Structure Primaire Oublis Flashcards
PM cytochrome C humain
104AA = 13kDalton
Titine
30 000 AA
PM = 3 000 000 Da
1 AA = … ( PM)
110 Da
Enzyme qui transforme isomerie cis en trans
Prolyl cis transferase
Ex Pin 1
Alzheimer
Amyloid precurseur protein ( cerveau)
=> Peut être clivée selon conformation cis ou trans
- trans: pas de clivage
- cis: clivage peptide ABeta ( si agglomération de ce peptide = Alzheimer)
Thérapie possible : augmentation de l’activité Pin 1
Taille de la liaison peptidique
1,32
Plus grande qu’une double liaison
Plus petite qu’une liaison simple
C=O < C-C < C-N
Spectre IR liaison peptidique
Entre 1600 et 1700 cm-1
=> Pic l’absorbance ( proportionnel à quantité du peptide présent)
1ere étape obtention de la protéine pour le séquençage
Purification
Concentration de la protéine puis enlever les molécules non protéiques
Par dialyse, lyolysation ou ultrafiltration
2e étape obtention de la protéine pour le séquençage
Séparation, isolement
HPLC
Chromatographie sur colonne
=> Chromatographie liquide à haute performance/ pression
Chromato échangeuse d’ion
Sépare en fonction de la charge
2 types d’affinités différentes chromatographie
Anticorps antigène
Enzyme substrat
Quelles substances utilisées pour précipitation?
Sulfate d’ammonium ou sulfate de sodium
Ultracentrifugation
Séparation en fonction des constantes de sédimentation ( Svedberg)
Electrophorese monodimensionnelle migration selon la charge globale des protéines
Électrophorèse sur gel d’agarose
Si diminution de la surface d’albumine ( la + loin du dépôt) => dénutrition
Si continuité entre zones gamma et beta : bloc gamma-beta
=> Atteinte hépatique alcoolique
Si pic dans zone gamma => pic anticorps (Ig) monoclonaux
Ex monodimensionnelle+ efficace
Chromatographie PAGE + SDS
- SDS: Docétyl sulfate de sodium, selon le PM des protéines
Les protéines sont déposées sur le SDS chargé négativement. Elles deviennent alors très fortement négatives, ont les mêmes charges électriques. Cela permet alors de séparer les protéines seulement en fonction du PM. Plus une molécule un poids moléculaire élevé, moins elle migrera loin. La vitesse est inversement proportionnelle au point moléculaire.
PAGE: Gel de polyacrylamide, plus efficace que l’agarose, permet de séparer d’autres composants (acide nucléique et cetera)
donc SDS-PAGE : électrophorèse sur gel polyacrylamide + SDS qui se base seulement sur le PM.
Électrophorèse bidimensionnelle
Migration selon la charge naturelle de la protéine puis égalisation des charges par SDS enfin migration selon le poids moléculaire. Comme les protéines ont un poids moléculaire différent, elle se sépare dans un second temps.
Obtention d’une protéine recombinante
Les protéines recombinantes sont produites par une bactérie à laquelle on a injecté de l’ADNc
=> + simple, + grande quantité, employée ++
Edman
Phenylisothiocyanate (PITC)
Le mélange du PITC et de la protéine en milieu alcalin cherche à obtenir un complexe ensuite mélangé à un acide fort anhydre (acide tri fluoro-acétique), permettant de séparer l’AA N-term associé au PITC donnant un autre complexe dit AA-PTH (phényl thio hydantoïne)
Puis une extraction par un solvant organique est réalisée avant de procéder aux analyses.
intérêt : pas de dégradation protéique, réutilisation possible pour le séquençage.
Hydrolyse avec une solution acide ( sol, concentration, température, conditions et temps)
HCL
Concentration 6mol/L
Temperature 100-120 C
Temps: 10-100h
Sous vide ! ( Contre oxydation des AA)
Hydrolyse avec une solution basique ( sol, concentration, température et temps)
Basique NaOH
Concentration: 2-4 mol/L
Temperature ambiante
Temps: 4-8h
Hydrolyse avec une solution enzymatique
Compo + exemple
Mélange d’endopeptidase et d’exopeptidases
Ex: pronase
=> Ensemble de protéases de la bactérie Strepmocytes Griseus, <1% du poids de la protéine à cliver pour éviter une contamination par auto dégradation
Déterminer la composition en AA etapes ( + sous catégories)
1) hydrolyse totale
=> Chimique acide, basique ou enzymatique
2) analyse des AA
-> dérivation ( on marque les AA) : Sanger, Dansyle, Edman ou O-phtalaldehyde + 2 mercapto-ethanol
-> séparation: chromatographie CLHP ou échangeuse d’ions
Pic: tps d’elution ( identité AA), surface du pic = quantité d’AA
Séquencage direct
Si <100 AA ( = oligopeptide ou polypeptide)
Grâce à la technique d’Edman
Si > 100 AA, il faut couper au préalable la protéine
Elle peut néanmoins être bloquée par la glycosylation ou l’acetylation, il y a donc besoin de glycosylates et acetylases au préalable pour faire sauter ces groupements bloqueurs
Séquençage après hydrolyse (ciblé)
> 100 AA ( = protéine)
- Fragmentation avec différents types de coupures
- séquençage des fragments obtenus
( Edman) - analyse informatique et croisement des différentes séquences obtenues
Hydrolyse chimique
- Bromure de cyanogène (NCBr)
HCl 0.1 N/ acide formique 70 %
rupture spécifique côté carboxy terminal du résidus méthionine - hydroxylamine (NH2-OH) coupure spécifique entre l’asparagine et la glycine.
Hydrolyse enzymatique
Endopéptidase/endoprotéase, d’origine pancréatique ou bactérienne
Trypsine
Coupure si AAn-1 = Arg/Lys et AAn ≠ Pro
Voyage, il faut de l’argent et un lit mais nous n’avons pas besoin d’être un pro
Chymotrypsine
Coupure si AAN-1= résidu hydrophobe encombrant ( Phe/Trp/Tyr) et si AAn ≠ Pro
Personne n’être un pro, on peut tous avoir le cancer
Pepsine
Coupure si AAN-1 ≠ Pro et AAn = Phe/Trp/Tyr
Les pros ne boivent pas de Pepsi car ils sont sportifs ils font attention à leur régime
Clostripaïne
Coupe liaisons Arg-X ( = autre AA)
Un clos c’est fermé, il faut protéger l’argent de tout le monde X
Lys-endopepidase ( achromobacter)
Coupe la liaison lys - pro
La fleur de lys est une pro, elle est trop belle
Où : il faut lire pour être un pro attention à l’ordre
Carte peptidique ou fingerprint
Électrophorèse SDS-PAGE ou chromatographie sur papier / silice, pour comparer deux protéines dont une connue et une inconnue, on ne séquence que les peptides différents.
Application du fingerprint
Recherche des AA différents dans l’hémoglobine anormale provoquant la drépanocytose c’est-à-dire une anémie falciforme avec des globules rouges en forme de faucille et une thrombose
Les globules rouges (érythrocyte) portent l’hémoglobine HB
Hb normale majoritaire HBA (alpha 2 beta 2)
Hb anormale mutée HbS: drépanocytose
- solubilité réduite en absence d’oxygène
- précipitation du globule rouge
- destruction plus rapide du globule rouge = anémie
Screening: un sujet heterozygote à des signes cliniques - important qu’un sujet homozygote
Coupure HbS et BhA en … Peptides par…
En 28 peptides par trypsine
Drépanocytose, focalisation sur le peptide potentiellement anormal => mutation ou?
On a une mutation du 6e codon GAG (glu) en un codon CTC (Val) au sein de la chaîne beta
Interaction valine pathologie d’une chaîne beta
Interagit anormalement avec la Phe 85 et la Leu 88 d’une autre chaîne beta point on a alors des interactions hydrophobe entre molécules de désoxy- HbS qui ne se ferait pas s’il y avait de l’acide glutamique.
La solubilité du désoxy HbS est très mauvaise par rapport à la désoxy HbA: elle précipite ce qui va entrainer la dégradation des érythrocytes ( anemie falciformel, une obstruction des capillaires et éventuellement formation de bouchon qu’on appelle les thrombose.
Proteomique/peptidomique
C’est une technique bidimentionnelle qui associe une électrophorèse bidimensionnelle à une analyse par spectroscopie de masse
