Brainscape's Knowledge GenomeTM

Browse over 1 million classes created by top students, professors, publishers, and experts.


See full index

BMA 033 > Elektrofores > Flashcards

Elektrofores Flashcards

1
Q

Vad är elektrofores?

A

Process som gör det möjligt att separera molekyler baserade på storlek eller laddning.

Man använder ett elektriskt fält där molekyler, så som DNA, RNA och proteiner kan vandra i en gel gjord av agaros eller polyakrylamid.

Det elektriska fältet består av en negativ laddning vid en ände som trycker molekylerna genom gelen, och en positiv laddning vid den andra änden som drar molekylerna genom gelen.

Tillsats av kemikalien SDS gör att proteinerna blir negativt laddade och kommer att vandra mot den positiva polen i elektroforesen. De minsta proteinerna vandrar lättare genom porerna i gelen och rör sig fortare än de större proteinerna.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
2
Q

Vad finns de för användningsområden för elektrofores?

A
  • Biokemi
  • Medicin
  • Molekylärbiologi
  • Jordbruksforskning
  • Livsmedelskontroll
  • Rättskemin
  • Industrilaboratorier
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
3
Q

Genom att fraktionerade proteiner i plasma kan du få svar på vadå?

A
  • Inflammatorisk aktivitet
  • Immunglobulinfördelning
  • Alfa-1 antitrypsinbrist
  • Förekomst av M-komponent
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
4
Q

Det finns olika geltyper, ge exempel

A
  • Agaros (används ofta för separation av nukleinsyror)
  • Polyacrylamid
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
5
Q

Hur kan man använda sig av storleksmarkör?

A

Tillsats av kemikalien SDS gör att proteinerna blir negativt laddade och kommer att vandra mot den positiva polen i elektroforesen. De minsta proteinerna vandrar lättare genom porerna i gelen och rör sig fortare än de större proteinerna.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
6
Q

Beskriv elektrofores med agarose

A
  1. Agaros i buffert smälts
  2. Brunnskammare sätts på gelkasset
  3. Gelkassetten placeras i elektroforesapparaten.
  4. Buffert hälls på och brunnskammarna tas bort.
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
7
Q

VArför använder du dig av buffert i elektrofores?

A

För att det ska finnas joner som bär strömmen, men oclså för att upprätthålla pH vid en relativ konstant värde.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
8
Q

Det finns ett antal buffertar som används för elektrofores, vilka är de vanligaste för nukleinsyror?

A
  • Tris/Acetat/EDTA (TAE)
  • Tris/borat/EDTA (TBE)
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
9
Q

När använder man sig av polyalkrylamid-gel?

A

Vid separation av proteiner

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
10
Q

Berätta om polyalkrylamid-gel.

Vad består de av?

Hur bildas gelen?

Någon av komponenterna som är giftiga?

A

En syntetisk produkt som består av:

  • Akrylamid
  • Polyakrylamid
  • Metylen-bis-akrylamid

Byggs upp av akrylamid och metylen-bis-akrylamid. Förhållandet mellan dessa två ämnen avgör gelens porstorlek.

Bisakrylamid bildar tvärbryggor som förbinder polyakrylamid-kedjorna. Skapr ett nätverk som molekylerna måste ta sig igenom.

Akrylamid i lösning är giftigt! Men när gelen är gjuten och polymeriseringen klar är produkten ofarlig.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
11
Q

Skillnaden på:

  • SDS-page (Sodium-dodecyl-sulfat polyakrylamid gel elektrofores)
  • IEF (Isoelektrisk fokusering)
  • 2-D (2-dimisionell gel elektrofores
  • Western blot
A

SDS-page

Separerar proteiner efter storlek

IEF

Separerar proteiner efter skillnad i isoelektrisk punkt

2-D

Separerar proteiner först efter isoelektrisk punkt sedan storlek

Western blot

Separerar proteiner och detekterar med antikropp

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
12
Q

Vid detektion av proteiner på gel används några färgningar oftare än andra. Vilka är de vanliga färgningarna?

A
  • Coomassie blå
  • Silverfärgning
  • Fluorescenta färger
  • Autokardiografi av radioaktivt inmärkta proteiner
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
13
Q

Vad är isoelektrisk punkt?

A

Det pH där nettoladdningen hos ett protein är noll.

Proteiner kan inte röra sig i ett elektriskt fält när de nått sin isoelektriska punkt p.g.a att de är oladdade.

Detta uttnyttjas vid isoelektrisk fokusering.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
14
Q

Hur ändrar proteiner laddning?

A

Beroende på pH i omgivningen

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
15
Q

Hur fungerar isoelektrisk fokusering?

A

Provet med proteinerna laddas med pH-gradient och de vandrar pga sin laddning till sin isoelektriska punkt (iP) dvs när nettoladdningen är noll.

Olika proteiner har olika iP och blir elektriskt neutrala vid olika pH dvs stannar på olika ställen i gelen.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
16
Q

Hur kan du bilda pH gradient ?

A

En teknik att bilda pH gradienten är att använda sig av buffrande grupper som binds kovalent till gel massan. Sura och basiska buffrande grupper blandas. IPG strips kan köpas färdiga

17
Q

Hur fungerar PAGE (polyakrylamid Gelelektrofores)?

A

Formen hos proteiner och dess laddning (aminosyrasammansättningen) påverkar vandringsmönstret.

18
Q

Proteiner är organiserade på olika nivåer, beskriv detta.

A

Primär struktur

Linjär kedja av aminosyror

Sekundär struktur

domäner av repeterande strukturer, såsom β-pleated sheets and α-helices

Tertiär struktur

3-dimensionell struktur av veckad polypeptide, sammanlänkad av disulfide bindningar, elektrostatiska och hydrofobiska interaktioner.

´Kvartär struktur

Flera polypeptide kedjor är sammanlänkade och bildar ett fungerande protein.

19
Q

Hur kan vi få proteiner att separeras bara med avseende på storlek?

A

Genom SDS-polyakrylamid gel-elektrofores (SDS-PAGE)

Först värmebehandlas provet i närvaro av DTT för att proteinet skall återfå sin primär struktur.

SDS binder in till proteiner med ett bestämt antal molekyler/aminosyra. Effekten blir att laddningen/massan blir konstant på proteiner.

Oavsett hur stort protein är; så kommer det att vandra lika fort i en lösning som man lagt en spänning över.

I SDS-PAGE orsakas storleks-spearation av hur tätt nätverket av akrylamid är. Stora proteiner bromsas upp mer än små och vandrar därför långsammare:

12 kol lång kedja negativt laddad sulfatgrupp. SDS tillsätts vilket gör proteinet negativt laddat. SDS lägger sig runt proteinet och maskerar då proteinets egna nettoladdningen. Alla proteiner får då samma negativa laddning relativt till sin storlek och då spelar inte aminosyrasammansättningen någon roll. Proteiner separeras endast beroende på storlek.

SDS denaturerar proteiner till enskilda polypeptider genom att SDS förhindrar nästan alla icke-kovalenta interaktioner i proteinerna.

Alltså:

När proteinerna har sin primärstruktur och är negativt laddade förflyttar de sig mot den positiva elektroden.

Proteiner separeras efter storlek

Proteiner med lägre molekylvikt rör sig snabbre i gelen

För att visulisera proteinerna färgas gelen efter separationen

20
Q

Vad kan göras med SDS PAGE?

A
  • Bestämma proteiners storlek, renhet och koncentration samt identifiera proteiner.
  • Migrationen är omvänt propitionell till logaritmen av proteinets molekylvikt!
21
Q

2D-PAGE kan delas in i två dimesioner, förklara detta.

Vad kallas hela processen från protein extrakt-> SDS-PAGE?

A

Första dimensionen görs en isoelektrisk fokusering. I andra dimensionen placeras den isoelektriska fokuseringsgelen i SDS-PAGE där de bestämms: proteiners storlek, renhet och koncentration samt identifierar proteiner

Processen från proteinextrakt till SDS-PAGE kallas 2-D elektrofores

22
Q

Vad kan du använda 2-D ektrofores till?

A
  • Separera tusentals proteiner på samma gång
  • Bestämma proteinernas isoelektriska punkt
  • Bestämma proteinernas molekylvikt
  • Bestämma relativ mängd av varje protein (ex. före och efter behandling) Identifiera proteiner med masspektrometri
  • Titta på protein modifieringar.
23
Q

Det finns ytterligare tillämpningar som kan användas vid SDS-PAGE, berätta om detta.

A
24
Q

Vad för typ av metod är Western Blot för metod?

A

En metod för att detektera specifika proteiner i en proteinblandning.

  • En kombination av SDS-PAGE
  • Detektion med specifika antikroppar
25
Q

Berätta kort om hur Western Blot metoden går till

A

Används för att mäta totalprotein koncentration i prov.

  1. Proverna laddas på gelen.
  2. Elektroforetisk separation med SDS
  3. Transfer-överföring till membran (ej SDS)
  4. inkubera i blocklösning
  5. Inkubera med antikropp och substrat
  6. Visualisering/Detektion. Det finns olika metoder för detektion
26
Q

Olika detektionssystem finns för western blot, berätta om?

A

Fluorescens, Kolorimetrisk, chemoluminiscens.

Vanliga substrat är HRP, AP

Primär och Sekundärantikropp är producerade i olika species

27
Q

Före elektrofores behöver provet bearbetas för att få proteinerna i lösning. Ge exempel på provpreparation

A
  • Frysa-tina
  • Ultraljud
  • Mekanisk roterande kniv
  • kemisk lysering
  • Mekaniskt-slå sönder-bullet blender
28
Q

Berätta om sample buffert som prov preparation

A

Provet mixas med sample buffert och värmebehandlas för att proteinet skall återfå sin primär struktur.

  • *Värme** denaturerar proteiner
  • *DTT** (dithiothreitol) eller β-MeoH bryter disulfid-bryggor i proteiner

SDS - denaturerar och gör proteinet negativt laddat.

Buffert- justera pH.

Glycerol-ökar viskositeten. Provet blir “tungt”

29
Q

Hur fungerar elektrofores?

skriv bätte

A

Elektrofores är en metod att separera molekyler med olika laddning. Nästan alla biomolekyler är laddade.

Elektrofores är en metod som karaktäriserar och separerar joner. Ett exempel är separeringen av aminosyror. Några droppar av aminosyrablandningen överförs till ett papper som fuktats med en buffertlösning med lämpligt pH. Därefter lägger man en elektrisk spänning på ca 300 V över pappret. Då kommer negativa aminosyrajoner att vandra mot anoden (anafores) och positiva mot katoden (katafores)

30
Q

Berätta om fördelar och nackdelar med Agaros och Polyakrylamid?

A
31
Q

Berätta om skillnader på Agaros och Polyakrylamid

A

BMA 033 (11 decks)

Brainscape helps you reach your goals faster, through stronger study habits.
© 2024 Bold Learning Solutions. Terms and Conditions