sRNA Flashcards
Hur kan icke-kodande gener förutspås från DNA sekvensen?
○ Måste finnas en protomot eftersom de transkriberas
Sekvenser som känns igen: ‘TATA-box’ struktur, -10 -35 känns igen av RNAP
○ Terminator: två sätt
1) Rho-oberoende: RNA slutar med stemloop och uuuu –> destabiliseras
2) Rho-beriende
Vad innebär det att sRNA finns i cis eller trans?
Antisense RNA i bakterier finns i två olika varianter - som skiljer sig i hur antisense molekylen förhåller sig till det mRNA det binder till
Cis-encoded:
- På samma ställe i genomet
- Helt komplementära när de är från samma ställe
- Vanligt i plasmider
- Behöver inte Hfq
Trans-encoded:
- Ingen relation mellan generna på kromosomen, ej kopplade fysiskt
- Vanligt i kromosomer
- Kräver normalt Hfq
○ Behövs för att stabilisera
○ Hjälper till för basparning (som ett slags chaperon)
- Ej helt komplementärt
Hur kan sRNA inhibera ribosomer?
När ribosomen binder in till mRNA för translation så binder den till RBS - ribosome binding sequence
○ RBS är en komplementär sekvens till ribosombindning
§ Start-kodon: binder tRNA
§ Shine-Dalgarno: binder in ribosomen
Denna sekvens måste vara tillgänglig
○ Om ett sRNA binder in blockas ribosomen –> ingen translation
○ Ribosomen tar stor plats, ca 30 nukleotider –> kan binda in ca RBS och det får effekt!
Hur kan sRNA påverka translation genom att påverka mRNA strukturen?
Att mRNA basparar till sig själv i en hairpin-loop är väldigt vanligt
Om RBS sekvensen är basparad kan ribosomen ej binda in –> ingen translation
Om antisense binder till den komplementära sekvensen blir RBS fri –> öppnar upp för ribosomen att binda –> aktiverar translation
Hur kan sRNA ge upphov till ribosom standby?
Ribosomen kan binda till andra ställen, men hittar den en RBS är den interaktionen mer stabil –> den föredrar att stanna där!
Om RBS är i en loop är den stabil, osannolikt att den öppnas och translateras.
Det sk standby site innan loopen, sekvens som ribosomen har högre affinitet för –> stannar upp
Binder stanby sekvensen –> helikas aktivitet –> öppnar upp och kan translateras. Men om standby sekvensen blockas genom att antisense binder inte –> kan det inte öppnas upp –> uttrycks inget toxin
Varför finns sådana strukturer?
○ Toxin eller proteiner som uttrycks är skadliga för cellen
Hur kan sRNA påverka terminering?
Hos bakterier finns två typer av terminering: Rho-oberoende och Rho-beroende
Rho-oberoende: bildar stem-loop + uuu –> svaga interaktion, bryts
Rho-beroende: - Rho är ett protein Hexamer med 6 monomerer ○ Varje monomer kan binda till RNA - Proteiner rör sig längs mRNA tills att den 'kommer ikapp' polymeraset --> puttas av
Rho-beroende terminering kan regleras av sRNAs både positivt och negativt
Främja:
- Rho kan inte binda om det sitter ribosomer ivägen
- Om sRNA binder till RBS –> inga ribosomer –> plats för Rho
- Rho binder till Rut sites, Rho utiliziation sites
Förhindra:
- Rho terminerar normalt sent i 3’
- Om sRNA binder och blockar Rho –> hela mRNA görs, translation sker!
Vad är sRNA decoys?
Antisense RNA kan binda till varandra vilket gör dem obrukbara.
Om sRNA finns tillgängligt kan det binda och repressa target mRNA uttryck
Om sRNA är trapped (sker under vissa förhållanden) kan target mRNA uttryckas ostört
exempel:
Kitin är en näringskedja i havet. Protein i membranet tar upp sockret!
Enzymer som bryter ner socker slås på när socker förekommer, positiv feedback:
I cellerna sker konsekutivt uttryck av MicM sRNA
- MicM inhiberar translation. När [kitin] är låg –> inget uttryck
- ybfMN mRNA degraderas –> MicM kan återvinnas
Chitobiose operonet har också bindningsställe för MicM –> binder hit istället –> påverkar ej RBS
First target är mRNA för transportproteinet, det gör att det andra target aktiveras
Det fångar upp sRNA —> det första target är fritt och kan vara aktivt.
- I detta fall mRNA för ytproteinet –> kan producera fler –> positiv feedback loop
Vad reglerar uttrycket av sRNA?
Man har sett vissa mönster: stress repsons, virulens, metabola responer,
Ofta ser man kopplingar till: ytproteiner och transkriptionsfaktorer
Cellytan
- Det yttre membranet utgör cellers kontakt till omvärlden
- Yttre membranets proteiner/poriner/transporter kontrollerar influx outflux av många olika ämnen
- Yttre membranets proteiner är viktiga antigener - det är dessa antikroppar kan känna igen och agera på
- Det finns många OMPs och ytproteiner i gramnegativa bakterier
- Vi vet idag att OmpA, C och F regleras av sRNA
Vad är Hfq?
Hfq = host factor q-Beta
Homo-hexameriskt protein
Binder starkt till RNA, binder A och U rika ssRNA
- harr två olika ytor/sidor:
Proximal binder UUUUU
Distal binder AAAAA
- Konserverad i många bakterier
- Nödvändig för reglering
- Att ta bort hfq –> pleiotropic effekt –> känsliga
Vad har Hfq för funktion?
Hfq behövs för många sRNAs
- Enchancing target-bindning
Proteinet kan binda mRNA och sRNA –> föra dem tillsammans
- Stabilitet av sRNA
Hfq kan binda 3’ –> skydda mot nukleaser
- RNA chaperon
Seed sekvens ej tillgänglig, om Hfq binder –> tillgänglig
Fungerar som ett slags chaperon
Experiment: Tajt bindning av Hfq/RNA
Geler: elektromobility shift assay
- När 2 molekyler binder till varandra
- Gelerna ej denaturerande (tittar på funktionella komplex)
Tillsätter olika koncentration av Hfq
RNA+hfq –> större komplex –> högre upp på gelen
Signalen är radioaktivt uppmätt!
50% bundet = dissociationskonstanten!
Hög affinitet, lätt att bilda komplexet
Surface Plasmon Resonance: yta binder till molekyl –> ändrar spridning av ljus –> säger att något har bundit in!
Denna beskriver hur snabbt komplexet bildas!
Vad innebär tävlan om Hfq?
Bundit sRNA: släpper inte –> låg kdiss, hög kass
○ Problem att binda starkt:
§ Uppbundet
§ Ny situation som kräver Hfq , vi ser inte hur det fungerar i cellen - men vi kan inte vänta i timmar på. Att det ska dissociera och vara tillgängligt –> Något annat med hög koncentration måste konkurrera ut!
RNA bundet, att dissociera styrs av kd
Om RNA är fritt, vill binda in, styrs av ka
Summan av interaktionern på samtliga monomerer
RNA kan tävla - om det är hög koncentration av det röda kommer det driva utbytet!!
Börjar med komplex, RNA+hfq
Mät fri [RNA] över tid när /om de konkurreras ut!
Lägger till andra RNA i hög koncentration –> aktiv tävlan –> snabb omställning
[RNA] driver tävlan
1) Sex identiska bindningsställen
2) Initialt svag bindning, monomer svag –> alla = stabilt komplex
3) Flera omvandlingssteg, byta av bindningsställen
4) Ingen energi krävs, behövs ej tillsättas för att det ska ske
5) Vid sub-mikro M chaser RNA sker utbytet inom några minuter
6) Helt reversibel reaktion!
Hur kan sRNA+protein påverka genuttryck?
Exempel CsrB- carbon storage regulator binder till CsrA protein
Sekundärstruktur med många stemloop strukturer
CsrB-lika RNA kodas hos många olika bakterier (mestadels patogener)
- E.coli, salmonella, Pseudomonas, Vibrio…
Mutation i csrB har pleiotropsika effekter:
- Pleiotropi uppstår när en gen påverkar två eller flera till synes orelaterade fenotypiska egenskaper. En sådan gen som uppvisar multipla fenotypiska uttryck kallas en pleiotrop gen.
- Påverkar glukogenes, motilitet, biofilm formation, virulensförmåga etc
CsrB är en protein sequestrator
- Inte ett antisense RNA, binder protein och inaktiverar dess funktion
Uttryck reglerat
- Hög/låg koncentration
- Väldigt hög koncentration när det väl uttrycks
- Translation kan aktiveras / inhiberas
○ Fritt CsrA binder till GGA sekvens i CsrB
Translation blockas, ribosom kan inte binda in
○ Binder till CsrB istället för mRNA –> uttryck av deras proteiner
Hur fungerar 6S sRNA?
- 6S sRNA upptäcktes för mer än 30 år sedan, funktioner dock okänd
- 1000 kopior/cell –>»_space;10 000 i stationär fas
- Promotor mimick , liknar DNA sekvensen till vilken RNApol-sigma70 binder.
- Tillgänglighet av RNApol-sigma70 styr genuttrycket!
○ När det är låg [NTP] i cellen –> sluta växa
Komplex dissocierar –> kommer loss –> kan användas som vanligt!
