T01. Cultivo Celular (aislamiento de ácidos nucleicos y proteínas)

Question 1

Para analizar las células…

Answer 1

primero hay que obtenerlas.

Question 2

¿De qué manera se pueden obtener las células?

Answer 2

De los tejidos de forma in vivo o de cultivos celulares in vitro

Question 3

¿De dónde pueden provenir los cultivos celulares?

Answer 3

▪ Tejidos que han sido digeridos y luego cultivados (cultivos primarios). Estos pueden no dividirse in vitro (e.g. neuronas) o dividirse en un número definido de veces (líneas celulares contínuas)
▪ Células a las que han modificados los telómeros y se dividen indefinidamente (líneas celulares inmortales)

Question 4

Tipos Cultivos Celulares (simple)

Answer 4

Cultivos primarios y Líneas celulares

Question 5

Cultivos Primarios (características)

Answer 5

Se obtienen de biopsia o animal sacrificado
100% cariotipo original
Formado por células indiferenciadas que se diferenciarán de forma similar al tejido que le dio origen
Su duración es aprox. 7 días
1 solo pasaje (subcultivo)

Question 6

Líneas Celulares (características)

Answer 6

Provienen de un cultivo primario que ha sido sometido a procesos que le conferirán capacidad ilimitada de multiplicación o de origen tumoral
Aneuploides (falta de uno o más cromosomas)
Están formadas por células que se diferencian genética y morfológicamente de las células de las cuales se originaron
Proliferan de forma ilimitada
Varios pasajes

Question 7

¿Qué enzima se observó que tenían las células tumores (mediante líneas celulares)?

Answer 7

Telomerasa

Question 8

Telomerasa (características)

Answer 8

Telomerasa es una ADN polimerasa (añade nucleótidos al ADN) y evita la acortamiento de los telómeros.

Question 9

Líneas celulares (mercado)

Answer 9

En el mercado hay muchas líneas celulares ya establecidas
Las hay de muchos organismos (humanas, ratón, rata, primate…)

Question 10

Líneas celulares + Fuente (Humano)

Answer 10

HeLa - Células epiteliales cervicales
Hep-G2 - Cáncer hígado
Saos-2 - Cáncer hueso
HEK 293 - Células embrionarias de riñón

Question 11

Líneas celulares + Fuentes (Rata)

Answer 11

PC12 - Cáncer médula adrenal. Precursor neuronal
MC3T3-E1 - Precursor de osteoblastos
C2C12 - Precursor de mioblastos

Question 12

Condiciones para cultivos celulares (Condiciones estándares) (7)

Answer 12

✔ Medio de cultivo esencial (MEM, DMEM, ⍺-MEM, F12, RPMI 1640…)
✔ Suplementos (opcional): FBS, antibióticos (penicilina-estreptomicina), antimicóticos, factores de crecimiento..
✔ Incubador (95% O2, 5 % CO2, 37oC y control de humedad)
✔ Campana de flujo laminar (esterilidad)
✔ Baño de agua a 37oC
✔ Microscopio
✔ Centrifugadora

Question 13

Aislamiento celular (Condiciones estándares)

Answer 13

✔ Una vez aisladas se puede puede hacer un subcultivo (replaquear), contar las células y utilizarlas a la densidad deseada, o utilizar para su análisis.
✔ Algunas veces su análisis no requerirá disociación, se hará in situ (tinciones, immunocitoquímica…) y requerirán fijación con PFA (paraformaldehido), glutaraldehido, etanol..

Question 14

¿Qué instrumento se usa para contaje de células en aislamiento celular?

Answer 14

Contaje de células con cámara de Neubauer (mirar vídeo, link en presentación)

Question 15

Lisis Celular (tipos de moléculas)

Answer 15

Proteínas, carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos

Question 16

Lisis celular - Homogenización (ruptura o lisis celular)

Answer 16

Para poder aislar cualquier tipo de molécula y en especial aquellas que se encuentran en el interior de la célula, será necesario una lisis o ruptura de la membrana plasmática

Question 17

Métodos Homogenización (ruptura o lisis celular)

Answer 17

MECÁNICOS - Homogeneizador / Ultrasonidos / Trituración mecánica (Molino de bolas de acero o vidrio) / Mortero / Congelación
NO MECÁNICOS - Permeabilización / Solubilización / Enzimas / Shock osmótico / Tratamiento alcalino

Question 18

Métodos mecánicos para lisis celular

Answer 18

✔ Homogeneizadores
- Batidora / Homogeneizador manual / Homogeneizador rotor de cuchillas o de émbolo / Stomacher (homogeneización)
✔ Ultrasonidos
- Sonicador
✔ Molino de bolas
✔ Mortero
✔ Congelación

Question 19

Métodos no mecánicos para lisis celular (Permeabilización y solubilización)

Answer 19

Alteran la estructura de la membrana celular para facilitar la difusión de moléculas hacia el exterior (permeabilización) o capacidad de solubilizar los lípidos de la membrana celular. Es uno de los métodos más utilizado:
⮚ Los detergentes tienen una zona hidrofílica y otra hidrofóbica, por esta razón pueden interactuar tanto con el agua como con los lípidos.
⮚ Se forman micelas de los lípidos de la membrana y se forman poros en la membrana

Los detergentes más utilizados son de tres tipos:
Detergentes aniónicos: SDS (Dodecil Sulfato de Sodio) Catiónico: Bromuro de Catiltrimetil Amonio (CTAB) No-iónico: Triton X‐100
Métodos:
• Cambiando la concentración del detergente podemos obtener diferentes efectos:
- Baja concentración se solubiliza la membrana y deja entrar o salir moléculas
- Alta concentración se rompe completamente la membrana y se produce una lisis celular

Question 20

Métodos no mecánicos para lisis celular (Enzimas)

Answer 20

Existen enzimas que pueden hidrolizar la membrana celular de microorganismos. Cuando la membrana ha sido suficientemente permeabilizada, algunos compuestos intracelulares pueden ser liberados al medio.

Question 21

Métodos Enzimas (métodos no mecánicos para lisis celular) (microorganismo / enzima / efecto)

Answer 21

1. Bacterias / Lisozima / Ruptura de los enlaces beta-1,4 entre N-acetil murámico y N-acetil glucosamida
2. Levaduras / Complejo glucanasa-mananasa / Rompe la capa de glucano y de manano
3. Células de plantas / Celulosas y peptinasas / Rompen capa de celulosa y peptino

Question 22

Métodos no mecánicos para lisis celular (Shock osmótico)

Answer 22

Es uno de los métodos más simple:
1. Las células se colocan en un volumen de agua 2 veces mayor que el volumen de células
2. Bajo estas condiciones las células se hinchan, debido a un simple flujo osmótico que se produce debido a que las células contienen solutos (los causantes del flujo osmótico de agua al interior de la célula).
3. Las células se hinchan y algunas llegan a reventarse.
La susceptibilidad de las células es relativa y depende fuertemente de su tipo

Métodos: Hipertónico / Isotónico / Hipotónico

Question 23

Métodos no mecánicos para lisis celular (Tratamiento alcalino (NaOH))

Answer 23

Su uso produce la saponificación de los lípidos y por tanto disrupción de la membrana y de la pared celular (bacterias)

No se suele utilizar mucho ya que una concentración muy alta puede producir la desnaturalización de las proteínas y perder así el producto a analizar.

Se utiliza sobretodo en la extracción de plásmidos (ADN circular bacteriano), ADN y RNA. Rompe los puentes de hidrógeno entre las bases pasando de doble cadena a cadena simple. Pero se necesita un detergente como SDS para romper primero la membrana.

Question 24

Purificación de ácidos nucleicos y proteínas (Centrifugación) (4)

Answer 24

✔ En ocasiones se debe hacer una centrifugación para remover fragmentos de membrana o restos no deseados
✔ No necesario siempre que no se quiera analizar algún componente de la membrana
✔ Centrifugación diferencial o de gradiente
✔ Se utilizarán ultracentrífugas para separar fracciones celulares (membrana, citoesqueleto, mitocondrias, núcleo, vesículas…)

Question 25

Tipos Centrifugación (Purificación de ácidos nucleicos y proteínas)

Answer 25

Rotor fijo
Rotor oscilante o basculante
Centrifugación diferencial

Question 26

Purificación de ácidos nucleicos (Ácidos nucleicos)

Answer 26

Núcleo: ADN y ARNm Citoplasma: ARNm, ARNr, ARNt
Dependiendo de qué quiera obtener, tendré que romper, no sólo la membrana plasmática sino también la membrana nuclear

Question 27

Métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicos (dos aproximaciones para purificar AN)

Answer 27

Existen dos aproximaciones para purificar los ácidos nucleicos:
1. Degradación de los otros componentes o contaminantes con una mezcla de reactivos
2. Separación de la mezcla en diferentes fracciones, una de las cuales serán los ácidos nucleicos

Question 28

Métodos más utilizados actualmente para extracción y purificación de ácidos nucleicos (7)

Answer 28

• Precipitación con etanol
• Fenol-cloroformo
• Cromatografía (intercambio iónico o afinidad)
• Cromatografía con partículas de sílica
• Partículas magnéticas con capa de sílice
• Centrifugación (diferencia de tamaño y gradiente de densidad- EtBr-Cs)
• Alcalinidad

Question 29

Precipitación con etanol (métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicos)

Answer 29

Si tenemos gran cantidad de ADN, se puede precipitar con etanol y recoger con una varilla de vidrio o bien centrifugarlo a alta velocidad

Question 30

Fenol-cloroformo (métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicos)

Answer 30

Se pueden extraer tanto proteínas, como ADN y ARN
La mezcla de fenol y cloroformo no se mezcla con el agua.
El fenol es más denso que el agua.
Actualmente se puede comprar reactivo de Trizol

1. Se añade fenol a las células
2. Se añade cloroformo (1:1), se invierte varias veces y se centrifuga a alta velocidad. Separación por diferencia de densidad
3. Elegiremos la fase de interés (acuosa o interfase) y procederemos con diferentes protocolos para su purificación.
4. Precipitación de ácidos nucleicos con isopropanol ultrapuro
5. Lavados con etanol y secado
6. Resuspender en agua libre de ARNasas

Question 31

Cromatografía intercambio iónico (métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicos)

Answer 31

• Partículas de resina con carga positiva
• ADN y ARN están cargados negativamente, y pueden unirse a las
  partículas electrostáticamente
• La unión electrostática se puede interrumpir en presencia de sales
• Aumentando la concentración de sales, primero se separarán ARN y proteínas, y luego ADN,
• Las muestras se irán recogiendo en tubos separados

Question 32

Cromatografía por afinidad (métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicos)

Answer 32

• En el caso de ARNm, cuando está maduro, tiene una cola de poliadeninas (polyA) en el extremo 3’ y se encuentra fosforilado en el extremo 5’
• Se puede utilizar una cromatografía por afinidad con partículas de resina que tiene colas de poliuracilo (polyU) por donde podrán unirse a las colas polyA
• Para separarlos, se usa un detergente que rompe los puentes de hidrógeno entre polyA-polyU o bien también por cambio de pH

Question 33

Cromatografía con partículas de gel de sílice (métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicos)

Answer 33

• En una columna de cromatografía se ponen partículas
  de gel de sílice
• El ADN se une a las partículas de gel de sílice en presencia de tiocianato de guanidinio
• Recuperación del ADN disolviéndolo con agua. El agua desestabiliza la unión ADN-sílice

Question 34

Centrifugación (diferencia de tamaño y gradiente de densidad-EtBr-Cs) (métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicos)

Answer 34

• Se hace un gradiente de densidad con cloruro
  de cesio (CsCl)
• Las proteínas, ADN y ARN tienen diferente
  densidad
• Si además queremos separar ADN del ADN plasmídico superenrollado podemos utilizar EtBr
• EtBr se intercala entre las bases del ADN de doble cadena y relaja la hélice
• En cambio en los plásmido que están superenrollados, es más difícil que intercale. Sus densidades también son diferentes

Question 35

Alcalinidad (métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicos)

Answer 35

• Cambiando la alcalinidad, el ADN puede desnaturalizarse
• El ADN linear desnaturaliza a un rango de pH más estrecho (pH 12-12.5) que el ADN plasmídico
• El cambio rápido a un pH 7 hace que el ADN lineal no le dé tiempo a alinearse correctamente y se forma una malla y precipita cuando se centrifuga
• Separamos ADN lineal del circular

Question 36

Purificación de proteínas (Consideraciones)

Answer 36

• Durante el lisado celular se han de añadir inhibidores de proteasas y estabilizadores de proteínas
• Algunos métodos de lisis celulares y solubilización de proteínas causan la desnaturalización proteica. Esto es importante porque en aplicaciones posteriores se puede requerir la forma funcional de la proteína
• Algunas proteínas, después de remover las sales de los reactivos de lisis, vuelven a su forma original, pero otras necesitan tampones especiales

Question 37

Métodos de extracción y purificación de proteínas (5)

Answer 37

✔ Fenol-cloroformo
✔ Precipitación
✔ Cromatografía en columna
- Afinidad
- Intercambio iónico
- Filtración de geles
- Inmunocromatografía
✔ Immunoprecipitación (afinidad)
✔ Diálisis

Question 38

Precipitación (métodos de extracción y purificación de PROTEÍNAS)

Answer 38

✔ Precipitación
- Antes se utilizaba como método de purificación pero actualmente
se utiliza en las primeras etapas antes de la purificación
- Es un método de concentración de proteínas
- Efecto de detergentes (SDS, Triton-X100) que aumentan la solubilidad de las proteínas
- Efecto de las sales (NaCl)
- Precipitación por alteración del pH (mínima solubilidad en el pI)
- Precipitación por solventes orgánicos (etanol, acetona) que disminuyen la constante dieléctrica de la solución y su solubilidad
- Desnaturalización de impurezas por altas temperaturas, mantener en hielo
- Reactivos o buffers de lisis celular y extracción proteínas (all in one): RIPA buffer

Question 39

Cromatografía en columna (métodos de extracción y purificación de proteínas)

Answer 39

Son técnicas de purificación
Fase móvil suele ser el buffer o solvente
Fase estacionaria las partículas
La elección de las partículas, determinarán el tipo de interacción con la proteína
+ TABLA (Tipos Cromatografía + Principio de Separación)
+ IMÁGENES (Interacción hidrofóbica, intercambio iónico, filtración, afinidad, inmunocromatografía)

Question 40

Inmunoprecipitación (métodos de extracción y purificación de proteínas)

Answer 40

Los anticuerpos reconocen un epítopo específico
Cada anticuerpo reconoce dos epítopos, por lo tanto se forma una red y precipita
También se pueden utilizar partículas de látex conjugadas con anticuerpos. Para proteínas poco presentes, aumentar su peso y poder precipitar

Question 41

Diálisis (métodos de extracción y purificación de proteínas)

Answer 41

A través de una membrana semipermeable y selectiva y por un proceso de osmosis cuando la solución exterior es agua, podemos purificar una proteína dejándola libre de otras sales y moléculas más pequeñas que el tamaño del poro de membrana
También se utiliza para concentrar una proteína. En vez de agua, ponemos un polímero como polietilenglicol de gran peso molecular y altamente concentrado (PEG, PM 6000, 20% w/v)