Structure Primaire Oublis

Question 1

PM cytochrome C humain

Answer 1

104AA = 13kDalton

Question 2

Titine

Answer 2

30 000 AA
PM = 3 000 000 Da

Question 3

1 AA = … ( PM)

Answer 3

110 Da

Question 4

Enzyme qui transforme isomerie cis en trans

Answer 4

Prolyl cis transferase
Ex Pin 1

Question 5

Alzheimer

Answer 5

Amyloid precurseur protein ( cerveau)
=> Peut être clivée selon conformation cis ou trans

• trans: pas de clivage
• cis: clivage peptide ABeta ( si agglomération de ce peptide = Alzheimer)

Thérapie possible : augmentation de l’activité Pin 1

Question 6

Taille de la liaison peptidique

Answer 6

1,32

Plus grande qu’une double liaison
Plus petite qu’une liaison simple

C=O < C-C < C-N

Question 7

Spectre IR liaison peptidique

Answer 7

Entre 1600 et 1700 cm-1
=> Pic l’absorbance ( proportionnel à quantité du peptide présent)

Question 8

1ere étape obtention de la protéine pour le séquençage

Answer 8

Purification
Concentration de la protéine puis enlever les molécules non protéiques
Par dialyse, lyolysation ou ultrafiltration

Question 9

2e étape obtention de la protéine pour le séquençage

Answer 9

Séparation, isolement

Question 10

HPLC

Answer 10

Chromatographie sur colonne

=> Chromatographie liquide à haute performance/ pression

Question 11

Chromato échangeuse d’ion

Answer 11

Sépare en fonction de la charge

Question 12

2 types d’affinités différentes chromatographie

Answer 12

Anticorps antigène

Enzyme substrat

Question 13

Quelles substances utilisées pour précipitation?

Answer 13

Sulfate d’ammonium ou sulfate de sodium

Question 14

Ultracentrifugation

Answer 14

Séparation en fonction des constantes de sédimentation ( Svedberg)

Question 15

Electrophorese monodimensionnelle migration selon la charge globale des protéines

Answer 15

Électrophorèse sur gel d’agarose

Si diminution de la surface d’albumine ( la + loin du dépôt) => dénutrition

Si continuité entre zones gamma et beta : bloc gamma-beta
=> Atteinte hépatique alcoolique

Si pic dans zone gamma => pic anticorps (Ig) monoclonaux

Question 16

Ex monodimensionnelle+ efficace

Answer 16

Chromatographie PAGE + SDS

• SDS: Docétyl sulfate de sodium, selon le PM des protéines

Les protéines sont déposées sur le SDS chargé négativement. Elles deviennent alors très fortement négatives, ont les mêmes charges électriques. Cela permet alors de séparer les protéines seulement en fonction du PM. Plus une molécule un poids moléculaire élevé, moins elle migrera loin. La vitesse est inversement proportionnelle au point moléculaire.

PAGE: Gel de polyacrylamide, plus efficace que l’agarose, permet de séparer d’autres composants (acide nucléique et cetera)

donc SDS-PAGE : électrophorèse sur gel polyacrylamide + SDS qui se base seulement sur le PM.

Question 17

Électrophorèse bidimensionnelle

Answer 17

Migration selon la charge naturelle de la protéine puis égalisation des charges par SDS enfin migration selon le poids moléculaire. Comme les protéines ont un poids moléculaire différent, elle se sépare dans un second temps.

Question 18

Obtention d’une protéine recombinante

Answer 18

Les protéines recombinantes sont produites par une bactérie à laquelle on a injecté de l’ADNc

=> + simple, + grande quantité, employée ++

Question 19

Edman

Answer 19

Phenylisothiocyanate (PITC)

Le mélange du PITC et de la protéine en milieu alcalin cherche à obtenir un complexe ensuite mélangé à un acide fort anhydre (acide tri fluoro-acétique), permettant de séparer l’AA N-term associé au PITC donnant un autre complexe dit AA-PTH (phényl thio hydantoïne)
Puis une extraction par un solvant organique est réalisée avant de procéder aux analyses.

intérêt : pas de dégradation protéique, réutilisation possible pour le séquençage.

Question 20

Hydrolyse avec une solution acide ( sol, concentration, température, conditions et temps)

Answer 20

HCL

Concentration 6mol/L

Temperature 100-120 C

Temps: 10-100h

Sous vide ! ( Contre oxydation des AA)

Question 21

Hydrolyse avec une solution basique ( sol, concentration, température et temps)

Answer 21

Basique NaOH

Concentration: 2-4 mol/L

Temperature ambiante

Temps: 4-8h

Question 22

Hydrolyse avec une solution enzymatique

Compo + exemple

Answer 22

Mélange d’endopeptidase et d’exopeptidases

Ex: pronase
=> Ensemble de protéases de la bactérie Strepmocytes Griseus, <1% du poids de la protéine à cliver pour éviter une contamination par auto dégradation

Question 23

Déterminer la composition en AA etapes ( + sous catégories)

Answer 23

1) hydrolyse totale
=> Chimique acide, basique ou enzymatique

2) analyse des AA
-> dérivation ( on marque les AA) : Sanger, Dansyle, Edman ou O-phtalaldehyde + 2 mercapto-ethanol

-> séparation: chromatographie CLHP ou échangeuse d’ions
Pic: tps d’elution ( identité AA), surface du pic = quantité d’AA

Question 24

Séquencage direct

Answer 24

Si <100 AA ( = oligopeptide ou polypeptide)
Grâce à la technique d’Edman

Si > 100 AA, il faut couper au préalable la protéine

Elle peut néanmoins être bloquée par la glycosylation ou l’acetylation, il y a donc besoin de glycosylates et acetylases au préalable pour faire sauter ces groupements bloqueurs

Question 25

Séquençage après hydrolyse (ciblé)

Answer 25

> 100 AA ( = protéine) - Fragmentation avec différents types de coupures - séquençage des fragments obtenus ( Edman) - analyse informatique et croisement des différentes séquences obtenues

Question 26

Hydrolyse chimique

Answer 26

- Bromure de cyanogène (NCBr) HCl 0.1 N/ acide formique 70 % rupture spécifique côté carboxy terminal du résidus méthionine - hydroxylamine (NH2-OH) coupure spécifique entre l'asparagine et la glycine.

Question 27

Hydrolyse enzymatique

Answer 27

Endopéptidase/endoprotéase, d'origine pancréatique ou bactérienne

Question 28

Trypsine

Answer 28

Coupure si AAn-1 = Arg/Lys et AAn ≠ Pro Voyage, il faut de l'argent et un lit mais nous n'avons pas besoin d'être un pro

Question 29

Chymotrypsine

Answer 29

Coupure si AAN-1= résidu hydrophobe encombrant ( Phe/Trp/Tyr) et si AAn ≠ Pro Personne n'être un pro, on peut tous avoir le cancer

Question 30

Pepsine

Answer 30

Coupure si AAN-1 ≠ Pro et AAn = Phe/Trp/Tyr Les pros ne boivent pas de Pepsi car ils sont sportifs ils font attention à leur régime

Question 31

Clostripaïne

Answer 31

Coupe liaisons Arg-X ( = autre AA) Un clos c'est fermé, il faut protéger l'argent de tout le monde X

Question 32

Lys-endopepidase ( achromobacter)

Answer 32

Coupe la liaison lys - pro La fleur de lys est une pro, elle est trop belle Où : il faut lire pour être un pro attention à l'ordre

Question 33

Carte peptidique ou fingerprint

Answer 33

Électrophorèse SDS-PAGE ou chromatographie sur papier / silice, pour comparer deux protéines dont une connue et une inconnue, on ne séquence que les peptides différents.

Question 34

Application du fingerprint

Answer 34

Recherche des AA différents dans l'hémoglobine anormale provoquant la drépanocytose c'est-à-dire une anémie falciforme avec des globules rouges en forme de faucille et une thrombose Les globules rouges (érythrocyte) portent l'hémoglobine HB Hb normale majoritaire HBA (alpha 2 beta 2) Hb anormale mutée HbS: drépanocytose - solubilité réduite en absence d'oxygène - précipitation du globule rouge - destruction plus rapide du globule rouge = anémie Screening: un sujet heterozygote à des signes cliniques - important qu'un sujet homozygote

Question 35

Coupure HbS et BhA en ... Peptides par...

Answer 35

En 28 peptides par trypsine

Question 36

Drépanocytose, focalisation sur le peptide potentiellement anormal => mutation ou?

Answer 36

On a une mutation du 6e codon GAG (glu) en un codon CTC (Val) au sein de la chaîne beta

Question 37

Interaction valine pathologie d'une chaîne beta

Answer 37

Interagit anormalement avec la Phe 85 et la Leu 88 d'une autre chaîne beta point on a alors des interactions hydrophobe entre molécules de désoxy- HbS qui ne se ferait pas s'il y avait de l'acide glutamique. La solubilité du désoxy HbS est très mauvaise par rapport à la désoxy HbA: elle précipite ce qui va entrainer la dégradation des érythrocytes ( anemie falciformel, une obstruction des capillaires et éventuellement formation de bouchon qu'on appelle les thrombose.

Question 38

Proteomique/peptidomique

Answer 38

C'est une technique bidimentionnelle qui associe une électrophorèse bidimensionnelle à une analyse par spectroscopie de masse