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PACES Biochimie > Technique d'étude des protéines / > Flashcards

Technique d'étude des protéines / Flashcards

1
Q

Quelles sont les techniques d’étude des protéines utilisant comme critère la masse ?

A

Centrifugation différentielle, ultracentrifugation (densité), électrophorèse monodim (SDS-Page), électrophorèse bidim en 2ème dim avec SDS-Page

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Q

Quelles sont les techniques d’étude des protéines utilisant comme critère la taille ?

A

Dialyse, chromatographie par exclusion (taille et forme), HPLC (chromatographie liquide à haute performance) qui peut utiliser l’exclusion par la taille, électrophorèse monodim (SDS-Page), électrophorèse bidim en 2ème dim avec SDS-Page

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3
Q

Quelles sont les techniques d’étude des protéines utilisant comme critère la charge ou pHi ?

A

Chromatographie échangeuse d’ions, électrophorèse, isofocalisation, électrophorèse bidim en 1ère dim avec isofocalisation, HPLC (chromatographie liquide à haute performance) peut utiliser échange d’ions

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4
Q

Quelles sont les techniques d’étude des protéines utilisant comme critère l’affinité ?

A

Chromatographie d’affinité (affinité pour certains groupes réactifs), chromatographie d’affinité (immunoaffinité de certains anticorps pour des épitopes antigéniques portés par la protéine à isoler)

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5
Q

Quel est le principe de la centrifugation différentielle ?

A

après avoir isolé et broyé le tissu, centrifugation différentielle permet de séparer différents constituants; le plus svt à l’aide de plusieurs cycles de centrifugation à accélération croissante.

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6
Q

Quelles sont les étapes de la centrifugation différentielle ?

A
  1. Première centrifugation à faible accélération pour isoler cellules vivantes, éléments les plus massifs sédimentent et forment un culot au fond du tube. Tous les autres éléments restent dans la fraction liquide appelée SURNAGEANT
  2. Il est ensuite possible de centrifuger le surnageant à une vitesse plus élevée pour isoler d’autres composants
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7
Q

Sur quoi repose l’ultracentrifugutation ?

A

Repose sur gradient de densité

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8
Q

Comment fonctionne l’ultracentrifugation ?

A

Fonctionne avec l’utilisation d’appareils tournant à vitesse très élevée, au moins 100 000 tours/min

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9
Q

Quel est le principe de l’ultracentrifugation ?

A

Chaque particule possède un coeff de sédimentation (Svedberg) qui lui est propre. Coeff proportionnel à la masse mais tient compte de la densité de la solution et du frottement. On isole des particules en fonction de leur densité, c’est une technique lourde, mais non dénaturante.

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10
Q

Quel est le principe de la dialyse ?

A

Technique de purification et de concentration de la fraction recueillie consistant à séparer les protéines des plus petites molécules en fonction de leur taille. Les petites molécules diffusent librement à travers la membrane, tandis que les grosses molécules ne passent pas.

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11
Q

Quels sont les 5 critères de séparation des protéines ?

A
  • l’insolubilité relative dans des solutions salines concentrées
  • taille
  • charge (selon pHi)
  • capacité à former des liaisons avec certains groupements
  • propriétés antigénique
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12
Q

Quels sont les autres noms de la chromatographie d’exclusion ?

A

Filtration sur gel ou perméation sur gel

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13
Q

Quel est le principe de la chromatographie d’exclusion ?

A

Séparer les protéines selon taille et forme, on parle d’effet de tamis moléculaire, les grosses protéines sont éluées en premiers, tandis que les petites protéines circulent dans les pores de billes creuses (agarose, polyacrylamide, dextran) et sont donc éluées en dernier.

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14
Q

Quel est le principe de la chromatographie d’affinité pour certains groupements réactifs ?

A

Intéraction entre support et prot d’intérêt sont nn covalentes, permet le détachement de la prot. Intéraction entre grpmt réactif et matrice sont cov.

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15
Q

Pouvez vous donner un exemple et l’expliquer de la chromatographie d’affinité pour certains grpmt réactifs ?

A

Une enzyme qui conso du glucose se fixe sur les billes avec le glucose greffé, pour éluer la prot, il faut augmenter la concentration de glucose dans la solution d’élution

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16
Q

De quelles natures peuvent être les grpmt réactif dans la chromatographie d’affinité pour certains grpmt réactifs ?

A
  • grpmt spécifiques (ligands)

- grpmt réactionnels (bromure de cyanogène, époxy…)

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17
Q

Quel est le principe de la chromatographie d’affinité pour des épitopes antigéniques portés par la protéine à isoler ?

A

Colonne est remplie de billes portant chacune un anticorps spécifique d’un ou plusieurs épitopes antigéniques portés par la prot à isoler.

  1. à pH 7 : intéraction spécifique antigène/anticorps
  2. lavage : pr éliminer ttes les prot qui ne st pas liées spécifiquement aux antic de la colonne
  3. élution à pH 3 : rupture de l’intéraction antig/antic et élution de la protéine d’intérêt
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18
Q

Quelles sont les propriétés différentes de séparation utiliser pour la HPLC ?

A
  • adsorption (colonne de silice)
  • échange d’ions
  • exclusion par la taille
  • intéraction hydrophobe
  • chromatographie en phase reverse
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19
Q

A quoi correspond la chromatographie en phase reverse ?

A

Chromatographie de partage liquide-liquide où la phase stationnaire est un liquide non polaire immobilisé sur un support inerte (intéractions hydrophobes se créent entre cette phase stationnaire et les résidues hydrophobes de la protéine) et la phase mobile est un liquide polaire. Les protéines sont généralement dénaturées avant le passage sur la colonne pour exposer leurs résidus apolaires (svt internes)

20
Q

Quelles sont les avantages de la HPLC ?

A

haute résolution, rapides, sensibles, automatisables

21
Q

Quel est le principe de la chromatographie échangeuse d’ions ?

A

Repose sur l’utilisation de billes chargées qui peuvent interagir avec les protéines, l’élution se fait par augmentation de la concentration en sels, les protéines les moins chargées positivement sortent les premières

22
Q

Quelle est la charge de la phase stationnaire de la chromatographie échangeuse de cations et d’anions ? Et quel est le nom de chacune de leur résine ?

A

cations : chargée négativement, résine anionique

anions : chargée positivement, résine cationique

23
Q

Comment augmente les tampons d’élution pour la chromatographie échangeuse de cations et d’anions ?

A

cations : tampon de pH croissant

anions : tampon de pH décroissant

24
Q

Quel est l’orde d’élution pour la chromatographie échangeuse de cations et d’anions ?

A

cations : selon ordre pHi croissants

anions : selon ordre pHi décroissants

25
Q

Sur quoi repose l’électrophorèse ?

A

Repose sur la mesure de la vitesse de migration des prot dans un gel soumis à un champ électrique

26
Q

De quoi dépend la vitesse de déplacement des prot dans un gel pour l’électrophorèse ?

A
  • intensité du champ électrique
  • charge de la prot qui dép des variations de pH, force ionique et température
  • intensité des frottements qui dép de la nature du gel (agarose ou polyacrylamide) ou de la nature du solvant
27
Q

Quel est le principe de l’électrophorèse ?

A

Il va y avoir création d’un réseau tridimensionnel à maillage plus ou moins serré qui va créer un effet tamis où les petites molécules sont les plus rapides

28
Q

Où migrent les molécules selon leur charge pour l’électrophorèse ?

A

Molécules chargées + vers borne - (ou cathode)

Molécules chargées - vers borne + (ou anode)

29
Q

Dans quoi sont déposées les molécules pour SDS-page ?

A

Gel de polyacrylamide

30
Q

Qu’est-ce-qu’il faut faire avant de faire SDS-page ?

A
  • SDS qui casse toutes les liaisons faibles au sein de la prot
  • béta mercaptoéthanol qui casse ponts disulfures
31
Q

Quel est le principe de SDS-page ?

A

Les petites protéines migrent le plus loin car se sont les plus légères

32
Q

Quel est le principe de l’isofocalisation ?

A

Prot déposées dans un gel contenant des ampholines au niv d’une zone de pH=6. Sous l’influence d’un champ électrique, les protéines migrent vers la zone de pH correspondant à leur pHi, lorsque pH=pHi la prot acquière une charge neutre et cesse de migrer

33
Q

Quelle est la première dimension de l’électrophorèse bidim ? Et quelle est sa deuxième dimension ?

A

1ère : isofocalisation

2ème : SDS-page où les prot migrent vers l’anode en fonction de leur masse ou taille

34
Q

Qu’est-ce-que permet l’électrophorèse bidim ?

A

isoler une prot afin d’analyser sa composition par spectrométrie de masse : c’est la base protéomique

35
Q

Quel est le principe de la spectrométrie de masse ?

A

Prot à analyser sont couper par la trypsine, fragments trypsiniques obtenus sont ensuite déposés sur une matrice qui est soumise à un rayon laser (photons), ce qui ionise les prot positivement. Les prot sont ensuite vaporisées dans un tube sous vide, puis se dirige vers un détecteur chargé négativement. Comme la charge de tous les peptides est identique, elles se déplacent plus ou moins vite vers le collecteur. Le temps que met le peptide depuis le support jusqu’au détecteur est directement fonction de sa masse/taille. On obtient donc un spectre de masse caractéristique d’une protéine donnée. En comparant les résultats des peptides étudiés à des banques de données protéiques, il est possible de les identifier.

36
Q

Comment est obtenu le plasma humain ?

A

Ap centrifugation du sang en présence d’anticoagulant.

37
Q

Quelle est la technique utilisée pour séparer les protéines du plasma humain ? Et quelles sont-elles ?

A

Electrophorèse

prot : albumine, globuline, immunoglobuline

38
Q

Quelles sont les techniques enzymatiques utilisées pour découper la protéine en petites unités ?

A
  • endopeptidase : trypsine (coupe après lysine et arginine), chymotrypsine (coupe après AA aromatiques : Phénylalanine, tyrosine, tryptophane)
39
Q

Quelles sont les techniques chimiques utilisées pour découper la protéine en petites unités ?

A
  • béta mercaptoéthanol : coupe pont disulfure par réduction

- hydrolyse acide : coupe ttes les liaisons peptides, ce qui libère tous les AA

40
Q

Qu’est-ce-qui coupe les liaisons faibles ?

A

SDS et urée concentrée

41
Q

Quelles sont les trois méthodes pour découvrir la structure d’une prot ?

A
  • cristallisation d’une prot : utilise diffraction rayon X sur prot cristallisée
  • bioinformatique : prédit structures secondaires d’une prot
  • corrélation entre la structure supposée et la fonction d’une prot
42
Q

Qu’est-ce qui est nécessaire lorsque la séparation est automatisée ? A quel moment ? Quels systèmes sont alors utilisés ? Comment sont analysés ensuite les résultats ?

A

Il peut être nécessaire de disposer d’appareils automatiques pour réaliser les séparations, lors de de recherche de marqueurs biologiques chez un malade.
On utilise alors des systèmes où les éléments d’intérêt, entrainés par un liquide (phase mobile) établissent des liaisons transitoires (ioniques, hydrophobes…) avec le support (phase stationnaire).
A la sortie, on repère les protéines grâce à des AA aromatiques qui absorbent la lumière UV à 280 nm.

43
Q

Lors de la séparation des protéines à l’hôpital à l’aide de quelles propriétés des AA sont basés les mesures à chaque étape de purification ? Que fait-on si la protéine d’intérêt est douée d’une activité particulière ?

A

On se base sur les propriétés d’absorption des AA aromatiques à 280 nm.
Si protéine particulière, on peut utilisée une quantification spécifique de la protéine en mesurant précisément cette activité.

44
Q

Lors de l’analyse de la composition de la protéine d’intérêt que peut-on faire pour découper la protéine en petites unités ?

A

La dénaturer, càd casser tous les éléments constituant la structure tertiaire, en particulier les liaisons fortes comme les ponts disulfures. Pour cela on utilise des ac forts à haute température pour obtenir des fragments protéiques dont on pourra analyser la composition par chromatographie protéique.

45
Q

Qu’est-ce-qui est intéressant dans le fait de connaître la structure d’une protéine ?

A

Dans la recherche de médicaments : une fois que la structure est connue, l’effet de molécules complémentaires pouvant activer ou inhiber la protéine sera modélisé.

46
Q

Comment fonctionne la dyalise ?

A

on place une boudin de dialyse percé de petits trous dans un liquide inerte
pour équilibrer les concentrations de part et d’autre de la membrane du boudin, les protéines diffusent de la solution la plus concentrée vers la moins concentrée
en fonction de la taille des pores on peut sélectionner les protéines ayant la taille de la protéine d’intérêt

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