Sequencage Flashcards
Technique de ref =
Sequenage de Sanger
Objectif du sequencage de Sanger
Determiner l’ordre d’enchainement des nucleotides
Nessicite de quoi dans le Sequencage de Sanger ?
Melange reactionnel
De quoi est compose le melange reactionnel du sequencage de Sanger ?
1 amorce
+
ddNTP
Sur quoi le principe du sequencage de Sanger repose ?
Electrophorese capillaire
Concernant le principe dus sequancage de Sanger on fait quoi d’abbord ?
Synthese d’un brin d’ADN par une adn poly par allongement de l’amorce
Comment on synthetise un brin d’adn dans le sequancage de Sanger ?
Allongement de l’amorce
Quans est ce qu’il y a arret de la synthese du brin d’adn lors du sequencage de Sanger ?
Lors de l’incorporation d’un ddNTP
Applications du sequencage de Sanger/ résultats sur quoi
Recherche ciblee
Resulats sur electrophoregramme
Limites de la recherche ciblee
Tres chronophage
Technique de reference pour confirmer la pathogenecite d’un variant
Recherche ciblee
En quoi consiste la recherche ciblee ?
Multiples PCR + Sequencage capillaire automatise sur un appareil de sequencage capillaire
NGS =
Sequencage haut debit
Rapide de millers a millions de Molecules d’adn ou arn simultanement
Est ce que le sequencage de Sanger est adapte au sequencage de genomes ?
Nope
Quelle sequencage permet des comparaisons entre individus ?
NGS
Quelle sequencage a une etape d’ajout d’adaptateurs ?
NGS
Est ce qu’il y a separation des fragements par electrophorese sur gel en NGS ?
Nope
Applications du NGS
DNaseq
RNaseq
DNaseq
NGS de l’adn
Variations visibles grace au DNaseq
Mutations Pontuelles
Petites insertions
Duplications
Deletions
Les echelle d’analyse differentes de NGS
Genetique constitutionelle et somatique (oncologie)
Cytogenetique
Bacteriologie
Virologie
Types d’approches DNaseq
WGS (whole genome sequencing)
WES (whole exons sequencing)
Mutomes
Panel de genes d’interet
Panels ciblees
Quelle type d’approche pour verifier une deficience intellectuelle ?
WES
WGS =
plateforme d’analyse des donness de stockage
Quelle approche DNaseq = plateforme d’analyse des donness de stockage
WGS
Quelle technique DNaseq a des VSI tres nombreux (exons, introns)?
WGS
Mutomes =
Approche DNaseq
Sequencage de large panels
Concernant le sequencage d’ac nucleiques circulants
Quels sont les applications ?
ADN tumoral circulant
Recherche de la trisomie 21
RNaseq =
Sequencage de l’ensemble du transcriptome
Methodologie du NGS
Extraction adn genomique
Amplification clonale par PCR
Traitement des donnes
Interpretation biologique
Sur quoi on fait une amplification PCR lors du NGS?
Plateforme NGS
3 types de traitements de donnes lors du NGS
Base calling
Mapping fichier bam
Variant calling vcf
Traitements de donnes NGS
Alignement des sequences au genome de ref =
Mapping fichiers Bam
Traitements de donnes NGS
Comparaison des variants au genome de ref =
Variant calling vcf
Interpretation biologique en NGS =
Filtrage informatique
Filtrage informatique en NGS
Interrogation des bases de donnees
Analyse de la qualite -> couverture et profondeur
Principales etapes du NGS
1) Librairies
2) Amplification clonale
3) Traitement bioinformatique
Constitution de librairies en NGS
Fragmentation de l’adn
Liaison des fragments des petites molescules d’adn synthetiques = adaptateurs
Adaptateurs en NGS =
Petites molecules d’adn synthetiques
Code barres specifiques de chaque client en NGS=
Liaison des des fragments des adaptateurs
Technologie illumina
Amplification en pont
Amplification en pont en technologie illumina
Hybridation d’une molecule simple brin a un oligonucleotide
Synthese d’un brin complementaire au brin matrice par une polymerase
Grace a quoi on peut hybrider une molecule simple brin a un oligonucleotide en technologie illumina ?
Complementarite avec les adaptateurs
Traitement de donnees en technologie NGS -> necessite de quoi ?
Filtres bioinformatiques des variants
Methodes de filtration lors du traitement de donnees en NGS
Variants genetiques non codants
Variants genetiques associes a des maladies
Variants in silico (faux sens / pathogene)
Variants relevants
Nouveaux variants (rares)
Rsiques des filtres bioinformatiques des variants
Criteres de filres trop permissifs / trop stringents
2 parametres de qualite lors du traitement de donnees en NGS
Profondeur de lecture
Couverture
Strategie de classification des variants en NGS
Logiciels de predictions de pathogenecite
Nombre de classes de variants
5
Quelle est la classe beinins des variants ?
1
Si le variant est inconnu lors du traitement de donnees lors du NGS ->…
Estimation de son caractere pathogene
Quelles variations sont souvent pathogenes?
Insertions et deletions
Grace a quoi on interprete des variants lors du NGS?
Bases de donnees
Types de donnees lors de l’interpretation des variants
Epidemiologiques
Structurales
Fonctionelles et somatiques
Confrontation clinico biologique
De segregation
Frequence allelique importante en faveur du caractere beinin -> donnees
Epidemiologiques
D’apres le donnees epidemiologiques , plus un variant est rare …
Plus le risque de patholgie augmente
Bases de donnees epidemiologiques
HGMD-> pour les substitutions
OMIM
Logiciel des donnes structurales
Logiciel in silico
Analyse en trio =
Recherche du variant chez les 2 parents
(donnees de segregations )
Variants de novo =
Retrouve chez aucun parents
(cherche en analyse en trio)
(donnes de segregation)
Analyses transmission familiale + Determination critere herite ou non du variant => Donnees
De segregations
Quelle type de donnees traitees ne necessite pas de consentement ?
Somatiques
Recherche instabilite microsatellitaire => donnees
Somatiques
Dans l’exemple d’application NGS du diabete monogenique -> On utilise
Un arbre decisionnel
Pk on utilise un arbre decisionnel dans l’exemple du diabete monogenique ?
Determiner la causalite d’une anomalie genique
Qu’est ce qu’on voit dans l’arbre decisionnel dans l’exemple du Diabete monogenique ?
Mutations non sens avec decalage de lecture de l’arbre
Quels sont les elements en faveur de pathogenecite dans l’exemple du diabete monogenique?
Localisation d’un domaine fonctionnel
Abscence de l’alteration dans une population de controle
Pk on utilise des filtres informatiques dans le traitement de donnees en NGS?
Volume tres important des donnees
Maladies exemples d’applications NGS
Diabete monogenique
Encephalopathie epileptique precoce
Neuropathie
Anemie hemolytiques
Maladie de Charcot Marie tooth =
Neuropathie
Dans quelle application a t ont retrouve un variant a l’etat heterozygote ?
Encephalopathie epileptique precoce
Dans quelle application a t ont retrouve un gene candidat = 1 variant heterozygote ?
Anemie hemolytique chronique d’etiologie inconnue
