Spectrophotométrie Flashcards

1
Q

Qu’est-ce que la spectrophotométrie?

A

La spectrophotométrie est une méthode analytique qui consiste à mesurer l’absorbance, ou la densité optique, d’une substance chimique en solution en vue de déterminer sa concentration.

Un flux incident de lumière traverse la solution à mesurer, contenue dans une cuve de longueur connue, et le spectrophotomètre mesure le flux émergent de lumière, ce qui nous indique l’absorbance de la solution.

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2
Q

À quoi sert la spectrophotométrie?

A

Quantitative

Dosage d’une substance
Suivi des réactions chimiques

Qualitative

Identification des composés
Indicateur de pureté des solutions

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3
Q

Qu’est-ce que le rayonnement magnétique?

A

Le rayonnement électromagnétique peut être décrit de deux manières :
• Corpusculaire : propagation de photons
• Ondulatoire : onde électromagnétique qui se manifeste sous la forme
d’un champ électrique couplé à un champ magnétique.

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4
Q

Qu’est-ce que le spectre électromagnétique et la longueur d’onde?

A

Le spectre électromagnétique est une classification qui présente l’ensemble des ondes électromagnétiques selon leur longueur d’onde et leur fréquence. Dans le cadre du cours, nous ne parlerons que de la longueur d’onde.

La longueur d’onde est définie comme la distance entre deux pics d’onde et est exprimée en nm lorsqu’on parle de rayonnement UV/visible, en cm pour l’infrarouge et en m lorsqu’on parle d’ondes radio.

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5
Q

Qu’elles sont les caractéristiques de la radiations?

A

Par conséquent, l’énergie d’un rayonnement est inversement proportionnelle à sa longueur d’onde.

Autrement dit : les rayonnements les plus énergétiques ont de faibles longueursd’onde.

Énergie

Les rayonnements ayant le plus d’énergie comme les rayons gammas et les rayons X ont des effets très importants et souvent permanents sur les atomes et les molécules. Ils peuvent provoquer leur ionisation et la rupture de liaisons chimiques.

Aux longueurs d’ondes qui nous intéressent en spectrophotométrie, soit l’UV et le visible, l’effet associé sur les atomes est la transition d’orbite électronique. Les rayonnements provoquent une excitation transitoire des électrons.

Les longueurs d’onde plus grandes ont un effet beaucoup moins important. Les micro-ondes par exemple provoquent la vibration des atomes, mais ne sont pas assez énergétiques pour provoquer l’excitation des électrons.

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6
Q

Qu’est-ce que l’absorption?

A

On parle d’absorption lorsqu’un atome ou une molécule, après avoir été exposé à un rayonnement, absorbe une partie de l’énergie de celui-ci.

Dans le cas des rayonnements UV et visible, cette énergie absorbée permet la transition d’orbite d’un électron d’un faible niveau énergétique vers un niveau supérieur. Lorsqu’un photon rencontre un électron à l’état fondamental, il y aura excitation de l’électron. L’électron excité change d’orbite électronique vers un niveau supérieur.

Lorsque l’électron retourne à son état fondamental, il y a émission de l’énergie absorbée précédemment. Cette émission peut se faire sous différentes formes comme sous forme de chaleur ou encore sous de fluorescence.

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7
Q

Comment faire une analyse qualitative?

A

• On peut identifier des espèces chimiques en établissant leur spectre d’absorption.
• Spectre d’absorption :
• Représentation graphique de l’absorbance d’un composé donné en fonction
de la longueur d’onde λ.
• Chaque composé chimique possède un spectre d’absorption qui lui est propre.

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8
Q

De quoi la couleur est déterminer?

A

La couleur des choses dépend effectivement des longueurs d’onde de la lumière visible qui sont absorbées et réfléchies par une substance ou un objet. La couleur que nous percevons est déterminée par les longueurs d’onde qui ne sont pas absorbées, ce qui peut nous donner une petite idée des spectres d’absorption de certains composés.

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9
Q

Qu’est-ce que la l’absorption sélective?

A

L’absorption sélective dépend de la structure chimique de chaque
molécule.

Molécules qui absorbent le visible et l’UV contiennent des liaisons insaturées :
• Double ou triple liaisons carbone-carbone
• Groupements carbonyl, carboxyl, amide, azo, nitrile, nitroso, imidazole, indole
• Purine et pyrimidine

On appelle chromophore un groupe d’atomes qui absorbe des radiations du visible.

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10
Q

Comment fonctionne les crèmes solaires?

A

Les crèmes solaires sont faites pour absorber certains types de rayons
UV et contiennent donc des composés qui absorbent ces types de radiations. Ainsi, les crèmes évitent donc l’absorption par la peau du rayonnement UV.

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11
Q

Comment faire une analyse quantitative?

A

Un autre principe est derrière les analyses quantitatives réalisées en
spectrophotométrie: la quantité de lumière absorbée dépend de la quantité d’espèces présentes, donc de la concentration d’une solution.

L’absorbance et la transmittance sont les deux mesures utilisées en
spectrophotométrie lors de l’analyse quantitative.

• Il y a un transfert d’énergie de la radiation à la molécule.
• Diminution de l’intensité de la radiation due à l’absorption

On compare l’intensité de la radiation incidente (I0) à l’intensité de la
radiation émergente (I).

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12
Q

Qu’est-ce que la transmittance?

A

La transmittance est une mesure de la proportion de lumière qui traverse un corps absorbant. C’est donc le rapport de l’intensité transmise (I) sur l’intensité incident (I0). La valeur du rapport I/I0 est comprise entre 0 et 1, puisqu’il ne peut pas y avoir plus de lumière transmise qu’il n’y en avait dans le flux incident. Mais, la valeur de la transmittance est souvent exprimée sous forme de pourcentage, donc la valeur obtenue doit être multipliée par 100. On obtiendra 0% de transmittance lorsque tout le rayonnement est absorbé et 100% de transmittance lorsque l’intensité lumineuse est la même à l’entrée qu’à la sortie.

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13
Q

Qu’est-ce que la loi Beer-Lambert de propose?

A

Premièrement : lorsqu’un faisceau traverse un milieu absorbant, son intensité va décroître exponentiellement en fonction de l’augmentation de la concentration de ce milieu absorbant. Cette tendance suit une courbe logarithmique inversement proportionnelle. Donc, plus une solution est concentrée, plus l’intensité de la lumière transmise diminue, et plus cette diminution est marquée.

Un autre principe énoncé par la loi de Beer-Lambert est que lorsqu’un faisceau traverse un milieu absorbant, son intensité va décroître exponentiellement en fonction de la longueur du trajet parcouru. Donc, plus le trajet que la lumière suit dans le milieu est long, plus l’intensité de la lumière transmise diminue

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14
Q

Qu’est-ce que l’absorbance?

A

Cependant, on peut analyser l’absorbance plutôt que la transmittance. La relation entre l’absorbance, la longueur du trajet et la concentration des molécules est en grande partie proportionnelle et linéaire: on utilise l’absorbance pour considérations pratiques.

L’absorbance est définie comme le négatif du logarithme de la transmittance, ou encore comme le log de l’intensité incidente sur l’intensité émergente. En utilisant le log de la transmittance, une relation exponentielle, on obtient donc une relation linéaire.

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15
Q

Qu’est-ce que le coefficient d’absorption?

A

Il existe plusieurs types de coefficient d’absorption. Ceux-ci varient selon le type d’unité utilisé pour exprimer la concentration de la substance d’intérêt. On va donc choisir le coefficient à utiliser selon la concentration avec laquelle on travaille. Lorsqu’on parle de coefficient d’absorption molaire d’une molécule X, celui-ci correspond à l’absorbance d’une solution d’une molécule X lorsque sa concentration est de 1 M et que la distance parcourue par la lumière est de 1 cm. On utilise la variable epsilon pour le coefficient d’absorption molaire. Le coefficient
d’absorption molaire ε est donné en M-1 .cm-1.

Le coefficient d’absorption spécifique (E) est utilisé lorsque la concentration de la molécule à doser est exprimée en g/L et non en mole/L, ce qui est souvent le cas. On met en indice la concentration de la solution utilisée comme étalon.

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16
Q

Validité de la loi de BEER-Lambert?

A

La loi de Beer-Lambert est uniquement valide sous certaines conditions :
• La lumière doit être monochromatique (une seule λ)
• La solution doit être homogène
• Le soluté ne doit émettre de fluorescence
• La concentration de la solution ne doit pas être trop élevée

17
Q

La concentration est égale à?

A

La concentration est égale à l’absorbance divisé par le coefficient d’absorption et la longueur du chemin optique.

18
Q

Qu’est-ce qui caractérise le Dosage spectrophotométrique des protéines?

A

• Absorbance à 280 nm (A280) :
• Utilisée pour estimer la
concentration de protéines.
• Si ε est connue, on peut déduire la
concentration d’une protéine en
mesurant son absorbance à 280

Cependant, chaque protéine à son propre coefficient d’absorption. Le coefficient d’absorption d’une protéine X à 280 nm dépend de la taille de la protéine évaluée et du contenu en acide aminé de cette protéine : une protéine qui contient plus de résidus d’acides aminés aromatiques absorbera une plus grande portion du rayonnement.

19
Q

Qu’est-ce qui caractérise Dosage spectrophotométrique des acides nucléiques Spectre d’absorption de l’ADN ou de l’ARN?

A

Les groupements purine et pyrimidines des nucléotides absorbent la lumière à 260 nm dans le spectre UV. C’est ce pic qui est utilisé pour calculer la concentration. Mais, lors du dosage de l’ADN, il est fréquent de mesurer aussi l’absorbance à 280nm. Le ratio de l’absorbance à 260 nm sur l’absorbance à 280 nm pour un échantillon pur d’ADN et d’ARN est d’environ 2. Un ratio inférieur à 2 indique que l’échantillon d’ADN
ou d’ARN n’est pas pur et contient des molécules contaminantes (comme des protéines). Ainsi, lors du dosage de l’ADN, on mesure l’absorbance à 260 nm pour mesurer la concentration et l’absorbance à 280 nm pour vérifier la pureté de l’échantillon.

L’absorbance à 280 nm d’une solution contenant un mélange d’ADN et de
protéines est la somme de l’absorbance due aux protéines et de
l’absorbance due à l’ADN.

20
Q

Qu’est-ce que la propriété additive des absorbances?

A

Une propriété importante des absorbances est qu’elles sont additives. Cela signifie que si une solution contient plusieurs espèces absorbantes, l’absorbance de la solution à une longueur d’onde donnée est la somme de toutes les absorbances à cette longueur d’onde.

• Si A260 / A280 ≥ 1,8 alors on considère que la solution d’ADN est
biochimiquement utilisable.
• Si le rapport est < à 1,8, alors on peut soupçonner la présence
importante de protéines qui contaminent l’échantillon.

21
Q

Qu’est-ce que le dosage direct vs indirect?

A

1) Dosage direct : mesure de l’absorbance à 280 nm (UV).
2) Dosage indirect : réaction colorimétrique.
Utilisé lorsque la substance à doser ne possède pas d’absorption dans
des longueurs d’ondes mesurables, ou lorsque d’autres substances
interfèrent avec la mesure de la longueur d’ondes.
➢ Méthode de Bradford
➢ Méthode du Biuret

Dans les deux cas, il y a formation d’une couleur à la suite d’une réaction
chimique entre un réactif et les protéines.

22
Q

Qu’est-ce la méthode de Bradford?

A

• Bleu de Coomassie G-250 se lie à aux acides aminés
basiques (Arg, Lys, His) par des liens ioniques, et
aux acides aminés hydrophobes par des
interactions hydrophobes.
• La couleur passe du brun-rouge au bleu
• On mesure l’absorbance à 595 nm.
• Sensibilité de 1 à 10 µg

23
Q

Qu’est-ce que la méthode de biuret?

A

• À un pH alcalin, le sulfate de cuivre du réactif
réagit avec les liaisons peptidiques des
protéines, ce qui le réduit partiellement.
• Le Cu2+ forme alors un composé bleu-pourpre
• On mesure l’absorbance à 540 nm
• Sensibilité de 1 à 20 mg.