CRISPR Flashcards
Prokaryoter har två typer av försvar - vilka?
Ospecifika:
- Blocka bindning (mutera receptorer/ytstrukturer)
- Restriktions/Modifikations (RM) system - klipper DNA som saknar cell-egna markeringar (ex. metylering)
- Bakteriofag exklusion - förhindra replikation, klipper dock inte sönder DNA
- Superinfektion exklusion - infektion av ett virus skyddar från infektion av liknande virus
- Abortiv infektion - självmordssystem, cellen dödar sig själv och förhindrar att viruset sprids inom populationen
Adaptiva:
- CRISPR - cellen lär sig att känna igen specifika virus DNA sekvenser
Vad är ‘Red queen hypothesis’?
Kontinuerlig adaption krävs för att behålla sin relativa fitness i förhållande till arterna med vilken den ko-utvecklas med.
Red Queen hypothesis:
“It takes all the running you can do, to keep in the same place. If you want to get somewhere else you must run at least as twice as fast as that”
Vad är CRISPR?
CRIPR: clustered regularly interspaced short palindromic repeats
- Alla inte palindroma –> försökt ersättas med prokaryot
- Kromosomalt lokus som består av korta repeterande sekvenser som separeras av icke-repeptativa ‘spacers’
- CRIPRs detekteras i 50% av alla bakterier och 90% av alla arkeer
- Spacers liknar ofta virus eller plasmid sekvenser
CRIPR associerade gener
- Cas gener är ofta lokaliserade intill CRISPR
- Cas proteiner inkluderar många olika familjer : nukleaser, RNA bindande proteiner, helikaser etc.
- Vissa cas gener är associerade med alla typer av CRISPR, andra med bara vissa
Hur fungerar ett CRISPR-Cas typ 2 system?
Exempel på ett typ 2 system:
- Cell infekteras, fag-DNA i cellen
- Cas1 och Cas2 klipper i fag-DNA och inkorporerar bit i CRISPR lokus
- CRISPR transkriberas
- Cas 9 och hjälp tracer RNA (crRNA loaded Cas9) basparar till transkript (och klipper ut denna)
- Basparar mha CRIPSR transkript vid ny infektion - Klipper och oskadliggör
Ett problem med dessa system är att sekvensen som klipps finns även i genomet –> klipper i sitt eget DNA = dumt. Hur skyddar cellen sitt eget DNA?
Hur skyddar cellen sitt eget DNA?
- Non-self aktivering:
De flesta system behöver en protospacer intill motivet, en sk PAM site för att aktivera klyvning
- Self aktivering:
Vid RNA-targeting typ 3 system, basparning mellan crRNA repeats och target förhindrar själv-klyvning (men PAM kan också spela roll)
Vad är Cas9?
- Multifunktionellt protein
- Finns i typ 2 CRISPR system
- Involverad i pre-crRNA processing och binder crRNA
- Kräver värd-producerad/kodad Rnase 3 och tracrRNA för att det ska processa crRNA
- Genomför target identifiering och target cleavage
Hur kan genuttryck regleras aha CRISPR-Cas?
Förhindra syntes av mRNA
- Kaskad utan Cas3 blockerar transkriptionsinitiering och transkriptions-elongering
- Deficient Cas9 (dCas9) blockar transkriptions initiering och elongering. dCas9 med andra aktiva domäner kan öka transkriptionen
Hur kan CRISPR användas för genetiska screening?
Konventionell genetik: hypotes-driven sökning för gener korrelerade till fenotyp
Forward genetic screen: alterera många gener random för att screena gener mot en viss fenotyp
- Positiv selektion: modifieringar som tillåter tillväxt hittas genom att sekvensera för enriched modifiers
- Negativ selektion: modifieringar som inte tillåter tillväxt hittas genom att detektera vilka modifiers som är försvunna (ex. essentiella gener)
Funktionella screens kommer i två olika format
- Arrayed analys
○ En modifierad gen per kultur –> många kulturer
○ Dyrt och komplext
○ Men varje kultur kan analyseras för fenotyp (inte bara tillväxt)
- Pooles analys
○ Celler med olika gen-modifiering mixas, en kultur
○ Enklare, billigare och kan göras in vivo
○ Men färre fenotyper kan studeras (i huvudsak tillväxt)
Hur kan man hitta gener kopplade till cancer-medicin-resistens?
- Introducera mutationer –> se vilken som blir resistent (påverkar cellgiftet: pumpa ut, oskadliggöra..)
- Vill ej förändra sekvensen, vill påverka uttrycket av genen
- Öka uttryck mha aptamerer –> poola: tillsätt cellgift. Bibliotek av guide-RNA, transformera in –> olika guide-RNA –> olika uttryck
