Elektrofores Flashcards
Vad är elektrofores?
Process som gör det möjligt att separera molekyler baserade på storlek eller laddning.
Man använder ett elektriskt fält där molekyler, så som DNA, RNA och proteiner kan vandra i en gel gjord av agaros eller polyakrylamid.
Det elektriska fältet består av en negativ laddning vid en ände som trycker molekylerna genom gelen, och en positiv laddning vid den andra änden som drar molekylerna genom gelen.
Tillsats av kemikalien SDS gör att proteinerna blir negativt laddade och kommer att vandra mot den positiva polen i elektroforesen. De minsta proteinerna vandrar lättare genom porerna i gelen och rör sig fortare än de större proteinerna.
Vad finns de för användningsområden för elektrofores?
- Biokemi
- Medicin
- Molekylärbiologi
- Jordbruksforskning
- Livsmedelskontroll
- Rättskemin
- Industrilaboratorier
Genom att fraktionerade proteiner i plasma kan du få svar på vadå?
- Inflammatorisk aktivitet
- Immunglobulinfördelning
- Alfa-1 antitrypsinbrist
- Förekomst av M-komponent
Det finns olika geltyper, ge exempel
- Agaros (används ofta för separation av nukleinsyror)
- Polyacrylamid
Hur kan man använda sig av storleksmarkör?
Tillsats av kemikalien SDS gör att proteinerna blir negativt laddade och kommer att vandra mot den positiva polen i elektroforesen. De minsta proteinerna vandrar lättare genom porerna i gelen och rör sig fortare än de större proteinerna.
Beskriv elektrofores med agarose
- Agaros i buffert smälts
- Brunnskammare sätts på gelkasset
- Gelkassetten placeras i elektroforesapparaten.
- Buffert hälls på och brunnskammarna tas bort.
VArför använder du dig av buffert i elektrofores?
För att det ska finnas joner som bär strömmen, men oclså för att upprätthålla pH vid en relativ konstant värde.
Det finns ett antal buffertar som används för elektrofores, vilka är de vanligaste för nukleinsyror?
- Tris/Acetat/EDTA (TAE)
- Tris/borat/EDTA (TBE)
När använder man sig av polyalkrylamid-gel?
Vid separation av proteiner
Berätta om polyalkrylamid-gel.
Vad består de av?
Hur bildas gelen?
Någon av komponenterna som är giftiga?
En syntetisk produkt som består av:
- Akrylamid
- Polyakrylamid
- Metylen-bis-akrylamid
Byggs upp av akrylamid och metylen-bis-akrylamid. Förhållandet mellan dessa två ämnen avgör gelens porstorlek.
Bisakrylamid bildar tvärbryggor som förbinder polyakrylamid-kedjorna. Skapr ett nätverk som molekylerna måste ta sig igenom.
Akrylamid i lösning är giftigt! Men när gelen är gjuten och polymeriseringen klar är produkten ofarlig.
Skillnaden på:
- SDS-page (Sodium-dodecyl-sulfat polyakrylamid gel elektrofores)
- IEF (Isoelektrisk fokusering)
- 2-D (2-dimisionell gel elektrofores
- Western blot
SDS-page
Separerar proteiner efter storlek
IEF
Separerar proteiner efter skillnad i isoelektrisk punkt
2-D
Separerar proteiner först efter isoelektrisk punkt sedan storlek
Western blot
Separerar proteiner och detekterar med antikropp
Vid detektion av proteiner på gel används några färgningar oftare än andra. Vilka är de vanliga färgningarna?
- Coomassie blå
- Silverfärgning
- Fluorescenta färger
- Autokardiografi av radioaktivt inmärkta proteiner
Vad är isoelektrisk punkt?
Det pH där nettoladdningen hos ett protein är noll.
Proteiner kan inte röra sig i ett elektriskt fält när de nått sin isoelektriska punkt p.g.a att de är oladdade.
Detta uttnyttjas vid isoelektrisk fokusering.
Hur ändrar proteiner laddning?
Beroende på pH i omgivningen
Hur fungerar isoelektrisk fokusering?
Provet med proteinerna laddas med pH-gradient och de vandrar pga sin laddning till sin isoelektriska punkt (iP) dvs när nettoladdningen är noll.
Olika proteiner har olika iP och blir elektriskt neutrala vid olika pH dvs stannar på olika ställen i gelen.
Hur kan du bilda pH gradient ?
En teknik att bilda pH gradienten är att använda sig av buffrande grupper som binds kovalent till gel massan. Sura och basiska buffrande grupper blandas. IPG strips kan köpas färdiga
Hur fungerar PAGE (polyakrylamid Gelelektrofores)?
Formen hos proteiner och dess laddning (aminosyrasammansättningen) påverkar vandringsmönstret.
Proteiner är organiserade på olika nivåer, beskriv detta.
Primär struktur
Linjär kedja av aminosyror
Sekundär struktur
domäner av repeterande strukturer, såsom β-pleated sheets and α-helices
Tertiär struktur
3-dimensionell struktur av veckad polypeptide, sammanlänkad av disulfide bindningar, elektrostatiska och hydrofobiska interaktioner.
´Kvartär struktur
Flera polypeptide kedjor är sammanlänkade och bildar ett fungerande protein.
Hur kan vi få proteiner att separeras bara med avseende på storlek?
Genom SDS-polyakrylamid gel-elektrofores (SDS-PAGE)
Först värmebehandlas provet i närvaro av DTT för att proteinet skall återfå sin primär struktur.
SDS binder in till proteiner med ett bestämt antal molekyler/aminosyra. Effekten blir att laddningen/massan blir konstant på proteiner.
Oavsett hur stort protein är; så kommer det att vandra lika fort i en lösning som man lagt en spänning över.
I SDS-PAGE orsakas storleks-spearation av hur tätt nätverket av akrylamid är. Stora proteiner bromsas upp mer än små och vandrar därför långsammare:
12 kol lång kedja negativt laddad sulfatgrupp. SDS tillsätts vilket gör proteinet negativt laddat. SDS lägger sig runt proteinet och maskerar då proteinets egna nettoladdningen. Alla proteiner får då samma negativa laddning relativt till sin storlek och då spelar inte aminosyrasammansättningen någon roll. Proteiner separeras endast beroende på storlek.
SDS denaturerar proteiner till enskilda polypeptider genom att SDS förhindrar nästan alla icke-kovalenta interaktioner i proteinerna.
Alltså:
När proteinerna har sin primärstruktur och är negativt laddade förflyttar de sig mot den positiva elektroden.
Proteiner separeras efter storlek
Proteiner med lägre molekylvikt rör sig snabbre i gelen
För att visulisera proteinerna färgas gelen efter separationen
Vad kan göras med SDS PAGE?
- Bestämma proteiners storlek, renhet och koncentration samt identifiera proteiner.
- Migrationen är omvänt propitionell till logaritmen av proteinets molekylvikt!
2D-PAGE kan delas in i två dimesioner, förklara detta.
Vad kallas hela processen från protein extrakt-> SDS-PAGE?
Första dimensionen görs en isoelektrisk fokusering. I andra dimensionen placeras den isoelektriska fokuseringsgelen i SDS-PAGE där de bestämms: proteiners storlek, renhet och koncentration samt identifierar proteiner
Processen från proteinextrakt till SDS-PAGE kallas 2-D elektrofores
Vad kan du använda 2-D ektrofores till?
- Separera tusentals proteiner på samma gång
- Bestämma proteinernas isoelektriska punkt
- Bestämma proteinernas molekylvikt
- Bestämma relativ mängd av varje protein (ex. före och efter behandling) Identifiera proteiner med masspektrometri
- Titta på protein modifieringar.
Det finns ytterligare tillämpningar som kan användas vid SDS-PAGE, berätta om detta.
Vad för typ av metod är Western Blot för metod?
En metod för att detektera specifika proteiner i en proteinblandning.
- En kombination av SDS-PAGE
- Detektion med specifika antikroppar
Berätta kort om hur Western Blot metoden går till
Används för att mäta totalprotein koncentration i prov.
- Proverna laddas på gelen.
- Elektroforetisk separation med SDS
- Transfer-överföring till membran (ej SDS)
- inkubera i blocklösning
- Inkubera med antikropp och substrat
- Visualisering/Detektion. Det finns olika metoder för detektion
Olika detektionssystem finns för western blot, berätta om?
Fluorescens, Kolorimetrisk, chemoluminiscens.
Vanliga substrat är HRP, AP
Primär och Sekundärantikropp är producerade i olika species
Före elektrofores behöver provet bearbetas för att få proteinerna i lösning. Ge exempel på provpreparation
- Frysa-tina
- Ultraljud
- Mekanisk roterande kniv
- kemisk lysering
- Mekaniskt-slå sönder-bullet blender
Berätta om sample buffert som prov preparation
Provet mixas med sample buffert och värmebehandlas för att proteinet skall återfå sin primär struktur.
- *Värme** denaturerar proteiner
- *DTT** (dithiothreitol) eller β-MeoH bryter disulfid-bryggor i proteiner
SDS - denaturerar och gör proteinet negativt laddat.
Buffert- justera pH.
Glycerol-ökar viskositeten. Provet blir “tungt”
Hur fungerar elektrofores?
skriv bätte
Elektrofores är en metod att separera molekyler med olika laddning. Nästan alla biomolekyler är laddade.
Elektrofores är en metod som karaktäriserar och separerar joner. Ett exempel är separeringen av aminosyror. Några droppar av aminosyrablandningen överförs till ett papper som fuktats med en buffertlösning med lämpligt pH. Därefter lägger man en elektrisk spänning på ca 300 V över pappret. Då kommer negativa aminosyrajoner att vandra mot anoden (anafores) och positiva mot katoden (katafores)
Berätta om fördelar och nackdelar med Agaros och Polyakrylamid?
Berätta om skillnader på Agaros och Polyakrylamid
