T12 - MUTACIÓN Y MUTANTES Flashcards
MUTACIÓN
Una mutación es un cambios o modificación en la secuencia del material genético (DNA), y por tanto heredables.
MUTACIONES ESPONTÁNEAS: son las que aparecen de manera natural, como consecuencia de errores en la replicación (DNA polimerasa): frecuencia muy baja y base del proceso evolutivo.
MUTACIONES INDUCIDAS: aparecen por la acción de agentes mutagénicos (físicos o químicos).
- Cepa salvaje (silvestre): microorganismo tal y como se aísla de la naturaleza.
- Cepa mutante: cepa derivada de una cepa salvaje por mutación.
- Mutante: cepas obtenidas en el laboratorio mediante mutagénesis inducida.
Los mutantes bacterianos son herramientas muy útiles para el estudio de la Fisiología y el Metabolismo bacteriano: la función de una proteína se puede conocer mediante mutación del gen que la codifica (proteína “mutada” no funcional) y estudio de fenotipo obtenido (fenotipo mutante).
Mediante mutagénesis inducida se pueden obtener mutantes en cualquier gen bacteriano. Los mutantes pueden clasificarse según su fenotipo: mutantes inmóviles (sin flagelo funcional), mutantes sin cápsula, etc.
MUTANTES NUTRICIONALES
Son cepas que, a diferencia de las cepas salvajes de las que provienen, necesitan de la adición de algún factor de crecimiento al medio de cultivo para poder crecer. Tienen una mutación en un gen que codifica para una enzima de la ruta de biosíntesis del compuesto que requieren como factor de crecimiento, ya que han perdido la capacidad se sintetizarlo (aminoácidos, bases nitrogenadas, …).
- CEPAS O MUTANTES AUXÓTROFOS necesitan para crecer más de una fuente de carbono: la fuente principal (glucosa, por ejemplo) y los compuestos que no pueden sintetizar.
- CEPA PROTÓTROFA: puede sintetizar todos los factores de
crecimiento a partir de una única fuente de carbono (glucosa): no requiere factores de crecimiento
(tiene una elevada capacidad de biosíntesis, no presenta auxotrofías).
Sirven para estudiar las rutas anabólicas de los aminoácidos y otros compuestos. El fenotipo mutante está en desventaja con respecto al salvaje, por lo que estos mutantes no sobreviven en hábitats naturales (contienen mutaciones negativas o deletéreas para la bacteria: no se seleccionan en la naturaleza). Normalmente se obtienen mediante mutagénesis inducida.
Su aislamiento no es fácil, ya que no existen condiciones de cultivo para su aislamiento directo (si el mutante auxótrofo crece, la cepa salvaje sin la mutación también crece).
OBTENCIÓN DE MUTANTES NUTRICIONALES
- Tratamiento de la cepa salvaje con un agente mutagénico: aumenta la frecuencia de mutación (habrá mutantes en cualquier gen).
- Selección: Aislamiento del mutante auxótrofo (por ejemplo, para el aminoácido lisina): METODO DE REPLICA EN PLACA.
Se aísla un número elevado de colonias en medio rico o completo (para que los mutantes nutricionales puedan crecer). De cada placa maestra se hacen dos réplicas: una en medio completo (con lisina) y otra en medio sin el factor de crecimiento de interés (sin lisina, en este ejemplo). Las colonias del mutante son las que no crecen en la placa sin lisina, y hay que identificarlas y obtenerlas en la placa de medio completo (con lisina) donde habrán crecido.
MUTANTES RESISTENTES
Son aquellos que tienen mutaciones que les confieren resistencia a antibióticos o a otras sustancias antimicrobianas. Son mutaciones que afectan a las dianas de los antibióticos (muchas de ellas con proteínas), de manera que la proteína mutada ya no interacciona con el antibiótico, y este deja de tener efecto.
El fenotipo mutante presenta una ventaja frente al no mutante (salvaje), ya que sólo el mutante puede crecer en presencia del antibiótico, por lo tanto su selección y aislamiento en mucho más fácil. Pueden seleccionarse (proliferar) en hábitats naturales, especialmente en presencia del antibiótico, que los selecciona.
Estos mutantes son muy útiles para estudiar las dianas de los antibióticos, el mecanismo de acción de los mismos, y los mecanismos de resistencia bacteriana a los antibióticos.
AISLAMIENTO DE MUTANTES RESISTENTES
Pueden aislarse mutantes espontáneos, o tras mutagénesis inducida. Su aislamiento es directo: mediante siembra en placas con el antibiótico de interés.
También puede hacerse por réplica en placa: en placas de medio sin y con antibiótico: los mutantes resistentes generan colonias en ambas placas, mientras que los no mutantes solo crecen en medio sin antibiótico.
MUTANTES LETALES CONDICIONALES
Los mutantes letales ha sufrido mutaciones en genes que codifican proteínas esenciales para la bacteria, y por lo tanto dichos mutantes no son viables, y no se pueden obtener (ejemplo: mutantes con una DNA polimerasa no funcional).
Los MUTANTES LETALES CONDICIONALES: son mutantes en el fenotipo mutante (letal) solo se expresa en unas condiciones determinadas (condiciones restrictivas), pero no se manifiesta en otras (condiciones permisivas), de manera que el mutante se puede cultivar con normalidad en condiciones permisivas y estudiar su fenotipo en condiciones restrictivas.
Permiten estudiar procesos esenciales para la vida celular (replicación del DNA, síntesis de RNA, y otros).
Frecuentemente las condiciones permisivas o restrictivas dependen de la temperatura, por ejemplo, temperatura permisiva 37ºC y temperatura restrictiva 42ºC (MUTANTES TERMOSENSIBLES: un aumento de temperatura es letal ya que permite la manifestación del fenotipo mutante).
OBTENCIÓN DE MUTANTES LETALES CONDICIONALES
Tras la mutagénesis, se aíslan colonias en placas a 37ºC, y se hacen réplicas en el mismo medio, incubándose a 37ºC y 42ºC.
Las colonias que crecen a 37ªC, pero no a 42ºC son las que tienen alguna mutación letal condicional, que se expresa a 42ºC, pero no a 37ºC.
MUTACIONES PUNTUALES
Son aquellas en las que se produce el cambio de una base por otra en la secuencia de un gen. No hay modificación en el número de bases. Según el tipo de cambio, se pueden distinguir tres tipos:
- MUTACIÓN SILENCIOSA: el cambio de secuencia no afecta a la proteína (el codón mutado y el no mutado codifican el mismo aa). Normalmente ocurren en la tercera base de los codones o tripletes. No afectan al fenotipo.
- MUTACIÓN CON CAMBIO DEL AMINOÁCIDO CODIFICADO: la proteína mutante y la salvaje difieren en un aminoácido (el codón mutado cambia el aminoácido codificado). La proteína del mutante puede ser funcional o no, dependiendo de la importancia del cambio de aa (puede inactivarse y generar un fenotipo mutante, mantener su funcionalidad
sin cambio en el fenotipo, o generar un mutante condicional). - MUTACIÓN SIN SENTIDO: la mutación genera un triplete/codón de terminación de la traducción (no codifica ningún aminoácido), generando proteínas truncadas en su extremo carboxi-terminal. Genera proteínas truncadas, no funcionales normalmente (la porción de proteína producida depende de la posición de la mutación dentro de la secuencia codificante del gen).
DELECIONES Y/O INSERCIONES
Mutaciones causadas por la adición/ganancia (INSERCIONES) o pérdida (DELECIONES) de nucleótidos en la secuencia del DNA. Pueden tener un tamaño variable: de un solo nucleótido, hasta cientos o miles). Suelen tener siempre consecuencias fenotípicas: la proteína codificada por el gen mutante no es funcional.
La inserción o deleción de una sola base cambia la pauta de lectura durante la traducción, de manera que desde ese punto la secuencia de aminoácidos es distinta y probablemente el ribosoma encuentre codones de terminación que en la secuencia original no están en fase.
La inserción/deleción de tres nucleótidos implica que la proteína tiene un aminoácido de más o de menos, pero se mantiene la pauta de lectura durante la traducción.
La deleción de fragmentos grandes de DNA provoca la inactivación del gen (a la secuencia codificante le faltan trozos), y la inserción de grandes fragmentos de DNA dentro de las regiones codificantes de los genes provoca también su inactivación (genes interrumpidos o disrupcionados).
MUTACIONES CAUSADAS POR ELEMENTOS GENÉTICOS MÓVILES
Mutaciones causadas por TRANSPOSONES (elementos genéticos móviles) integrados en el cromosoma bacteriano, que tienen la capacidad de saltar (moverse) de una localización cromosómica a otra (con un tamaño variable, entre una y varias kilobases, aproximadamente).
La proteína que realiza el proceso es la TRANSPOSASA y tiene actividad endonucleasa y ligasa: corta y une DNA. Codificada por el propio transposon , en un fragmento de DNA flanqueado por pequeñas repeticiones invertidas. (Secuencias de inserción, frecuentes en el cromosoma bacteriano).
Los transposones causan mutaciones por INSERCIÓN, ya que el gen en el que se insertan queda inactivado (interrumpido o disrupcionado).
Pueden contener otros genes (flanqueados por secuencias de inserción con el gen de la transposasa) que codifican para proteínas, que frecuentemente están implicadas en la resistencia a los antibióticos.
Los transposones también pueden estar presentes en plásmidos. Son muy frecuentes en los seres vivos, y NO se pueden replicar independientemente del cromosoma.
Los transposones se pueden emplear en biología molecular para conseguir mutantes concretos.
REVERSIÓN DE MUTANTES
Se refiere a la recuperación del fenotipo original (salvaje) a partir de un mutante (fenotipo mutante). Normalmente la reversión se debe a una segunda mutación, en el mismo gen, que anula a la primera (el mutante muta, y recupera el fenotipo salvaje).
- Las mutaciones puntuales son las que revierten más fácilmente: el codón mutado sufre una segunda mutación generando el codón original o un codón que codifica para el aminoácido original.
- Las mutaciones por inserciones o deleciones pueden revertir por una deleción (en el caso de inserciones), o inserción (en el caso de deleciones) que restaure la secuencia original o salvaje.
- La reversión por mutaciones debidas a la inserción de elementos genéticos móviles se produce cuando el transposon salta a una nueva localización, dejando de nuevo intacto el gen interrumpido, que recupera así estado inicial previo a la inserción del transposon (“deleción del transposon”).
En ocasiones, ocurre una segunda mutación distinta a la mutación original (en un gen distinto), que anula el fenotipo mutante de la primera: reversión intergénica (para diferenciarla de las anteriores: reversiones intragénicas).
AGENTES MUTAGÉNICOS
Son agentes (físicos o químicos) que promueven o facilitan la aparición de cambios en la secuencia del DNA: aumentan la frecuencia de las mutaciones. En humanos (mamíferos) el concepto de mutágeno es equivalente a carcinógeno (los agentes mutagénicos son capaces de provocar mutaciones responsables de la aparición de tumores/cánceres). Son muy variados, y tienen diferentes mecanismos de inducción de la mutación.
- ANÁLOGOS DE LAS BASES NITROGENADAS: moléculas estructuralmente parecidas a las bases nitrogenadas, que son incorporadas a la estructura del DNA en su lugar (sustituyen a la base), pero que durante la replicación hibridan con bases distintas.
- SUSTANCIAS QUE REACCIONAN QUÍMICAMENTE CON EL DNA, modificando las bases nitrogenadas, y alterando su capacidad de hibridar con las bases complementarias (ácido nitroso: desamina la adenina; hidroxilamina: modifica la citosina) o provocando su eliminación del ADN y su sustitución al azar por otras bases (agentes alquilantes: etilmetano sulfonato, metiletano sulfonato).
- AGENTES INTERCALANTES (acridinas: bromuro de etidio): moléculas planas que se intercalan entre las bases del DNA, distorsionan su esructura y suelen causar inserciones de una base (cambio en la pauta de lectura).
- RADIACIÓN UV
Mutagénesis inducida por la presencia de 5 BromoUracilo en el medio
El 5BrU es un análogo estructural de la timina (tiene -Br en lugar de -CH3 en la posición 5). Se incorpora al DNA, pero puede hibridar con adenina (como la timina) y también con la guanina. Induce mutaciones puntuales (cambia AT por GC). Este cambio puede ocurrir en cualquier punto del DNA que haya una timina.
Mutagénesis inducida por radiación ultravioleta (UV)
La radiación UV (λ: 260-275 nm) es absorbida por el DNA, en concreto por la timina, lo que provoca cambios en su estructura. El más conocido es la formación de DÍMEROS DE TIMINA.
Cuando hay dos timinas adyacentes absorben radiación UV y se forman dímeros de timina (las dos timinas se unen mediante enlaces covalentes, que no están presentes en las bases del DNA, que solo están unidas covalentemente a la desoxirribosa). La formación de estos dímeros de timina distorsiona la estructura del DNA e interfiere con la replicación, por lo que deben ser eliminados rápidamente para garantizar la viabilidad celular.
Cuando hay daños importantes en el DNA (como los dímeros de timina) se activa un sistema de reparación de emergencia (SOS) en que intervienen tres actividades enzimáticas: una ENDONUCLEASA (DNAsa) que elimina de la cadena el dímero de timina y zonas adyacentes (dejando zonas monocatenarias); una DNA POLIMERASA que rellena estos huecos monocatenarios, sintetizando la cadena complementaria (previamente degradada), y una DNA LIGASA que une los extremos de la secuencia sintetizada de nuevo.
La respuesta SOS debe reparar muy rápidamente una gran cantidad de dímeros de timina, y la DNA polimerasa que participa en esta respuesta de emergencia tiene una baja fidelidad (actúa rápidamente, pero introduce errores con una frecuencia muy superior a la de la DNA polimerasa que replica el cromosoma).
Por tanto, las MUTACIONES PUNTUALES producidas por la radiación UV son consecuencia de los MECANISMOS DE REPARACIÓN. A altas dosis de radiación UV es LETAL por ACÚMULO DE MUTACIONES (LÁMPARAS GERMICIDAS). A bajas dosis, la radiación UV ES MUTAGÉNICA.
TEST DE AMES
Es un modelo bacteriano para determinar el poder mutagénico (carcinogénico) de una sustancia. Es muy rápido y barato.
Emplea una cepa de Salmonella thyphimurium auxótrofa para la histidina (histidina negativo o histidina-) que no puede sintetizar histidina y requiere ese aminoácido para crecer. La cepa tiene una mutación puntual en un gen que codifica una enzima de la ruta de biosíntesis.
Se cuantifica la frecuencia de reversión de la mutación en presencia de la sustancia en estudio. Los revertientes histidina + pueden crecer en ausencia del aminoácido, mientras que la cepa original (histidina-) no puede crecer sin histidina.
Cuanto más mutagénica sea una sustancia, mas revertientes histidina + se obtendrán (se hace de esta manera por que el “mutante” revertiente se selecciona fácilmente).
Si la frecuencia de reversión en presencia del compuesto es superior a la reversión espontánea (sin sustancia problema, control negativo), indica que el compuesto es mutagénico. La reversión a histidina+ se emplea como indicador de las mutaciones generadas.
Las placas contienen una pequeña cantidad de histidina, insuficiente para que los auxótrofos histidina puedan generar colonias, pero si para que se puedan dividir (replicar su DNA) durante unas generaciones y pueda ejercer su efecto mutagénico la sustancia en estudio. En una placa solo se puede ensayar una concentración de sustancia problema.
