Chromatographie Sur Colonne Flashcards
Quels sont les différents type de chromatographies sur colonne?
Les différents types de chromatographie sur colonne se distinguent à la fois par le critère de séparation utilisé et les applications possibles pour cette méthode. Cependant, il faut garder en tête que souvent, plus d’un critère de séparation peut être impliqué dans une même chromatographie.
Dans le cadre de ce cours, nous allons nous pencher sur trois types de
chromatographie sur colonne:
la chromatographie d’exclusion, aussi appelée filtration sur gel ou tamisage moléculaire, qui utilise la taille et la forme des molécules comme critère de séparation,
la chromatographie échangeuse d’ions, qui se base sur la charge ionique des particules pour les séparer,
et la chromatographie d’affinité, qui met à profit la structure des protéines pour les séparer d’un mélange.
Qu’est-ce que la phase mobile et celle stationnaire?
La colonne contient une phase stationnaire, qui consiste en une matrice, un gel ou une résine, qui reçoit une alimentation permanente en un solvant donné. Ce solvant constitue la phase mobile de la chromatographie que l’on appelle aussi l’éluant.
Dans cet exemple, un mélange de deux molécules est déposé sur le dessus de la phase stationnaire. Il est ensuite entrainé vers le bas de la colonne par le solvant. On recueille l’éluat (c-a-d le liquide qui sort au bas de la colonne) en petites fractions. L’élution est le processus par lequel une substance est entraînée par la phase mobile au travers de la phase stationnaire. Les différentes molécules vont traverser la colonne à différentes vitesses d’élution, et vont donc se retrouver dans différentes fractions recueillies, qui pourront ensuite être analysées.
Qu’est-ce que le HPLC?
La chromatographie liquide à haute performance, communément appelée HPLC, est en quelque sorte une version robotisée de la chromatographie. Le flux de solvant est contrôlé par un ordinateur et la colonne est pressurisée grâce à un système de pompe. De plus, la colonne est habituellement reliée à un ou plusieurs détecteurs, par exemple un spectrophotomètre, un voltmètre ou un pH-mètre. Des fractions du
volume désiré sont récupérées automatiquement grâce à un collecteur de fractions. Un appareil de HPLC peut servir à presque tous les types de chromatographie sur colonne, il suffit d’utiliser une colonne qui contient la résine appropriée.
Qu’est-ce que le tamisage moléculaire?
La chromatographie d’exclusion, aussi appelée filtration sur gel ou tamisage moléculaire, utilise comme phase stationnaire un gel formé de billes poreuses. Chacune de ces billes contient des pores, dont la grosseur varie en fonction du type de gel. Selon leur grosseur, certaines molécules peuvent circuler à l’intérieur des pores, d’autres sont trop grosses pour y entrer.
En résumé, les grosses molécules vont être exclues des pores, tandis que les petites molécules seront incluses. Pour les molécules de tailles intermédiaires, elles seront parfois incluses, parfois exclues.
Les plus grosses molécules, qui sont colorées en rouge, se séparent rapidement des autres molécules faisant partie du mélange puisqu’elles sont exclues des billes poreuses, et pourront donc être éluées en premier.
Le passage d’une molécule dans chacune des billes ralentit son élution. Par conséquent, les petites molécules sortiront en derniers de la colonne.
Les molécules de taille intermédiaire sont partiellement incluses dans le gel et sont donc éluées plus lentement que les grosses molécules, mais plus vite que les petites molécules, qui elles, entrent facilement dans les billes poreuses et sont aisément incluses dans le gel.
Ainsi, suite à cette chromatographie, les composantes du mélange initial auront alors été séparées selon leur taille.
Pour des molécules ayant des formes similaires (par exemple pour un ensemble de protéines de forme sphérique), les molécules sont éluées dans l’ordre inverse des masses moléculaires. Les plus grosses molécules seront exclues du gel et pourront donc migrer plus vite, tandis que les plus petites vont être incluses dans le gel et migreront donc moins vite.
Cependant, si deux molécules de même taille ont une forme différente, cela peut avoir un impact important sur leur vitesse d’élution.
La migration est donc à la fois influencée par la taille et la forme.
Qu’est-ce que le rayon de stokes?
Le rayon de Stokes décrit le poids moléculaire apparent d’une particule (le poids d’une particule sphérique ayant la même vitesse d’élution par filtration sur gel). Le rayon de Stokes d’un soluté est le rayon d’une sphère dure qui diffuse à la même vitesse que ce soluté.
NOTER que les rayons de Stokes sont déterminés expérimentalement en comparant la vitesse d’élution lors d’une chromatographie par tamisage moléculaire avec les vitesses d’élution de standards sphériques de taille connue.
Qu’est-ce que le rayon de stokes?
Le rayon de Stokes décrit le poids moléculaire apparent d’une particule (le poids d’une particule sphérique ayant la même vitesse d’élution par filtration sur gel). Le rayon de Stokes d’un soluté est le rayon d’une sphère dure qui diffuse à la même vitesse que ce soluté.
NOTER que les rayons de Stokes sont déterminés expérimentalement en comparant la vitesse d’élution lors d’une chromatographie par tamisage moléculaire avec les vitesses d’élution de standards sphériques de taille connue.
Quelles sont les types de gels les plus utilisés ?
• Polymère de glucose : dextran
• Sephadex
• Galactose + glucose : agarose
• Sepharose
• Acrylamide : polyacrylamide
• Sephacryl
Qu’est-ce que le domaine de fractionnement et la limite d’exclusion?
• Le domaine de fractionnement est défini par le domaine de masses
moléculaires pour lesquelles il y aura une séparation optimale selon la
masse moléculaire.
• La limite d’exclusion est la limite supérieure du domaine de
fractionnement : c’est la masse moléculaire au-delà de laquelle les
molécules ne pénètrent plus dans le gel.
Qu’est-ce que la courbe d’élution?
Représentation graphique de la concentration des solutés en fonction du
temps ou du volume de l’éluat.
La concentration peut s’exprimer par l’absorbance, la fluorescence…
Le volume d’élution désigne le volume d’éluant nécessaire pour éluer, donc pour faire sortir de la colonne, une molécule particulière.
Ce volume est la différence de volume entre le centre du pic de concentration du soluté et le dépôt de l’échantillon sur la colonne. On dira ici que le volume d’élution du soluté B est plus grand que le volume d’élution du soluté A.
Qu’est-ce que le volume d’éluant, le volume mort et le volume total?
Volume d’éluant nécessaire pour éluer une molécule.
Volume d’élution d’une molécule dont la taille excède la limite d’exclusion du gel, donc qui ne pénètre pas dans les billes.
Volume d’élution d’une molécule qui diffuse totalement dans les billes
Le volume mort est donc le volume d’élution d’une molécule trop grosse pour pénétrer dans les billes, et correspond donc au volume de liquide se trouvant dans la colonne, mais à l’extérieur des billes.
Le volume total étant le volume d’élution d’une molécule qui diffuse totalement dans les billes, il correspond à la fois au volume de liquide à l’intérieur et à l’extérieur des billes, car bien que les petites molécules pénètrent efficacement dans les billes du gel, elles seront également retrouvées dans le liquide à l’extérieur des billes. Finalement, le volume interne de la colonne correspond au volume retrouvé à l’intérieur des billes du gel. On le calcule en soustrayant le volume mort du volume
total.
Qu’est-ce que la La résolution d’un tamisage moléculaire?
La résolution d’un tamisage moléculaire est une mesure de la qualité de séparation des molécules suite à la chromatographie.
Deux critères sont utilisés pour qualifier la résolution: la distance séparant deux sommets sur la courbe d’élution, ainsi que la largeur des pics de la courbe à leur base. On a donc une mauvaise résolution si la distance entre les sommets est faible et que les pics sont larges, une résolution moyenne si la distance entre les sommets est grande, mais que les pics sont larges à la base, et finalement, si les deux critères sont respectés, on peut dire qu’on a une bonne résolution.
Quels sont les exemples d’application du tamisage moléculaire?
Voici un exemple d’application de tamisage moléculaire. Cette méthode est souvent employée pour dessaler une protéine afin de purifier celle-ci.
Vous voyez ici la courbe d’élution obtenue suite au dessalage d’une protéine. La protéine, qui est beaucoup plus grosse que le sel, sort de la colonne en premier, alors que le sel passe dans chacun des pores du gel.
Remarquez ici que l’éluat est analysé par 2 détecteurs : un spectrophotomètre permettant de détecter les protéines lorsqu’on utilise une longueur d’onde de 280nm et un conductimètre permettant de mesurer la conductibilité du mélange et donc de détecter la présence de sel. On peut donc ainsi séparer les 2 types de molécules et ne conserver que les éluats contenant les protéines.
Exemple d’application :
Estimation de la masse moléculaire
• À l’intérieur du domaine de
fractionnement, il existe une relation
linéaire entre le volume d’élution d’un
composé et le logarithme de sa masse
moléculaire.
• Ceci est valable uniquement pour des
molécules de même forme et de même
nature
Quelles sont les caractéristiques de la chromatographie d’échange d’ions?
• La séparation repose sur la charge de la molécule.
• Des groupements ionisables sont fixés sur la matrice.
• Les molécules de charges opposées à celles de la colonne sont retenues.
• Le processus est réversible : les molécules retenues peuvent être éluées
• en ajoutant des sels,
• en changeant le pH,
• en changeant la concentration du tampon d’élution.
Que produit l’utilisation d’un échangeur cationique et un échangeur anionique?
Dans le cas d’une chromatographie avec un échangeur anionique, la résine renferme des charges positives. Il y a ainsi fixation des anions se retrouvant dans la solution à analyser, et ces contre-ions négatifs s’accrochent aux groupements positifs sur la résine.
Lors d’une chromatographie utilisant un échangeur cationique, on utilise une résine qui renferme des charges négatives. Il y a donc fixation des cations qui se retrouvent dans la solution mixte à analyser. Les contre-ions positifs sont retenus par les groupements négatifs liés à la matrice.
Quelle est l’importance du pH?
• La charge des molécules peut être affectée par le pH
• Le pH est un paramètre important en chromatographie d’échange ionique
On peut également les décrire comme des molécules amphotères, soit des composés pouvant réagir comme un acide ou comme une base.
En effet, les acides aminés portent à la fois une fonction carboxylique à charge négative et une fonction amine à charge positive. Certains acides aminéS peuvent également porter une charge sur leur chaîne latérale.
Ces groupements ont chacun un pKa distinct par conséquent ils accepteront ou perdront un proton à un pH distinct. Le pH a donc une influence importante sur les acides aminés et leur charge.
