T02. Técnicas biomoleculares

Question 1

¿Cuál es la estructura de los ácidos nucleicos?

Answer 1

ADN y ARN

Question 2

Tipos Nucleótidos

Answer 2

Pirimidinas (C, U, Deoxitimidina) y Purinas (Adenina y Guanina)

Question 3

¿Qué enlace forma la cadena de ácidos nucleicos?

Answer 3

Enlace Fosfodiéster

Question 4

¿Qué tipo de enlaces hay entre dos cadenas de aminoácidos (ADN o ARN)?

Answer 4

Enlaces de puente de hidrógeno

Question 5

Procesos División celular / Expresion génica

Answer 5

Sólo en división celular - Replicación (ADN a ADN)
Sólo en expresión génica - Transcripción (ADN a ARN) + Traducción (ARN a proteína)

Question 6

Historia de la PCR

Answer 6

• Fue desarrollada en 1983 por Kary Mullis
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• El primer anuncio de la PCR se hizo en octubre de 1985
• En 1986, Edward Blake (científico forense) colaboró con el FBI para aplicar el proceso de PCR para una evidencia criminal
• Los derechos de la PCR se vendieron a Hoffman- La Roche el 23 de Julio de 1991
• Premio Nobel en química en 1993
• La técnica de PCR ha revolucionado la biología molecular moderna

Question 7

¿Qué es la PCR?

Answer 7

• Es un proceso in vitro que detecta identifica, y copia (amplifica) un fragmento específico de ADN de una muestra biológica
• Es una técnica biomolecular que puede producir muchas copias de un mismo fragmento de AND o ADN molde

Question 8

Campos científicos usos de la PCR + Aplicaciones

Answer 8

• Agricultura , arqueología, medicina, biología molecular, botánica, biología celular, criminología…
• Aplicaciones:
- Secuenciación de ADN
- ADN recombinante
- Detectar patógenos en alimentos (ej. Salmonella, E.coli…)
- Detectar la causa de un infección o enfermedad (virus, bacteria)

Question 9

Componentes en una reacción de PCR (6)

Answer 9

• ADN molde a amplificar
• Par de cebadores/iniciadores sentido y antisentido (en inglés “primers”, “sense and antisense” o “forward y reverse”)
• ADN polimerasa termoestable (TaqPol)
• dNTPs (desoxyribonucleótidos)
• Tampón para mantener el pH y proporcionar Mg2+
• Termociclador

Question 10

Componentes PCR (ADN MOLDE)

Answer 10

• Es la secuencia de ADN que se quiere copiar. También se le puede llamar ADN diana.
• El fragmento a amplificar (copiar) es una pieza de ADN de unas ~50 a ~4000 pares de bases de largo
• El ADN que se quiere copiar se tiene que aislar previamente del organismo

Question 11

Componentes PCR (PAR DE CEBADORES DE ADN)

Answer 11

• En una célula (in vivo), los cebadores son cortas cadenas de ADN que sirven de punto de inicio en la replicación del ADN
• En la reacción de PCR (in vitro), los cebadores son cortas cadenas sintéticas de ADN (cadena única, ssDNA) que son complementarias al inicio y al final de la secuencia molde que se quiere amplificar
• Cebadores sentido y antisentido (forward and reverse primers)

Question 12

¿Cómo diseñar buenos primers? (Componentes PCR)

Answer 12

• Evitar la presencia de la capacidad de dimerización entre cebadores o la formación de “hairpin” que se forman por complementariedad entre bases de >3bp
• Temperatura de fusión o hibridación (melting temperature)(Tm)entrelos55-65oC
• Evitar repeticiones de Gs y Cs más largas de 3 bases, especialmente en el extremo 3’
• Longitud del cebador: >17 bp
• Verificar la especificidad usando herramientas como el BLAST (NCBI)

Question 13

Componentes PCR (POLIMERASA ADN)

Answer 13

• Polimerasa construye una nueva cadena de ADN en dirección 5’ - 3’
• Necesita reconocer ADN de doble cadena, por eso se necesitan los cebadores
• La nueva molécula sintetizada será complementaria al ADN molde e idéntica a la cadena hermana de la cadena molde.
• La ADN polimerasa tiene que ser termoestable debido a que en la técnica de PCR se utilizan elevadas temperaturas
• Una de las ADN polimerasa más utilizadas es la Taq polimerasa, ya que proviene de la bacteria Thermus aquaticus (en aguas termales)

Question 14

Componentes PCR (dNTPs)

Answer 14

• dNTPs (desoxinucleótidos) son los elementos básicos en la reacción de PCR
• Son los monómeros que la ADN polimerasa utiliza para formar el ADN. Son las bases de A, T, G y C necesarias para construir la nueva cadena de ADN

Question 15

Componentes PCR (Tampón)

Answer 15

• La Taq polimerasa necesita Mg++ para funcionar correctamente, como muchos enzimas
• La concentración de iones de magnesio se necesita optimizar para cada ADN molde y combinación
de cebadores
• Poco magnesio podría producir poco producto de PCR y demasiado magnesio podría producir producto indeseado
• Además, mantiene el pH

Question 16

Reacción PCR (1er ciclo) - Funcionamiento

Answer 16

Es un proceso de 3 pasos
Cada paso tiene lugar a diferente temperatura
• Paso 1 - Desnaturalización
• Paso 2 - Hibridación
• Paso 3 - Extensión
El primer ciclo de una PCR resulta en la síntesis de productos largos

Question 17

Reacción PCR (1er ciclo) - Desnaturalización

Answer 17

El calor por encima de los 90oC rompe los puentes de hidrógeno entre los nucleótidos de las cadenas dobles de ADN. Éstas se separan en dos hebras de cadena simple

Question 18

Reacción PCR (1er ciclo) - Hibridación

Answer 18

El cebador se une a su diana complementaria
Se reduce la temperatura a ≈ 50-65oC (la temperatura de hibridación dependerá de la longitud de los cebadores y del contenido de G-C

Question 19

Reacción PCR (1er ciclo) - Extensión

Answer 19

La temperatura se incrementa a ≈ 72-74oC (temperatura ideal para la Taq pol)
La Taq pol se une a la cadena doble de ADN que se ha creado por la hibridación de los cebadores con el ADN molde y comienza a copiar y añadiendo nucleótidos en sentido 5’-3’
La extensión ocurre en las dos hebras ya que tenemos los 2 cebadores (forward y reverse)

Question 20

Reacción PCR (1er ciclo) - Uso del termociclador

Answer 20

Los termocicladores tienen unos bloques de metal con orificio donde se introducen los tubos para la reacción de PCR.
El termociclador incrementa la temperatura del bloque de metal y luego la reduce en cada paso (desnaturalización ~95 ͦ C, hibridación ~55 ͦ C y extensión 72º C)

Question 21

Múltiples ciclos en una PCR - Amplificación Exponencial de una secuencia de ADN molde

Answer 21

• Al final del primer ciclo de la PCR, se producen dos nuevas hebras idénticas a la secuencia original molde
• Desde el 2o y 3er ciclo, se sintetizan los productos cortos de las secuencias
• La PCR se realiza durante múltiples ciclos (30-40)
• Crecimiento exponencial: no de copias =2n (n es el número de ciclos)

Question 22

¿Se puede contaminar la reacción PCR con otros ADN)

Answer 22

Sí

Question 23

Tipos fuentes contaminación en reacción PCR

Answer 23

➢ De la persona que está realizando la reacción
➢ De los tubos empleados en la reacción
➢ De los enzimas, tampones o agua utilizados en la reacción

Question 24

Validación Fuentes Contaminación PCR

Answer 24

✓ Hacer un control negativo (sin ADN) para validar que el producto de PCR se ha amplificado del ADN molde y no de otros ADN contaminantes
✓ Un control positivo utilizando un ADN control con unos cebadores validados que ayuden a identificar no solo el fragmento de ADN sino también confirmar que las condiciones de la reacción y el termociclador funcionan correctamente

Question 25

Análisis de PCR (Electroforesis)

Answer 25

• Al final de la reacción de la PCR, hay muchísimo producto amplificado del ADN molde comparado con el inicio de la reacción. BILLONES de copias
• Ahora la muestra es suficientemente grande para ser vista en un gel y ser analizada
• Generalmente, se utilizan geles de agarosa para analizar fragmentos de ADN, aunque también se pueden utilizar de poliacrilamida

Question 26

Medidas por electroforesis (distancia migración)

Answer 26

• En un gel de agarosa, la distancia de migración (D) es proporcional al logaritmo de su tamaño molecular (M). (a y b son constantes que dependen de las condiciones de electroforesis

Question 27

Medidas por electroforesis (concentración gel)

Answer 27

Cambiando la concentración de agarosa del gel, podemos conseguir una resolución diferente de tamaños de ADN.
Las bandas pueden estar más próximas o más lejanas las unas de las otras simplemente cambiando el % de agarosa

Question 28

Medidas por electroforesis (estimación tamaño fragmentos)

Answer 28

Para estimar el tamaño de los fragmentos en un gel de agarosa, necesitaremos utilizar marcadores de peso molecular con fragmentos de ADN conocidos
Ejemplo: HindIII es un enzima que corta el ADN linear del fago lambda en fragmentos dentro de un rango entre 125bp y 23kb
Podemos estimar a simple ojo el tamaño de nuestro fragmento de ADN
Además, en un gel de agarosa, la intensidad de las bandas también nos indica la cantidad de ADN presente en la muestra, siendo de más intensidad aquellas bandas con mayor presencia (o cantidad)

Question 29

Ejemplos de geles de agarosa (Smear o barrido del ADN)

Answer 29

Son las líneas que aparecen intercaladas en el gel de electroforesis
Se debe a la degradación del ADN (muestra no fresca, no almacenada correctamente o por un largo tiempo)

Question 30

Ejemplos de geles de agarosa (Diferentes productos)

Answer 30

En vez de obtener una única banda que correspondería a un único producto de PCR de nuestro ADN molde, se obtienen diferentes bandas de distintos tamaños
Esto se debe a que las condiciones no son adecuadas (temperatura, tampón) o bien que los cebadores no están bien diseñados y reconocen otras secuencias del ADN, dando lugar a fragmentos más largos o más cortos como resultado de la amplificación por PCR

Question 31

Analizar expresión génica por PCR

Answer 31

• Si queremos analizar la expresión de un gen en proteína, se puede hacer de dos maneras:
1. Detectar la proteína (método directo).
2. Detectar la secuencia de mARN (método indirecto)

Question 32

Si optamos por la detección indirecta, podríamos aislar el mARN y amplicarlo por PCR para poderlo detectar y analizar.
Pero mARN es ácido ribonucleico (ARN) y no podemos realizar la PCR. ¿Por qué?

Answer 32

La PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) se utiliza para amplificar secuencias de ADN, no de ARN. La PCR requiere ADN como molde para sintetizar nuevas cadenas de ADN complementarias. Sin embargo, el ARN puede ser convertido en ADN mediante una técnica llamada transcriptasa inversa (RT), que utiliza la enzima transcriptasa inversa para sintetizar una cadena de ADN complementaria al ARN.

Question 33

Analizando la expresión génica por PCR (mirar componentes)

Answer 33

✓ ADN molde a amplificar
✓ Par de cebadores (forward y reverse)
✓ ADN polimerasa termoestable (TaqPol)
✓ dNTPs (desoxirribonucleótidos)
✓ Tampón de pH y Mg+
✓ Termociclador

Question 34

cDNA (def.)

Answer 34

El cDNA (ADN copia) es la copia del mRNA pero en ADN.
Este cDNA no contiene intrones ya que el mRNA maduro ya habrá sufrido splicing alternativo

Question 35

Componentes en una reacción RT-PCR

Answer 35

✓ mRNA
✓ Hexámeros aleatorios y/o OligodT
✓ Transcriptasa inversa
✓ dNTPs (desoxirribonucleótidos)
✓ Tampón de pH y Mg+
✓ Termociclador

Question 36

Retrotranscripción (RT-PCR) (mARN)

Answer 36

Aislar y purificar el mARN de las células
Si las células están intentan producir una proteína, el paso intermediario es la transcripción
Por lo tanto, la cantidad de mARA será de alguna manera, directamente proporcional a la cantidad de proteína

Question 37

Retrotranscripción (RT-PCR) (Hexámeros aleatorios)

Answer 37

• Todas las polimerasas (ADN o ARN polimerasas) necesitan reconocer ADN/ADN o ADN/ARNA de doble cadena para empezar la polimerización
• En las transcripción inversa, se incluyen pequeñas secuencias de 6 nucleótidos. Todas las secuencias son diseñadas aleatoriamente y se unirán inespecíficamente a diferentes puntos del mARN
• De este modo crearemos híbridos de ARN y hexámeros de doble cadena que la polimerasa podrá reconocer
• Cuando el mRNA es modificado durante la maduración, éste lleva asociado una cola de poliadenina (poliA) al final de la secuencia de mRNA.
• Si utilizamos secuencias de oligonucleótidos de timidina (oligodT) también podemos crear una doble cadena al final del mARN que será donde se una la polimerasa

Question 38

Retrotranscripción (RT-PCR) (Retrotranscriptasa)

Answer 38

Se encuentra naturalmente en virus
Los virus cuyo contendido genético está en forma de ARN, necesitan un retrotranscriptasa para crear ADN y poder integrase en el genoma de la célula huésped

Question 39

Retrotranscripción (RT-PCR) (dNTPs)

Answer 39

dNTPs (deoxyribonucleótidos) son los “ladrillos” de la reacción de PCR.
Son los monómeros que las polimerasas utilizan para formar una cadena complementaria a la molde

Question 40

Retrotranscripción (RT-PCR) (Tampón)

Answer 40

Para mantener el pH y proporcionar Mg2+

Question 41

Pasos en la RT-PCR

Answer 41

Cada paso sucede a una temperatura diferente Sólo un ciclo
Paso 1: Desnaturalización de estructuras secundarias del mARN y RH a 70oC, 5min
Paso 2: Extensión a 42oC 1h
Paso 3: Inactivación de la retrotranscriptasa y desnaturalización del producto mRNA-cDNA a 70oC, 5 min

Question 42

Conceptos claves de la PCR a tiempo real

Answer 42

• PCR convencional. El producto amplificado se detecta solo al final de la reacción, migrando el ADN en un gel de agarosa después de que la reacción haya terminado
• La PCR a tiempo real permite detectar y mediar la acumulación del producto amplificado durante el progreso de la reacción, “real time” PCR
• En una qPCR se utiliza fluorescencia para detectar la cantidad de ADN que se sintetiza al final de cada ciclo
• La PCR a tiempo real es un técnica cuantitativa, por eso también se la llama qPCR (quantitive PCR)

Question 43

Conceptos claves de la PCR a tiempo real
Hay dos maneras de seguir la síntesis del producto a tiempo real

Answer 43

• Usando un colorante fluorescente como SYBR® Green: esta molécula emite una señal fluorescente cuando se une a ADN de doble cadena
• Sonda reportera o “quencher”: pequeño oligonucleótidos que reconocen el ADN molde específicamente y que son liberados por la ADN polimeras. Al liberarse, emiten fluorescencia

Question 44

SYBR® Green. Double stranded DNA fluorescent dye (pros & cons)

Answer 44

❖ Ventajas
Económico
No necesita sonda (quencher)
Útil para curvas de fusión (melting curves)
❖ Desventajas
Se une inespecíficamente a todo ADN que sea de doble cadena

Question 45

Sonda reportera o “quencher” (pros & cons)

Answer 45

❖ Ventajas
Se une específicamente al ADN molde
Resultados muy fiables
No hay interferencias con otros ADN
No necesita curvas de fusión
❖ Desventajas
Muy caro

Question 46

¿Cómo funciona Sonda reportera o “quencher”?

Answer 46

• La señal de fluorescencia es proporcional a la cantidad de product amplificada en el tubo
• El product de PCR se duplica en cada ciclo
• Los components de la reacción se consumen y se encuentran limitados

Question 47

PCR a tiempo real (cuantitativa, qPCR) (Análisis resultados)

Answer 47

Ct = número de ciclos para llegar a determinado nivel de fluorescencia (threshold)
Se comparan los valores de Ct de cada una de las muestras mediante el método comparativo de Ct (2-ΔΔCt):
CT1<CT2 <… <CT6
Una muestra con gran presencia de un gen determinado, presentará un Ct pequeño (necesita menos ciclos
para llegar al threshold)
Una muestra con poca presencia de un gen determinado, presenter un Ct grande (necesita más ciclos para llegar al threshold)

Question 48

SYBR® Green (melting curve)

Answer 48

Mala amplificación por:
- Primers mal diseñados
- Primers con estructuras secudarias
- Unión inespecífica de los primers
- Contaminación de ADN externo
Pero no se puede saber qué ha pasado
Se puede hacer un gel de agarosa y ver qué productos hay