Specialiserade detektionsmetoder Flashcards
Ge exempel på specialiserade detektionsmetoder
Elektroninfångningsdetektion, flamjonisationsdetektion och masspektrometri är tre specialiserade detektionsmetoder som traditionellt har använts tillsammans med gaskromatografi. De kännetecknas av hög selektivitet och kan ge analysmetoder med hög känslighet.
Hur kan vi hitta rätt molekyl i en droppe blod?
Vi behöver en känslig detektion då många analyter som är intressanta att mäta inte är någon av de mest förekommande analyterna, dem är utspädda med koncentrationer utav ointressanta ämnen.
- Först behöver vi separation
- Sedan känslig detektion där vi kan skilja på 2 snarlika molekyler.
Man kan använda sig av elektroninfångninsdetektion, flamjoniseringsdetektion eller masspektrometri i kombination med gaskromatografi. Men de har blivit allt vanligare/dominerande att använda masspektrofotometri med vätskekromatografi, dock finns det begränsningar vad ett vätskekromatografi-masspektrofotometri-system kan mäta i blodprov. Vi kan också använda oss av immunobaserade tekniker men även dem har sina begränsningar
Vad är vätskekromatografi?
Vätskekromatografi är en teknik som kan separera molekyler genom ett tvåfas-system.
Vanligen kombinerad med UV-detektion, fluorescens- detektion, elektrokemisk detektion (tas ej upp på denna kurs ) och masspektrometri.
En kolonn (G) innehåller en fastfas som kan vara av olika typer.
Med hjälp av en pump så pressas en mobilfas genom kolonnen. Mobilfas kan bestå av vattenbuffert och ett organiskt lösningsmedel som metanol eller acetonitril.
Prov injiceras och fastnar på fastfasen, varpå den elueras av mha av mobilfasen och flödar med denna till detektorn.
Genom att kombinera olika fastfaser och mobilfaser kan man separera det ämne man är intresserad av ifrån andra ämnen i sitt prov.
astfasen består av olika modifierade partiklar.
Det vanligaste är att de är modifierade på så sätt att de binder hydrofoba ämnen => ämnen fastnar om mobilfasen innehåller mycket vatten, lossnar om den innehåller mycket organiskt lösningsmedel. Detta kallas Ombytt Fas, Reversed Phase.
Storleken på partiklarna avgör hur snabbt separationen kan utföras, ju mindre partiklar ju snabbare separation. Dock ökar mottrycket när partiklarna blir mindre.
Om mottryck högre än 400 Atm så kallas det UPLC.
När är gaskromatografi att föredra?
Om ämnena man vill analysera är lättflyktiga så kan man med fördel använda gaskromatografi.
Ämnen som ej är lättflyktiga kan göras mer lättflyktiga genom derivatisering, DVS man hänger på grupper som ändrar ämnets kemiska egenskaper.
Med gaskromatografi kan man få väldigt bra separation.
Kan kombineras med en lång rad olika detektorer.
Vi skall i denna kurs ta upp flamjonisationsdetektion, elektroninfångningsdetektion och masspektrometri
Precis som för vätskekromatografi så använder man två olika faser.
Den mobila fasen är en gas, vanligen helium, som flödar igenom en kolonn, dvs ett glaskapillär.
På kolonnens insida finns en film som interagerar med ämnena i provet, denna utgör stationär fasen.
Kolonnen, vanligtvis 10-30 m är ihop rullad och hänger i en ugn, när man ökar temperaturer i ugnen så eluerar ämnen loss ifrån filmen och följer med gasflödet till detektorn.
Vad är elektroningångningsdetektion= ECD?
Är en detektionsmetod som är selektiv för en förenings elektronegativitet, dvs en dess förmåga att attrahera en elektron.
Hur kan du ta reda på ett grundämnes elektronegativitet?
Det finns olika sätt att räkna ut elektronegativiteten för olika grundämnen och funktionella grupper.
I det periodiska systemet så ökar elektronegativiteten för en grupp när man går ifrån vänster till höger, men minskar med ökat periodnummer.
elektroninfångningsdetektion sägs vara i viss mån selektiv, varför?
Elektronegativiteten anger ett grundämnes förmåga att attrahera en elektron
Fluor- och Klor- och även brom-innehållande molekylär ger isärklass högst signal med elektroninfångningsdetektion, och denna metod kan därför sägas vara i viss mån selektiv med hänseende på dessa substanser.
Hur fungerar elektroninfångningsdetektion?
Detektorn innehåller en radioaktiv källa, t ex nickel 63, som avger elektroner i form av betapartiklar. Dessa joniserar den gas som finns inne i detektorn, vanligtvis kvävgas. Detta skapar ett moln av tillgängliga elektroner. Genom detta elektronmoln skapas en elektronström genom att spänning läggs på. Detektorn försöker hålla denna ström konstant genom att ändra spänningen som läggs på. När en ett ämne som är elektronegativt kommer in i detektorn så attraheras elektroner ifrån elektronmolnet och det finns då färre tillgängliga elektroner där, spänningen som läggs på får då ändras (antal pulser ökas), vilket kan omvandlas till en mätsignal.
Vad är flamjonisationsdetektion= FID? Varför är den inte så lämplig inom biokemi?
Är en av de absolut vanligaste detektorerna för gaskromatografi. Har hög känslighet och stort dynamiskt område. Är selektiv för föreningar som innehåller kol. Smutsas inte ned så lätt och är robust. Används oftast för att analysera flyktiga organiska lösningsmedel.
Ej så lämplig inom biokemi då alla biomolekyler innehåller kol.
T ex på klinisk kemi så används GC-FID för att analysera metanol, etanol, isopropanol och aceton i serum och/eller urin:
Hur fungerar flamjonisationsdetektor?
Bärgasen ifrån GC-kolonnen som även innehåller analyterna blandas med vätgas och förbränns. Förbränningen sker i ändan av ett speciellt munstycke, luft eller syrgas tillförs också. Joner bildas under förbränningen och negativa joner attraheras till en elektrod där de bildar en ström. Strömmen mäts och används för att generera mätsignalen.
Vad är masspektrofotometri?
Masspektrometri är egentligen en samling av olika tekniker som delar den egenskapen att de analyserar ämnen som befinner sig som joner i gasfas
Vad är en masspektrometer?
- Producerar joner i gasfas från ett prov som är i fast fas, lösning eller i gasfas.
- Sorterar joner utifrån deras massa till laddningskvot
- Ger signal som är propitionell mot mängden bildande joner av varje ämne
Största utmaningen med masspektrofotometri för biomedicin?
De flesta biomolekyler gillar att vara i vatten, men masspektrofotometri gillar analyter som är i gasform, detta har varit den största utmaningen men har med tiden kommit flera joniseringstekniker som klarar av detta.
Inom vilka områden är det troligast att man använder/stöter på masspektrometri?
- Analytisk kemi
- forsenisk kemi
- toxikologisk kemi
- Livsmedelskemi
- Läkemedelskemi, farmakologi
För masspektrofotometri behövs vakum, hur genereras det?
För masspektrometri behövs ett vakuum i området 10-4 till 10-6 Pa. För att generera detta vakuum används en turbomolekylärpump, sk turbopump. Turbopumpen behöver ett lägre tryck än atmosfärstryck för att fungera optimalt, detta lägre tryck skapas mha en separat pump, en sk förpump.
Vad kallas de kromatogram man får från en masspektrofotometer?
Det kromatogram som man får ifrån en masspektrometer kallas TIC (Total Ion Current).
Ett värde finns alltid som representerar den högsta signalen i TIC:en, har inringat detta med blått och det är i detta fallet 4,3*10^8.
Vad menas med TIC
Tvådimentionell återgivning av en tredimentionell data. Varje tidssegment är uppbyggt av ett spektrum. Genom att klicka i TIC:en kan man få upp spektrumet. TIC:en är alltså en totalt uppbyggd av tusentals spektra
Berätta hur ett spektrum är uppbyggt
Innehåller intensiteter för alla joner som man skannar av under ett givet tidssegment. Ett spektrum har den relativa intensiteten på y-axeln och m/z-värderna på x-axeln. m/z är massan i förhållande till laddningen. Joner återges här som staplar i spektrumet , de är olika joner som inte är specifika för analyten
Vad händer om du trycker på TIC:en
Trycker man på toppen i TIC:en, i vilken analyten man är intresserad av finns ser man ytterligare joner. JOenen inringad kallas för molekyljonen, M+, vilken ger informstion om molekylens massa. Molekyljonen representerar alltså en jon av de intakta molekylen och om laddningen är +1 som i detta fall så representerar den också direkt molekylens massa
Vad är inringat i rött resp grönt?
Rött= joner från bakgrunden
Grönt= molekyljonen.
Gröna strekade joner är fragment av molekyljonen, dessa ger ytterligare info om molekylens struktur.
