Techniques de base en biologie moleculaire Flashcards
Est ce qu’une variation du genome est elle forcement pathologique ?
nope
Quelles analyses ne necessitent pas de consentement signe ?
Analyse pour variation genetique sur cellule somatique
Dans quelles classes y a t il la plupart des variation ?
1 et 2
Benigne et probablement begnine
A quoi servent les bases de donnees?
Localisation du variant dans une regio codante ou intronique
Classe 1 et 2 consequences
Sans consequence fonctionnelle
Quelles classes ont des criteres de pathogenecite ?
4 et 5
Quelles sont les categories de variations ?
Variation de petite taille
Macolesion ou macromutation de plus grande taille
Exemple de variation de petite taille
Petites insertions / deletions
Quelle technique d’analyse utilise t on pour les variations de petite taille?
Biologie moleculaire classique
Quelle technique pour les macrolesion ?
Cytogenetique classique
Cytogenetique moleculaire
Biologie moleculaire
Les 3 axes de ce cour
Extraction et dosage des acides nucleiques
Prinicpaux outils d’analyse
Principales techniques d’analyse
(plan) 2 parties dans les techniques d’extraction
Technique de ref au phenole chloroforme
Extraction des ARN totaux
(plan) 2 parties dans les techniques de dosage
Dosage par fluorimetrie
Dosage par spectrometrie
(plan) 3 parties dans les principaux outils d’analyse
Methodes separatives
Enzymes: Nucleases
Oligonucleotides
(plan) Parties dans les principales techniques d’analyse
Amplification PCR
Hybridation moleculaire
Sequencage
Illustrations
Pour quels cellules peut on faire une extraction ?
Toutes sauf les globules rouges
Pourquoi on ne peut pas faire d’extraction avec les globules rouges ?
Non nuclees
Quel est le critere pour faire une extraction ?
Qualite et quantite d’acides nucleiques extraits
Principales etapes d’une extraction
1) Lyse des cellules + dissociation nucleosomes
2)Denaturation des proteines
3)Inactivation des nucleases
4)Purification des acides nucleiques ADN ou ARN
Quelle est la technique d’extraction de reference ?
Celle au phenol-Chloroforme
Autres techniques d’extraction
Kits commercialises
Automates
FTA cards
Etapes d’extraction de technique de reference
1) Lyse des cellules
2) Extraction = deproteinisation
3) Precipitation alcoolique -> adn sous forme solide (pelote)
4)Dissolution dans l’eau
5)Dosage= verification de qualite
A quoi correspond l’extraction dans la technique de ref ?
2e etapes
deprotonoisation
Sous quelle forme est l’adn lors de la precipitation alcoolique dans la technique de ref d’extraction ?
Solide
Particularite de l’arn
Tres fragile
Comment on analyse la qualite de l’arn extrait?
Sur bioanalyseurs
Difference dans la technique au phenol chloroforme lors de l’extraction d’arn totaux
La dissolution dans l’eau est faite dans de l’eau depourvue de RNAases
Quels sont les 2 bioanalyseurs pour analyser la qualite de l’arn extrait ?
Rapport ARNr18S/ARNr28S
Score Rin
Marge de mesure du score rin
1 a 10
Pour de l’arn extrait de qualite quel est le score rin ?
Proche de 10
Le score Rin est utilise dans quels types d’analyses ?
Analyse de biologie moleculaire
Principe du dosage par fluorimetrie
Ajout d’un intercalant fluorecent -> mesure de la fluorecence -> mesure de la concentration en acides nucleiques -> dosage des proteines
Quelle est la technique de dosage la plus utilise ?
Par spectrophotometrie
Principe dosage par specrophotometrie
Concentration d’acide nucleique proportionelle a l’absorbance
Quel est le rapport utilise pour mesurer la qualite du dosage en spectrophometrie ?
DO260/DO280
Pour que l’extraction en dosage (?) soit de qualite le rapport DO260/DO280 doit etre compris entre …
1,7 et 2
2 methodes separatives
Electrophorese
Electrophorese capillaire
Principe de l’electrophorese
Separation des fragments sous l’effet d’un champ elecrique
Principe de l’electrophorese capillaire
Gel inclus dans des capillaires fins
Avantages de l’electrophorese capillaire
Sequenceurs
Consommation minimale d’echantillons
Quelle methode de separation est pratique pour les personnes a adn peu isolables (immunodeprimes et adn tumoral circulant)? Et pourquoi?
Electrophorese capillaire
Car consommation minimale d’echantillons
Quel est le role des nucleases?
Coupure des liaisons phosphodiesthers
Action des endonucleases (nucleases)
Coupure des liaisons phosphodiesthers a l’interieur des sequences
Quels sont les endonucleases pour l’adn?
DNases
Quels sont les endonucleases pour l’arn ?
RNases
Quelles endonucleases sont des enzymes de restrictions ?
DNases
Caracteristiques des enzymes de restriction
Produites par les bacteries
Coupent au niveau des sites de restrictions= sequences palindromiques
C’est quoi les sites de restrictions pour les enzymes de restriction ?
Sequences palindromiques
Quelle est la nuclease utilise dans le sysreme crispr cas9?
Nuclease CA9
Principaux outils d’analyse
Methodes separatives -> Electrophoreses
Nucleases
Oligonucleotides
Quelle methode est une technique d’edition du genome ?
Crispr cas9
Action de crispr cas9
Modif sequence/ regulation d’expression => de n’importe quelle cellule
Caracteristiques de nuclease cas9
Systeme de defense immunitaire de la bacterie
Outil precis
Par quoi est guidee cas9 ?
Fragment d’aRn
Cas 9 peut faire quelle type de cassure ?
Simple ou double
Action de cas9 precisement
Deletion de gene
Insertion de gene
En quoi cas9 est pratique pour la reactivation d’une fonction ?
Insertion d’un gene
En quoi cas9 est pratique pour les maladies genetiques ?
Deletion de gene
Oligonucleotide de synthese
Petite molecule simple brin
d’adn ou ou arn de synthese
2 utilisations des oligonucleotides
Sous forme de sondes
Sous forme d’amorces
Les 2 techniques utilisants des oligonucleotides sous forme de sondes
Hybridation moleculaire
Librairies pour NGS
3 techniques utilisants des oligonucleotides sous forme d’amorces
PCR
RT-PCR
Techniques de sequencage
Principales techniques d’analyse
Amplification des ac nu. in vitro : PCR
Hybridation nucleaire
Sequencage des ac nu
Principe du PCR
amplification exponentielle d’une sequence d’adn nucleaire
Comment il est l’adn dans le pcr ?
Double brin
Ou est effectue le pcr ?
in vitro
A l’aide de quelle adn poly on fait le truc pcr?
Adn polymerase thermostable
Comment on fait une amplification d’une sequence d’adn double brin ?
Par extension de 2 amorces
Quel est le cycle de 3 etapes du pcr?
1) Denaturation de l’adn
2) Hybridation des amorces
3) Elongation
Comment on hybride les amorces lors du pcr ?
Fixation des amorces de part et d’autre de la region a amplifier
Qu’est ce qu’on utilise dans l’elongation des amorces dans le cycle du pcr ?
des dNTPs
Qu’est ce qu’on fait pour l’enlongation des amorces dans le cycle pcr ?
Synthese d’un brin complementaire par Adn polymerase thermostable
Qu’est ce qu’on utilise en pcr ?
2 amorces
dNTP
ADN poly thermostable
Qu’est ce qu’on utilise en Rt-pcr ?
ADN poly retroscriptase ARN dependante
Amorce
Quel est le but du Rt-pcr? Principe ?
Obtenir un adn a partir d’un arn
Transcriptase inverse
Rendement theorique du pcr
2**n
n etant le nombre de cycles
2 types de pcr
en point final
Real time pcr
Types de quantifications en real time pcr
absolue-> Charge virale
relative-> Niveau d’expression d’un gene
Par quoi est catalyse le rt pcr ?
Transcriptase inverse
But du pcr digital
Quantification absolue
Sur quelle adn on peut faire du pcr digital ?
Foetal
La technique de Beaming c quel pcr ?
pcr digital
Interet du pcr digital
Sensibilite accrue
Quel pcr utilise en cas de faible franction allelique d’un variant ?
pcr digital
Types de sondes en Hybridation mol
ADNc
Ribosondes aRn
Oligonucleotides
Principe de l’hybridation mol
Reperer specifiquement une ou qlq sequences dans un melange complexe d’ac nucleique ?
Quel est le type d’hybridation (en milieu liquide?) sur membranes ?
Southern Blot
Northern Blot
Western Blot
Southern Blot->Hybridation sur quoi ?
Sur membrane
Complexe adn/adn cible
Northern Blot->Hybridation sur quoi ?
Sur membrane
Complexe adn/arn cible
Westhern Blot->Hybridation sur quoi ?
Sur membrane
Complexe Acide nucleique/ proteine cible
Etapes d’un southern/ northern blot
1)Clivage adn genomique
2)Depot de Fragments sur un gel d’agarose
3)Transfert de fragments sur membrane
4)Incubation avec sonde marquee
5)Revelation
Quelle technique pour trouver le risque de maladie chez un enfant en comparant avec le genome de ses parents ?
Southern blot
Interet des puces adn
Analyse de l’expression genique
Detection d’anomalies genetiques
Fonctionnement puces a adn
Extraction a partir d’un echantillon
Puis amplification
Marquage
Incubation avec la puce
Presence de sondes hybrides avec le support
Technique de ref en sequencage des ac nucleiques
Sequncage de Sanger
Sur quoi repose le sequencage de Sanger ?
Electrophorese capillaire
Etapes du sequencage de Sanger
1) Amorcage
2) Polymerisation
3) Obtention de Fragments de longueur variable
Qu’est ce que permet l’electrophorese capillaire dans le sequencage de Sanger ?
Reconstitution de la sequence recherchee
Autre technique de sequencage
NGS (haut debit )
Si 2 pics de couleurs dans l’analyse par electrophorese capillaire durant le sequencage de Sanger =>
Heterozygote avec mutation
A quoi correspond l’etape d’amorcage dans le sequancage de Sanger ?
= Hybridation de l’amorce apres denaturation
A quoi correspond l’etape de polymerisation dans le sequancage de Sanger ?
Elongation de l’amorce
Par and poly + dNTPs
Ou arret d’incorporation d’un didesoxynucleotide
Principales techniques illustrees
Southern Blot
HRM (High resolution Melling)= Genotypage
RELP=Polymorphisme de restriction
Digital pcr et Adn tumoral / foetal circulant
Puces a ADN
Caracteristiques de l’adn mt
Circulaire double brin (brin lourd et leger )
1 mitochondrie = combien de mol d’ADN mt
2 a 10
Ou est l’adn mt?
Matrice mitochondriale
Quelle techniques peut on utiliser pour les etudes familiales ?
Southern Blot
Quelle technique pour analyse de l’adn Mt?
Southern blot
Sur quoi repose le HRM ?
Techniques de PCR en temps reel
Quelle technique pour la recherche de variations au niveau des cytochromes en pharmacogenetique ?
HMR
Quelle technique utilise la discrimination allelique?
HRM (genotypage)
Sur quoi repose le polymorphisme de restriction RELP?
Sites de restrictions enzymatiques et utilisation de sondes
Ou est retrouve l’adn circulant ?
Circulation sanguine
Origine de l’adn circulant
Cellule ayant relarguer leur contenu par necrose ou apoptose
Digital pcr et adn foetal -> prise de quoi ?
Sang plasmatique chez la mere
Quelle technique pour depistage non invasif d’une trisomie 21 foetal ?
Digital PCR sur adn foetal
Quelle technique pour detection des SNPs?
Puces a ADN
Technique de genotypage ?
HRM (Hight resolution melling)
Pour la recherche de predisposition de cancer on effectue un digital pcr sur quelles cellules ?
Lymphocytes
Sur quoi on peut faire une analyse genetique somatique en digital pcr ?
Adn tumoral
