui comporte:
1- Origine de réplication
2- Gène(s) de sélection (= gène(s) de résistance à des antibiotiques)
3- Site de multiclonage (facilite l’insertion des fragments d’ADN dans le vecteur, soit leur clonage)
Vrai ou faux. Il est 100x plus difficile de lier des bouts collants que des bouts francs.
Faux.
Comment appelle-t-on un fragment d’ADN qui sera inséré dans un vecteur?
Insert
Qu’est-ce que la transformation? Quelle est la fréquence de réussite de la transformation?
Processus d’introduction d’un plasmide dans une bactérie ou une levure; est réussie chez 1/2000 bactéries.
Comment vérifier l’efficacité de la transformation chez des bactéries?
On étale les bactéries dans un milieu présentant l’antibiotique. Ainsi, les colonies bactériennes qui ont reçu le plasmide pourront donc survivre puisqu’elle renferme le gène de résistance à cet antibiotique, tandis que les colonies bactériennes qui n’ont pas reçu le plasmide mourront puisqu’elles sont dépourvues du gène de résistance à l’antibiotique du milieu.
Quel est le marqueur de sélection dans une transformation?
Le gène de résistance à l’antibiotique; permet de sélectionner les bactéries chez lesquelles la transformation est réussie.
À compléter: Il est possible de produire des protéines 1)______ d’intérêt médical et biotechnologique par la méthode de 2)________ de l’ADN, et ce, en utilisant un 3)_________ d’4)_________.
1) Recombinantes
2) Recombinaison
3) Vecteur
4) Expression
À partir de quelle méthode sont produites les protéines recombinantes?
Recombinaison de l’ADN en utilisant un vecteur d’expression
Que permet d’étudier la GFP lorsque fusionnée à des gènes?
1- Niveaux de transcription d’un gène
2- Niveaux de traduction
3- Localisation cellulaire de protéines
4- Co-localisation cellulaire
Qu’est-ce qui agit en tant qu’amorce et en tant que brin matrice d’ADN lors de la polymérisation d’ADN in vitro?
- Amorces: oligonucléotides d’ARN ou d’ADN
- Brin matrice d’ADN: obtenu artificiellement suite à la dénaturation d’un ADN bicaténaire, c’est-à-dire en détruisant les ponts H de la double hélice sous l’effet de la chaleur de sorte à obtenir de l’ADN simple brin synthétique
Quand est-ce que l’absorbance de l’ADN est plus élevée: lorsqu’il est bicaténaire ou monocaténaire? Pourquoi?
Lorsque l’ADN a été dénaturé, c’est-à-dire qu’il passe d’une double hélice à de l’ADN simple brin, son absorbance est plus élevée parce que les bases sont exposées au solvant.
Quels facteurs peuvent dénaturer l’ADN? Qu’arrive-t-il à son absorbance lorsque dénaturé?
- Augmentation de la température
- Augmentation du pH
Absorbance de l’ADN simple brin (donc, dénaturé) augmente.
Classer, selon l’ordre décroissant de vitesse de dénaturation, l’ADN poly A-T, l’ADN poly C-G et l’ADN ordinaire (A-T et C-G).
- ADN poly A-T
- ADN ordinaire (A-T et C-G)
- ADN poly C-G
À compléter: L’ADN simple brin synthétique obtenu in vitro s’effectue par_____ ______ de l’ADN bicaténaire.
Dénaturation thermique
Qu’est-ce que l’hybridation?
Consiste à obtenir de l’ADN renaturé (double brin) en plaçant l’ADN dénaturé (simple brin) dans les bonnes conditions initiales.
Expliquez la méthode de Sanger.
1) Séparation des deux brins d’ADN
2) Dans chaque tube, ajout des amorces (oligonucléotides d’ADN ou d’ARN), de l’ADN polymérase, de tous les types de désoxyribonucléotides (dA, dT, dC et dG) et d’un seul type de di-désoxyribonucléotides (ddNTP) pouvant terminer la chaîne
3) Séparation des fragments d’ADN selon leur taille par électrophorèse sur gel
4) Lecture de la séquence d’ADN sur le gel
À compléter: La méthode de Sanger consiste en une 1)______ ______ in vitro permettant d’identifier les 2)_______.
1) Réplication d’ADN
2) Mutations
Quelle est la différence entre un désoxyribonucléotide (dNTP) et un di-désoxyribonucléotide (ddNTP)?
dNTP: pourvu d’un OH en 3’, ce qui permet l’élongation de la chaîne
ddNTP: dépourvu d’un OH en 3’, ce qui permet la terminaison de la chaîne, sachant que l’ADN polymérase a toujours besoin d’une extrémité 3’ OH libre pour synthétiser ses nucléotides.
Pourquoi est-ce que la chaîne d’ADN ne peut pas s’allonger en présence de ddNTP?
Parce qu’un ddNTP est dépourvu d’un OH en 3’. En effet, l’ADN polymérase peut uniquement synthétiser ses nucléotides à partir d’une extrémité 3’ OH libre, ce qui fait que la chaîne sera terminée.
What does PCR stand for in French?
Réaction de polymérisation en chaîne
Que permet d’obtenir la réaction de polymérisation en chaîne?
Plusieurs molécules filles d’ADN à partir d’un petit échantillon d’ADN
Décrivez les étapes du PCR.
1) Séparation des deux brins d’ADN par dénaturation thermique
2) Hybridation des amorces en retournant aux conditions initiales
3) Synthèse de l’ADN par TaqI ADN polymérase
Pourquoi utilise-t-on la TaqI ADN polymérase, plutôt que E. coli ADN polymérase?
Parce que TaqI ADN polymérase ne se dénature pas sous l’effet de la chaleur, contrairement à E. coli ADN polymérase.
Combien y a-t-il de molécules filles obtenues à la fin de chaque cycle de PCR (donnez une formule)?
2^#cycles = # molécules filles
Combien y aurait-il de molécules filles d’ADN résultant du 6e cycle de PCR?
2^6 = 64 molécules filles d’ADN
