T2 - TÉCNICAS BÁSICAS DE MICROBIOLOGÍA Flashcards
MICROSCOPÍA ÓPTICA
La luz incide perpendicularmente sobre la muestra a observar. Los microorganismos desvían la trayectoria de la luz (impiden su paso), y se observan sobre un fondo iluminado (campo claro). El condensador y el diafragma se emplean para cambiar la cantidad de luz que llega a la muestra, es importante saber emplearlos en función de la muestra con la que se trabaja.
El ojo humano no puede observar objetos cuyo tamaño es inferior a 0,1 mm (invisibles).
La calidad de un microscopio está determinada por su poder de resolución (NO por el poder de amplificación).
Si el poder de amplificación es de 1000 aumentos, una distancia “d “, de 200 nm, se observaría 1000 veces mayor: 200.000 nm (0,2 mm), distancia observable por el ojo humano.
PODER DE RESOLUCIÓN
La resolución o poder de resolución es la capacidad de distinguir como separados o distintos dos puntos o partículas adyacentes o muy juntas. Se mide como una distancia (d): la distancia mínima a la que se pueden distinguir dos puntos como separados o diferentes.
Aumenta cuando “d” disminuye (a mayor resolución, menor “d”), es decir, son inversamente proporcionales. PR de una lente viene determinado por la siguiente fórmula: d=λ/n.senΘ
- Θ: la mitad del ángulo de apertura de la lente (es característica de cada lente).
- λ: longitud de onda de la luz empleada.
- n: índice de refracción del material que atraviesa la luz.
El senϴ siempre dará valores próximos pero inferiores a 1. La calidad de un microscopio está determinada por su poder de resolución (NO por el poder de amplificación).
Dado que cuanto menor sea “d”, la resolución es mayor (mejor), interesa que el numerador sea lo más pequeño posible (λ pequeña). La luz visible abarca diferentes longitudes de onda (450-700nm, media λ = ± 600nm). Para reducir λ se emplea un filtro azul porque la luz azul tiene una longitud de onda más baja (450nm).
Mediante el uso de aceite de inmersión entre el porta y el objetivo podemos aumentar el índice de refracción y por tanto el denominador, lo que reduce la distancia y aumenta el poder de resolución.
MICROSCOPIO DE CAMPO CLARO
El microscopio de campo claro es poco útil para la observación directa de microorganismos en preparaciones sin teñir, por la falta de contraste entre los microorganismos (80% de agua), el vidrio y el aire. Es necesario cerrar el diafragma, ya que la luz es desviada por los microorganismos y las partículas de la muestra.
Los microorganismos impiden el paso de luz, y se observan oscuros sobre un fondo iluminado (claro), pero hay que observarlos con poca intensidad de luz (con el condensador y el diafragma). Si los microorganismos están teñidos (tinciones), se observan mucho mejor, ya que el contraste aumenta mucho.
Para la observación directa de los microorganismos sin teñir se emplean otros tipos de microscopio:
- Microscopio de campo oscuro
- Microscopio de contraste de fases.
MICROSCOPIO DE CAMPO OSCURO
Los rayos de luz inciden oblicuamente sobre la muestra. Si los rayos no se desvían de su trayectoria, no entran en la lente del objetivo (y se observa todo oscuro, sin iluminar). Los microrganimos desvían la luz, y los rayos desviados entran en la lente del objetivo, por lo que se observan iluminados sobre un fondo oscuro. Este método es mucho más útil para ver microorganismos sin teñir.
Esto se consigue porque entre el foco de luz y la muestra se coloca un anillo de campo oscuro de un material opaco y consistente que bloque la entrada de luz que proceda perpendicularmente.
MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASES
Incorpora un sistema óptico especial que permite detectar las pequeñas desviaciones de la luz al atravesar partes de las células (microorganismos) con distinta composición/estructura y transformarlas en diferencias de intensidad. Permite observar detalles intracelulares de los microorganismos (si el poder de resolución lo permite).
Cuando los rayos de luz atraviesan un microorganismo no se desvían todos igual, pues en el interior de la célula hay orgánulos o gránulos con consistencias diferentes que generan diferentes desviaciones. El microscopio de contraste de fases convierte estas diferencias en las desviaciones de la luz en cambios de intensidad, lo que permite ver diferentes componentes del microorganismo dentro del poder de resolución del microscopio. Esta es la mejor técnica para ver muestras sin teñir, sin embargo, es la más cara. Es más fácil de ver si el microorganismo es grande.
MICROSCOPIO DE LUZ UV
La fuente de luz es una lámpara de mercurio que emite luz en el rango UV.
VENTAJAS: mayor poder de resolución, ya que la λ UV es menor que de la luz visible (el poder de resolución se duplica, aproximadamente).
INCONVENINETES: La luz UV está fuera del espectro visible y es poco penetrante (no atraviesa las lentes de vidrio), requiere lentes de cuarzo, mucho más caras. Poca utilidad.
MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA
Es una modificación del microscopio de luz ultravioleta. Se basa en el fenómeno de la fluorescencia, en el que un compuesto fluorescente absorbe radiación UV (no visible al ojo humano) y parte de la energía absorbida la emite en forma de radiación de menor energía (visible).
En la naturaleza hay pocos microorganismos que contengan compuestos fluorescentes, por lo que hay que emplear compuestos fluorescentes para marcar a los microorganismos (FLUOROCROMOS: FLUORESCEÍNA, RODAMINA, …) que cuando se iluminan con luz UV, emiten luz visible.
La principal aplicación del microscopio de fluorescencia es la en INMUNOFLUORESCENCIA, una técnica de diagnóstico microbiológico que utiliza anticuerpos, específicos para antígenos de microorganismos patógenos, marcados con un fluorocromo.
Se toma una muestra clínica del paciente (o un microorganismo) y se trata con los anticuerpos. Si el patógeno está presente se iluminará por el anticuerpo (diagnóstico positivo: emite luz visible al absorber la luz UV). Si la muestra no emite luz (está completamente oscura) el diagnóstico será negativo.
Hay técnicas de inmunofluerescencia directa (como la representada en la imagen) y de inmunofluorescencia indirecta. La indirecta se emplea más ya que no es necesario tener un anticuerpo especícico para identificar cada especie, si no que un solo antivuerpo tiene mayor variedad.
MICROSCOPIÍA ELECTRÓNICA (y otras)
Son muy caros, requieren técnicos especializados para utilizarlos. En lugar de rayos de luz emplea electrones, la trayectoria de los electrones se controla por campos magnéticos. Los e- tienen mucha frecuencia y mucha energía, una longitud de onda muy pequeña, por lo que el microscopio electrónico tiene mucho más aumento y menos poder de resolución, lo que permite ver las células mucho más grandes, además de estructuras intracelulares.
Se requiere de un tratamiento previo de las muestras complejo, pues las células son transparentes a los electrones, por lo que se debe tratar con alguna sustancia que impida el paso de los electrones (ej. Metales pesados).
OBSERVACIÓN DE PREPARACIONES EN FRESCO
Son muy sencillas, se coloca una suspensión del microorganismo entre el porta y el cubre, y se observa directamente al microscopio. Permite observar microrganismos vivos (movilidad microbiana, etc.).
La bacteria se mueve por que tiene flagelos, sin embargo, no es posible observarlos con microscopia óptica. Lo que si podemos observar es si son capaces de moverse o no. Conviene no confundir el movimiento de las bacterias con las corrientes que se puedan crear en la muestra (movimientos brownianos).
La observación es difícil en el microscopio de campo claro por la falta de contraste de los microorganismos. Por lo que hay que emplear baja intensidad de luz y el objetivo de 40 aumentos. Es más fácil la observación con el microscopio de campo oscuro o de contraste de fases
OBSERVACIÓN DE PREPARACIONES TEÑIDAS
Son más fáciles de observar, ya que se da un aumento del contraste al estar teñidos los microorganismos. Se emplean colorantes a la dilución adecuada, compuestos de color que tienen afinidad por algún componente presente en la estructura microbiana y se combina con el mismo, tiñendo al microrganismo (azul de metileno, violeta de genciana, fucsina básica, etc.).
Se observan con una buena intensidad de luz y con el objetivo de inmersión (100 aumentos, colocando aceite de inmersión sobre la preparación, lo que mejora la resolución). Un inconveniente es que no permiten observar microorganismos vivos.
Un colorante es una molécula capaz de absorber luz visible y reflejar parte de esta, deben tener la característica de quedar unidos a la superficie del microorganismo. Normalmente actúan muy rápido.
- TINCIÓN SIMPLE: Se emplea un solo colorante: todos los microorganismos se tiñen del mismo color. Da poca información: morfología y agrupaciones microbianas.
- TINCIÓN DIFERENCIAL: Se emplean dos colorantes, y entre ambas tinciones se intercala una etapa de decoloración que elimina, o no, el primer colorante. Permite observar diferencias entre los microrganismos (o partes de los mismos) que se tiñen de un color o de otro, lo que da información relevante sobre los mismos, dependiendo del tipo de tinción.
o Tinción de Gram
o Tinción de ácido-alcohol resistencia (AAR)
o Tinción de esporas - TINCIONES ESPECIALES (negativa, flagelos…)
TINCIÓN SIMPLE
Se extiende la muestra en el porta en una fina capa y se seca con calor suave. El secado debe realizarse sujetando el porta con la mano para notar el calor suave y que no alcance temperaturas muy elevadas.
A continuación se fija la muestra mediante la fijación por calor. En este paso el porta debe sujetarse con pinzas, ya que alcanza temperaturas muy elevadas. La llama debe ponerse azul al tener un alto contenido de oxígeno, y, a diferencia de la imagen, es una llama alta.
Las bacterias muertas por desnaturalización de las macroestructuras están adheridas al porta y se someten a una etapa de tinción con colorante durante unos minutos.
Por último, se lava el porta, se seca y se observa la muestra.
TINCIÓN DE GRAM
Es la tinción más importante en bacteriología, ya que permite distinguir a las bacterias en dos grupos: Gram-positivas y Gram- negativas.
Entre la tinción con el primer colorante (violeta de genciana) y el segundo (fucsina) se intercala una etapa de decoloración con alcohol. Este comportamiento frente a la tinción se debe a las diferencias que hay entre la pared celular de las bacterias.
- Las Gram-POSITIVAS se tiñen con el primer colorante (violeta) ya que resisten la etapa de decoloración con alcohol.
- Las Gram-NEGATIVAS se tiñen con el segundo colorante (rojo), ya que se decoloran con alcohol.
Esta tinción hay que hacerla con cultivos jóvenes, pues si se realiza en un cultivo viejo es posible que la pared celular de las bacterias esté alterada y de un resultado incorrecto. También es importante controlar el tiempo de decoloración para no alterar la pared celular de las gran-positivo y con ello el resultado.
TINCIÓN ÁCIDO, ALCOHOL RESISTENCIA
Se emplean dos colorantes: fucsina fenicada (rojo) y azul de metileno.
El primer colorante se aplica en caliente (emisión de vapores). Se hace así porque la pared celular de las bacterias resistentes son muy hidrófobas y resulta difícil teñirlas. Se intercala una etapa de decoloración con alcohol-HCl. Las bacterias AAR son resistentes a la decoloración (se tiñen de rojo), mientras que las demás bacterias (no AAR) se tiñen de azul, ya que se decoloran con alcohol-clorhídrico.
Tiene valor diagnóstico: sólo son AAR un grupo reducido de bacterias (Micobacterias: género Mycobacterium, que incluye patógenos humanos como M. tuberculosis y M. leprae). La presencia bacterias AAR en muestras de tejidos humanos o esputos es indicativa de infección por micobacterias.
Son bacterias Gram-positivas con un alto contenido el lípidos en su pared celular (ácidos micólicos), que las hace resistentes a la tinción (se necesita teñirlas en caliente), pero una vez teñidas ya no se decoloran con alcohol-HCl.
TINCIÓN DE ESPORAS
Se emplean dos colorantes: verde de malaquita (verde) y fucsina (rojo).
El primer colorante se aplica en caliente (emisión de vapores) por 10 minutos, después se intercala una etapa de decoloración con agua. Las esporas son resistentes a la
decoloración (se tiñen de verde), mientras que las formas no esporuladas de las bacterias (formas vegetativas) se tiñen de rojo, ya que se decoloran fácilmente con agua.
Las esporas son formas de resistencia producidas por algunas bacterias (como los géneros Clostridium y Bacillus, importantes en clínica por incluir a especies patógenas humanas: C. tetani, C. perfringens, C. botulinum, B. anthracis, B. cereus), que son difíciles de teñir. Para lograrlo hay que teñirlas en caliente al menos durante 10 minutos. Una vez teñidas, son resistentes a la decoloración.
TINCIÓN NEGATIVA
Es distinta a las anteriores, pues no se realiza la etapa de fijación. Se emplea un colorante negro (nigrosina o tinta china) que no se combina (no tiñe) a los microorganismos.
En un extremo del porta se mezcla la nigrosina con la suspensión del microrganismo, y se extiende sobre el porta (frotis), para conseguir una película de colorante que no cubra totalmente a los microorganismos. Se observa a 100 aumentos y con aceite de inmersión y se observan los microorganismos iluminados en un fondo oscuro (la luz solo pasa a través de los microorganismos, y no a través de la nigrosina).
Muy útil para la observación de bacterias con cápsula (estructura de tamaño considerable que rodea a la bacteria por fuera de la pared celular, no se tiñe con nigrosina y es muy refringente y fácilmente visible alrededor de la bacteria), la cual es característica de algunas bacterias patógenas.
