Systematische Funktionsanalyse bei Mikroorganismen

Question 1

Metabolom

Answer 1

bezieht sich auf Substrate und Produkte

Question 2

Proteom

Answer 2

Proteine (Enzyme)

Question 3

Transkriptom

Answer 3

Gesamtheit aller RNAs in der Zelle (rRNA, tRNA, mRNA..)

Question 4

Genom

Answer 4

DNA

Question 5

auf welchen Organisationsebenen in der Zelle kann alles reguliert werden?

Answer 5

Metabolom, Proteom, Transkriptom

Question 6

Wozu Regulation?

Answer 6

durch Konkurrenz zwischen Organismen entsteht Ressourcenknappheit: Selektion auf ökonomische Lösungen

Question 7

positive Rückkopplung

Answer 7

Verstärkung (vermutlich) produktiver Investitionen

Question 8

negative Rückkopplung

Answer 8

Vermeidung (vermutich) unproduktiver Investitionen

Question 9

Wie kann das Genom analysiert werden?

Answer 9

statisch

Question 10

wie kann das Proteom, Transkriptom und Metabolom analysiert werden?

Answer 10

dynamisch

Question 11

Was ist wichtig bei der Erfassung des Zustandes von Zellen zur Rekonstruktion von Prozessen in der Zelle?

Answer 11

es muss eine Fragestellung geben: mindestens zwei Zustände müssen verglichen werden

Question 12

Wie sind bakterielle Genome aufgebaut?

Answer 12

meist nur 1 lineares zirkuläres Chromosom, selten lineares Chromosom, natürliche Plasmide

Question 13

Wie geht man bei der Analyse von Genomen vor?

Answer 13

• Scherung des Chromosoms, Klonierung der Fragmente
• Sequenzierung der DNA
• Assemblierung der Fragmente
• Identifizierung von offenen Leserahmen
• Annotation und Zuweisung von Funktionen

Question 14

2,3-Didesoxymethode nach Sanger

Answer 14

• Klonierung: isolierte genomische DNA in Bruchstücke, kleine Fragmente werden mit Vektor in E.coli transformiert (müssen das gesamte Genom darstellen) und wieder isoliert
• enzymatische Neusynthese der Fragmente (Primer setzen bei Beginn des Fragments an), vier Gefäße mit je 4 unterschiedlichen DIdesoxynucleosidtriphosphaten, die mit Floureszenzfarbstoff verknüpft sind (führen zu Kettenabbruch) -> hohe Konzentration
• mit Gelelektrophorese werden die Längen der Fragmente bestimmt

Question 15

Was ist beim next-generation-sequencing anders?

Answer 15

keine in-vivo-Klonierung von DNA-Fragmenten mehr nötig

Question 16

Was ist bei dem Didesoxyanalog anders als beim eigentlichen Desoxynukleotid und was bewirkt das?

Answer 16

am Zucker fehlt die freie 3’-OH-Gruppe -> Kettenabbruch

Question 17

Wie werden die Fragmente beim Pyrosequencing vervielfacht?

Answer 17

jedes Fragment wird an mikroskopisch kleine Perle angeheftet und DNA mit PCR amplifiziert (jede Perle trägt nun mehrere identische Kopien des DNA-Strangs)

Question 18

Wie funktioniert das Pyrosequencing?

Answer 18

• Faserplatte, auf die jeweils eine Perle passt
• Sequenzierung durch Strangsynthese:
• vier Nucleotide werden nacheinander über die Platte gespült, jedesmal wenn ein Nucleotid passt: Pyrophosphat-Freisetzung: liefert Energie für Lichtfreisetzung (zeigt erfolgreiche Kettenverlängerung)

Question 19

beim Pyrosequencing: wie wird Licht freigesetzt?

Answer 19

Pyrophosphat von Sulfurylase zu ATP, das Luciferase nutzt, um Luciferin zu Oxyluciferin und Licht umzusetzen

Question 20

454-Sequenzierung

Answer 20

CCD-Kamera mit Pikotiterplatte und Mikrofluidiksystem

Question 21

Illumina-Sequenzierung: Unterschiede zum Pyrosequencing

Answer 21

• Nukleotide unterschiedlich floureszenzmarkiert
• erfolgter Einbau durch spezifische Farbe wird durch Digitalfoto dokumentiert
• Abspaltung des Fluorophors und nächster Syntheseschritt

Question 22

offener Leserahmen (ORF)

Answer 22

DNA- oder RNA-Sequenz, die zu einem Polypeptid translatiert werden könnte (Abstand Start- und Stoppcodon)

Question 23

polycistronische mRNA

Answer 23

hat Gene für mehrere Proteine

Question 24

Wie lang ist ein ORF im Durchschnitt?

Answer 24

1000 bp

Question 25

Annotation

Answer 25

bioinformatischer Sequenzvergleich, erste Funktinoszuweisung (Schrotschuss-Sequenzierung mit Lücken, Fragmente sind of mehrfach redundant-> Rückschluss auf gesamtes Genom)

Question 26

Was lässt sich zur Größe von Genomen intrazellulärer Parasiten sagen?

Answer 26

sehr kleine Genome

Question 27

Was lässt sich zur Größe von Genomen von Bakterien mit hohem Anpassungspotential/komplexen Differenzierungszyklen sagen?

Answer 27

große Genome

Question 28

Wie schützt man die isolierte RNA?

Answer 28

man schreibt sie zu cDNA um (reverse Transkriptase), damit sie vor RNAsen geschützt ist

Question 29

Wie werden die cDNA-Bibliotheken analysiert?

Answer 29

DNA-Microarrays, Sequenzierung (massive parallel sequencing)

Question 30

wie können einzelne Proteine nachgewiesen werden?

Answer 30

• immunologisch (Western blot, ELISA)

- Nachweis der Enzymaktivität

Question 31

Wie funktioniert 2D-Gelelektrophorese (zur Proteomanalyse)?

Answer 31

• Isoelektrische Fokussierung auf pH-Gradienten (bei isoelektrischem Punkt)
• SDS-Polyacrylamid-Gradientengelelektrophorese nach Größe -> es entstehen Punkte statt Banden

Question 32

Wie werden isolierte Metabolite identifiziert?

Answer 32

Chromatografische Vergleiche, Massenspektroskopie (oder NMR-Spektroskopie)

Question 33

Metagenomik

Answer 33

-man nimmt Zellen aus z.B. Boden und isoliert DNA, vervielfacht sie durch Klonierung mit Vektor, dann kann man die DNA wieder isolieren und sequenzieren

Question 34

Anwendungen der Metagenomik

Answer 34

• Vergleich der Darmflora kranker und gesunder Individuen anhand von Metagenom-Bibliotheken
• Suche nach neuen Genclustern für die Synthese von Wirkstoffen wie Antibiotika in Metagenom-Bibliotheken

Question 35

chromosomale Inseln

Answer 35

Bereiche, die von pathogenen zu apathogenen Bakterien durch horizontalen Gentransfer übertragen werden können