Technologies De L’ADN Flashcards
De quoi dépendent les technologies de l’ADN?
De notre capacité à manipuler l’ADN (nos connaissances acquises en recherche fondamentale applicables à des domaines utiles en santé humaine)
Qu’est-ce qu’une nuclease?
Enzyme qui clive les liaisons phosphodiester entre les nucleotides des brins d’acides nucléiques
Quelles sont les 2 types de nucleases?
Exonuclease: coupe les acides nucléiques, un nucleotide à la fois, à partir d’une extrémité (réduit la taille à partir d’un bout)
Endonuclease : coupe au milieu de la chaîne d’acide nucléique, produisante des fragments
Vrai ou faux. Les exonucleases digèrent les acides nucléiques de 5’ vers 3’?
Faux, autant dans le sens 5’ vers 3’ que 3’ vers 5’
Quelles sont les enzymes de restriction?
Endonucleases de restriction qui coupent l’ADN à des endroits caractérisés par des sites de restrictions (séquence des nucleotides spécifiques)
Pourquoi les bactéries ont des enzymes de restriction?
Parce que elles servent de défense contre les virus (à adn double brin) des bactéries en coupant l’ADN étranger en morceaux
Les enzymes de restriction font partie d’un système de défense de bactéries
Comment sont nommées les enzymes de restriction ?
Selon l’espèce de bactérie desquelles elles ont été isolées
Quel type de séquences sont reconnues par les enzymes de restriction ?
Séquences palindromiques (site de clivage pour coupure symétrique)
Quelle séquence EcoR1 reconnaît toujours?
5’ GAATTC 3’
Vrai ou faux. Il y a beaucoup de palindromes dans le génome ?
Vrai, il y en a énormément
Quelles sont les 2 types de bouts qu’il peut y avoir par un clivage d’un palindrome?
Bouts francs : pas de partie d’ADN simple brin
Bouts collants : extrémités cohésives parce que un nucleotide apparié seulement, les autres sont tous simple brins (ex: EcoR1)
A quoi ça sert de couper au site de restriction?
Avoir des fragments qui s’insèrent dans la coupure pour recombiner l’ADN
Pour la technologie qu’est qui est intéressant?
Prédiction possible: on sait où on peut digérer l’ADN en repérant les palindromes respectif à par exemple EcoR1
Qu’est-ce que la cartographie avec des enzymes de restriction?
Ma poing des sites de restriction de différentes enzymes sur des adn pour définir les séquences
Comment séparer et identifier les fragments d’ADN coupés après digestion avec des enzymes de restriction?
Fragments d’ADN peuvent être séparés selon leur taille par électrophorèse sur gel d’Agarose
Comment fonctionne l’electrophorese sur gel d’agarose?
Retarde adn selon la taille (plus il est grand moins il avance)
ADN charge négativement et alors en appliquant un champs électrique on peut séparer les fragments obtenus (adn cherche à migrer vers +)
Quelle molécule permet de visualiser les fragments d’ADN séparés par electrophorese sur gel d’agarose?
Bromure d’ethidium est une molécule fluorescente (sous UV) qui s’intercale à l’intérieur de la double hélice
Les bandes fluorescentes correspondent à l’ADN
Comment est-ce que la technique avec le gel d’agarose permet de prédire ?
On peut savoir ai l’ADN à été digéré et par combien d’enzymes donc on peut prédire où sont les sites
Une fois qu’on a ça, on peut reconnaître dans n’importe quel autre melange
Quelle enzyme joint 2 fragments d’ADN ensemble?
Ligase
Qu’est-ce que la ligation?
Réformation du lien phosphodiester 3’ -> 5’ pour recombiner l’ADN
Qu’est-ce qui caractérise une ligation de bouts cohésifs?
Ils doivent être compatibles
Besoin d’ATP
Qu’est-ce qui caractérise une ligation d’extrémités franches?
N’importe quels fragments ensemble (utile parce que pas obligé de former un autre palindrome, juste besoin d’un autre bout franc)
Besoin d’ATP
Quelle ligation est plus efficace?
Ligation de bouts francs 100 fois plus faible que celle de bouts collants parce que les bouts collants s’apparient donc stabilisent les interactions (AATT chercher à s’attacher avec TTAA)
Bouts francs dépendent de collisions aléatoires donc moins stables
Qu’est-ce que le clonage?
Ligation d’un fragment d’ADN dans un vecteur qui peut se répliquer de façon autonome
Qu’est-ce qu’un plasmide?
Cercle d’ADN bicatenaire qui peut se répliquer de façon autonome dans un organisme hôte
Peut être présent en plusieurs copies dans une bactérie parce que il a une origine de réplication fonctionnelle et des gènes codant pour des protéines nécessaires à sa réplication
Qu’est-ce qu’un vecteur?
Plasmide qui a été manipulé en laboratoire et dans lequel on a inséré des fragments d’ADN
Quelles séquences d’ADN contient le plasmide?
Origine de réplication pour réplication dans la bactérie
Gène de sélection pour résistance à des antibiotiques
Sites de restriction dans lesquels on peut insérer des fragments d’ADN (clonage)
Comment est-ce qu’on peut distinguer quelles bactéries ont reçu le plasmide?
Propagation de la bactérie avec le plasmide dans un milieu avec antibiotique
Plasmide confère des gènes d’antibioresistance donc seules les bactéries avec plasmide (gène d’intérêt) survivent
On peut alors les amplifier = clonage du gène d’intérêt dans la bactérie hôte
Comment se fait la production de protéines recombinantes thérapeutiques ?
Promoteur bactérien (permettant l’initiation de la transcription)
Clonage du gène (restriction et ligation)
Transformation du plasmide d’expression dans des bactéries adéquates (insertion)
Sur expression et purification de la protéine produite en grandes quantités
Ex: insuline
Qu’est-ce que le GFP?
Green fluorescent protein (permet de voir les protéines)
Quelles sont les propriétés des ADN polymérase?
Polymérisation toujours de 5’ vers 3’
Besoin d’ATP
Peut ajouter des nouveaux nucleotides à un bout 3’ OH déjà existant seulement donc besoin d’une amorce
Dépendante d’une matrice simple brin
Quelles sont les amorces in vivo vs in vitro?
Vivo : amorce ARN sur brin retardé
Vitro : oligonucleotide ADN ou ARN (3’ du brin d’ADN en polymérisation)
Quelles sont les matrices in vitro vs in vivo?
Vivo : région simple d’ADN ouverte par l’helicase
Vitro : adn simple brin obtenu par dénaturation thermique
Comment est-ce qu’on peut artificiellement dénaturer une protéine?
Augmenter la température ou le pH
Plus adn est riche en G-C, plus il faudra d’énergie, alors plus la température sera élevée (contraire si riche en A-T)
Qu’est-ce que le principe de l’hybridation?
ADN dénature (simple brin) peut se renaturer (re-hybrider)en adn double brin lorsqu’on revient aux bonnes conditions initiales
Les brins ne perdent pas leur complémentarité
Dénaturation réversible
Qu’est-ce que la méthode de Sanger?
Méthode de terminaison de chaîne pour détecter une mutation dans un gène
Retirer le groupement OH du carbone 3’ ce qui empêche la polymérisation donc blocage de la synthèse d’adn
Qu’est-ce qu’entraîne l’ajout de didéoxynucleotides?
Faible quantité de didéoxynucleotides permet de bloquer la synthèse d’ADN à plein de positions différentes à mesure que la polymérase recopie le brin matrice
Séparer après ces molécules arrêtées, permet de savoir leur taille et donc à quel endroit ça été arrêté
Comment détermine t on la présence d’un virus chez un patient?
PCR (réaction de polymérisation en chaîne)
Quel est le principe du PCR ?
Cycle de (qui se répète) :
Séparation des brins
Hybridation des amorces
Synthèse par l’ADN polymérase
Que permet le PCR?
Amplifier l’ADN cible
Quel est l’avantage de Taql ADN polymérase?
Espèce qui vit dans le chaud donc capable de répliquer son adn à des températures élevées
Pratique pour PCR parce que elle est réutilisable dans chaque cycle
Vrai ou faux. Plus les amorces sont longues, plus elles sont spécifiques ?
Vrai et moins de chance de reconnaître plus d’un endroit dans le génome
Quelles sont les séquences répétées en tandem ?
STR et VNTR
Comment peut on connaître le nombre de répétions des STR ?
Mettre des amorces de part et d’autre des séquences répétées pour savoir leur longueur et donc le nombre de répétition
Pourquoi les STR sont utilisés en médecine légale?
Leur nombre varie dans un locus pour chaque individu et il serait impossible que toutes les séquences répétées soient identiques entre 2 individus donc ça nous permet d’identifier les personnes
(2 séquences pareilles entre 2 personnes possibles mais pas toutes, sauf pour les jumeaux identiques)
Afin de bien faire la distinction entre 2 individus, quelle caractéristiques doit avoir la séquence répétée?
Contenir de nombreux polymorphismes (séquences répétées très variables selon les individus)
Étant tous des humains la majorité de notre adn est semblable alors il faut choisir ce qui nous distingue et l’amplifier pour voir si ça correspond avec l’échantillon
Qu’est-ce qu’un SNP?
Polymorphisme d’un nucleotide (séquence dans laquelle les individus diffèrent selon une seule bas d’ADN)
Représente 90% des variations génétiques humaines
Mutation silencieuses ou non qui impactent la façon dont le génome s’exprime
Maintenue par l’hérédité
Vrai ou faux. Les SNP n’ont aucun impact sur le risque de maladie d’un individu?
Faux
Que crée un ensemble de SNP?
Motif d’ADN unique pour cette personne
Quel avantage peut avoir les SNP?
Notre compréhension et nos traitements des maladies humaine s
Quelle est la différence entre un SNP et une mutation?
SNP : variation de base d’ADN trouvée dans plus de 1% de la population (variant non aléatoire)
Mutation : variante de base d’ADN trouvée dans moins de 1% de la population
Les mutations ou les SNPs peuvent être associés aux traits génétiques?
SNP
Ex: couleur des yeux, performance musculaire, comportement social, hérédité et susceptibilité à des maladies
A quoi sert une hapmap?
Identification de différences génétiques dans la population qui permettront de prédire la susceptibilité à des maladies
Développer des tests génétiques pour prédire si un individu développera une maladie particulière
Offrir un traitement individualisé pliure prévenir ou délayer le commencement d’une maladie
Quelle est la différence entre la médecine traditionnelle et la médecine personnalisée ?
Traditionnelle : médicaments prescrits selon symptômes mais réactions différentes pour tous
Personnalisée : médicaments prescrits selon des analyses moléculaires pour aider les médecins dans le choix du traitement de la maladie d’un patient pour qu’il soit plus efficace dans le contexte du profil génétique et environnemental du patient
