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bcm 21 > Séparation par chromatographie > Flashcards

Séparation par chromatographie Flashcards

1
Q

Sur quoi est basée la chromatographie (2)?

A

1-Utilisation d’une phase mobile (contient le mélange de substances à fractionner)

2-Utilisation d’une phase stationnaire (au travers de laquelle les substances sont séparées)

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2
Q

Quel est l’effet des interactions des différentes substances avec la phase stationnaire?

A

Les interactions ralentissent plus ou moins leur migration au travers de cette phase selon les propriétés respectives de chaque substance.

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3
Q

Quelles sont les propriétés communément utilisées pour effectuer le fractionnement (3)? Quel est le type de chromatographie utilisé pour chacune?

A

1-Les interactions ioniques —> chromatographie par échange d’ions
2-La taille —> chromatographie par gel-filtration
3-La spécificité —> chromatographie d’affinité

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4
Q

Dans un processus d’échange d’ions, les ions liés ________ à un support insoluble (R : phase stationnaire) sont remplacés de manière ________ par des ions en solution. Illustrer la réaction.

A

1-électrostatiquement
2-réversible

Réaction : R+A- + B- <——> R+B- + A-
(R+A- est un échangeur d’anions sour la forme A-)

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5
Q

Qu’est-ce qu’un échangeur de cations? Et un échangeur d’anions?

A

Échangeur de cations : Il porte des groupes chargés négativement (R-) et lierait des cations de manière réversible.

Échangeur d’anions : Il porte des groupes chargés positivement (R+) et lierait des anions de manière réversible.

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6
Q

Vrai ou faux : Les protéines portent soit des charges positives ou négatives et peuvent lier soit un échangeur d’anions ou de cations.

A

Faux : Les protéines portent à la fois des charges positives et négatives et peuvent lier à la fois un échangeur d’anions ou de cations.

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7
Q

L’affinité avec laquelle une protéine se lie à un échangeur d’ions dépend de quoi (2)?

A

1-Du pH de la solution (puisque la charge nette des protéines varie selon le pH)

2-De la nature et des concentrations des autres ions en solution (qui vont aussi compétitionner pour les sites de liaison de l’échangeur d’ions)

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8
Q

Les échangeurs utilisés en chromatographie des protéines dépendent de quelles caractéristiques importantes (2)?

A

1-La nature de leur matrice
2-Le type de groupement fonctionnel utilisé pour favoriser l’attachement de la protéine

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9
Q

Que sont les matrices utilisées en chromatographie? Comment sont-elles appelées?

A

Ce sont des polymères insolubles préparés sous formes de billes appelées familièrement résines.

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10
Q

Quels sont les polymères les plus souvent utilisés dans les matrices pour chromatographie par échange d’ions ?

A

Ce sont des polysaccarides comme le cellulose ou des dérivés du cellulose, de l’agarose ou autres polymères.

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11
Q

Quelle est la caractéristique des polymères utilisés dans les matrices pour chromatographie qui permet la pénétration d’une protéine?

A

Ces polymères sont suffisamment poreux afin de permettre la pénétration d’une protéine et le réseau des pores génère une surface beaucoup plus large que la surface de l,extérieur de la bille.

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12
Q

Qu’est-ce que les échangeurs d’ions exploitent sur la protéine à un pH donné? Qu’est-ce que cela permet?

A

Ils exploitent la présence d’une charge nette sur la protéine à un pH donné qui leur permettent d’interagir par attraction électrostatique.

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13
Q

Quelles sont les deux classes d’échangeurs? Quelles sont les charges qu’ils portent?

A

1-Les échangeurs anioniques qui portent une charge positive
2-Les échangeur cationiques qui possèdent une charge négative

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14
Q

Chaque classe d’échangeurs se divise en groupe dit «________» qui reste pleinement chargé entre pH __ et __ et «________» qui est chargé dans une gamme de pH plus ________.

A

-échangeur fort
- (3)
- (10)
-restreint

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15
Q

Quels sont les groupements chimiques greffés sur les matrices (4)? Quelle est leur force?

A

1-QAE : amine quaternaire (N+pKa environ 9,5) —> échangeur anionique fort

2-Sulfonates —> échangeur cationique fort

3-DEAE : amine tertiaire (partiellement chargé à partir de pH 7 à 8) —> échangeur anionique faible

4-CM : carboxyméthyle (pleinement chargé à partir de pH 4,5) —> échangeur cationique faible

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16
Q

Comment les protéines se lient aux échangeurs?

A

Par des forces électrostatiques entre la surface de la protéine et les groupement chargés sur l’échangeur.

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17
Q

Les charges de l’échangeur sont contrebalancées par quoi? Que doit alors faire une protéine pour s’attacher?

A

Les charges de l’échangeur sont contrebalancées par des contre-ions (ions métalliques, des ions de sel, ou des ions du tampon). Une protéine doit alors déplacer les contre-ions pour s’attacher.

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18
Q

Vrai ou faux : La protéine est également neutralisée par des contre-ions.

A

Vrai

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19
Q

Qu’est-ce que ça fait que la protéine est neutralisée par des contre-ions?

A

La protéine doit posséder une plus grande affinité pour l’échangeur que pour les contre-ions qu’elle doit déplacer

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20
Q

Comment sont choisis le pH et la concentration saline de la solution dans laquelle la protéine est dissoute? Pour la chromatographie d’ions

A

Ils sont choisis de sorte que cette protéine se trouve immobilisée sur l’échangeur d’ions.

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21
Q

Une fois que la solution de protéines est appliquée sur le haut de la colonne contenant l’échangeur, qu’est-ce qui doit être fait?

A

On doit laver la colonne avec une solution tampon.

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22
Q

Expliquer comment les différentes protéines se lieront à l’échangeur d’ions avec des affinités différentes.

A

-Les protéines ayant une affinité relativement faible pour l’échangeur d’ions migreront plus rapidement dans la colonne que celles qui lient l’échangeur avec une plus forte affinité.

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23
Q

Plus l’affinité de liaison d’une protéine pour l’échangeur est ______, plus la migration sera ______.

A

-forte
-retardée

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24
Q

Qu’est-ce que le procédé d’élution fractionnée?

A

Les protéines liées à l’échangeur d’ions peuvent être éluées par un tampon de concentration saline supérieure au tampon de lavage. Ainsi, avec plusieurs lavages, différentes protéines sont recueillies selon leur affinité avec la résine. Le tampon à forte concentration saline permet la migration de la protéine d’intérêt plus rapidement.

25
Q

Normalement, le ____ ou le ____ sont utilisés pour l’élution.

A

KCl ou NaCl

26
Q

Qu’est-ce qui déplace directement la protéine dans la colonne d’élution? Comment? Dans l’élution fractionné

A

le sel, les ions occupent les sites chargés devenus disponibles et bloquent le
rattachement de la protéine

27
Q

Qu’est-ce que le procédé d’élution par gradient? Quel est son avantage?

A

l’utilisation d’un gradient linéaire,
où la concentration saline de la solution d’élution varie de façon linéaire avec le volume qui passe dans la colonne
permet de libérer, les unes après les autres, les différentes protéines liées à l’échangeur d’ions selon leur affinité

avantage= élue efficacement des ions fortement retenus sans saturer la colonne, ce qui permet des meilleurs résolution des pics chromatographies

28
Q

Comment sont séparées les molécules dans la chromatographie par gel-filtration ou tamis moléculaire?

A

les molécules sont séparées selon leur taille et leur forme

29
Q

Quels sont les principes de la chromatographies par gel-filtration (3)?

A

1) la phase stationnaire (résine) consiste en un réseau de polymères réticulé
possédant des pores, fabriqué sous forme de billes

2) les pores dans les billes du gel sont suffisamment grands afin de permettre
la pénétration complète des petites molécules, mais ils ne laissent pas pénétrer toutes les protéines à partir d’une certaine taille => la limite d’exclusion

3) les protéines qui ne pénètrent pas dans les pores traversent la colonne plus rapidement que les protéines retenues dans les pores des billes

30
Q

Comment sont faites les matrices utilisées dans la chromatographie par gel-filtration?

A

les matrices utilisées sont faites de polymères insolubles à base de polysaccharides comme le dextrane ou l’agarose ou de polyacrylamide préparées sous la forme de billes réticulées (poreuses)

31
Q

Vrai ou faux : Dans des conditions optimales (chromatographie par gel-filtration), toutes les pores sont accessibles aux protéines et n’importe quelle taille de protéines peuvent y accéder.

A

Faux

32
Q

La porosité des gels dépendra de quoi (2)? Pour gel filtration

A

-de la masse moléculaire du polymère
-du nombre de liaisons croisées qui se forment entre les molécules du polymère (pontages)

33
Q

Comment exprime-t-on la masse des protéines?

A

en kDa

34
Q

Qu’est-ce que la limite d’exclusion?

A

les pores dans les billes du gel sont suffisamment grands afin de permettre
la pénétration complète des petites molécules, mais ils ne laissent pas pénétrer toutes les protéines à partir d’une certaine taille

35
Q

Comment sont les meilleures billes de gel?

A

es meilleures billes de gel ont des tailles de pore qui excluent 90% des macromolécules qui possèdent 5 à 6 fois la taille des macromolécules retenues dans le volume interstitiel des billes

36
Q

Expliquer en résumé la chromatographie par gel-filtration.

A

Principe de filtration sur gel afin de séparer des protéines de tailles différentes sur une colonne. Les protéines de grandes tailles sont exclues de la plupart de pores, et par conséquent se déplacent avec le front du tampon.

37
Q

Qu’est-ce que le volume d’élution d’une protéine? Comment peut-il être déterminé?

A

Le volume d’élution d’une protéine dans une colonne de gel-filtration (Ve) peut être déterminé quantitativement => c’est le volume de solvant nécessaire pour éluer la protéine après son dépôt sur la colonne

38
Q

Qu’est-ce que le volume d’élution relatif d’une protéine? Qu’est-ce qu’on peut déterminer avec ?

A

Ve/V0

Cette mesure permet d’estimer la masse moléculaire d’une protéine
- il existe une relation linéaire entre le volume d’élution relatif d’une protéine et le logarithme de sa masse moléculaire

39
Q

Vrai ou faux : Il est possible d’estimer la masse d’une protéine inconnue en connaissant son volume d’élution relatif.

A

Vrai

40
Q

Que permet la dialyse?

A

la dialyse permet de séparer les molécules selon leurs tailles grâce à l’utilisation de membranes semi-perméables qui présentent des pores de taille inférieure aux protéines

41
Q

Que permettent les pores de membranes semi-perméables dans la dialyse?

A

ces pores permettent aux petites molécules, comme les sels et les métabolites, de diffuser au travers de la membrane, mais empêchent la diffusion de plus grosses molécules

42
Q

Les membranes utilisées dans la dialyse sont à base de quoi?

A

les membranes utilisées sont à base de cellophane (cellulose)

43
Q

La dialyse est une technique fréquemment utilisée pour quoi?

A

utilisée pour éliminer les sels présents dans un échantillon de protéine obtenu après précipitation (salting out) ou après élution avec un tampon riche en sels d’une colonne de chromatographie par échange d’ions

44
Q

La solution de protéines et de sels est mise à l’intérieur d’un sac à dialyse, puis immergée dan un large volume tampon. Après plusieurs heures, que se passe-t-il avec les solutions?

A

près plusieurs heures,
les solutions se retrouveront à l’équilibre grâce à la diffusion des sels de l’intérieur du sac vers le tampon de dialyse

45
Q

La centrifugation sur colonne-filtre est une forme de quoi? Qu’est-ce qu’elle utilise?

A

c’est une forme de dialyse
Utilise une membrane poreuse pour séparer les protéines selon leur poids moléculaire

46
Q

Qu’est-ce qui dicte la limite d’exclusion des protéines dans la centrifugation sur colonne filtre?

A

La taille des pores dicte la limite d’exclusion des protéines

47
Q

Qu’est-ce qu’un ligand?

A

un ligand, qui lie spécifiquement la protéine d’intérêt, est
fixé de manière covalente à une matrice poreuse et inerte

48
Q

Dans la technique de chromatographie d’affinité, il y a utilisation d’un ligand. Comment est-il fixé?

A

fixé de manière covalente à une matrice poreuse et inerte

49
Q

Comment fonctionne la chromatographie d’affinité?

A

quand une solution contenant un mélange de protéines traverse la colonne, la protéine d’intérêt se liera au ligand immobilisé, alors que les autres protéines ne s’y lieront pas et sortiront de la colonne
- on peut alors récupérer la protéine désirée sous une forme très pure en modifiant les conditions d’élution pour faire en sorte que la protéine se détache du ligand

50
Q

Comment modifier les conditions d’élution pour faire en sorte que la protéine se détache du ligand (4)?

A

-ajoutant un excès de ligand libre dans la colonne
-changeant le pH,
-changeant la force ionique
-changeant la température

51
Q

Quels sont les avantages de la chromatographie d’affinité (2)?

A

1- exploiter les propriétés biochimiques uniques
2-purifier la protéine d’intérêt à un très haut degré de pureté en une seule étape

52
Q

Qu’est-ce que la constante de dissociation (Kd)?

A

une mesure de l’affinité protéine-ligand

53
Q

Qu’est-ce qui est important lorsqu’un ligand est couplé à une matrice?

A

la liaison du ligand sur la matrice ne doit pas interférer dans l’interaction protéine-ligand

54
Q

Caractéristiques de la matrice utilisée pour la chromatographie d’affinité (3)?

A
  • chimiquement inerte
  • avoir une grande porosité
  • présenter de nombreux groupes fonctionnels capables de
    former des liens covalents avec les ligands
55
Q

Quel est le polymère le plus fréquemment utilisé pour une matrice de chromatographie d’affinité?

A

l’agarose

56
Q

Quelles sont les étapes de la liaison par lien de covalence du ligand sur la matrice d’agarose (chromatographie d’affinité) (2)?

A

1) réaction de l’agarose avec du bromure de cyanogène, qui produit un intermédiaire “activé” et stable
2) le ligand réagit avec l’agarose activé pour donner un produit lié par covalence

57
Q

Plusieurs protéines sont incapables de se lier à Europe iguane couplé de bromure de cyanogène. Pourquoi? Comment éviter ce problème?

A

à cause d’interférence stérique avec la matrice d’agarose
- pour éviter ce problème, un bras “espaceur” souple est ajouté entre la matrice et le ligand

58
Q

Combien de carbones possède un bras espaceur?

A

6

59
Q

Lorsqu’on purifie une ou des protéines par chromatographie, il faut une méthode qui permette de la ou les détecter quantitivement et spécifiquement dans les différentes fractions de l’éluat. Quelles sont ces méthodes (5)? Quelles sont les particularités de chacune?

A
  • absorption des protéines dans l’UV avec un spectrophotomètre - les protéines absorbent la lumière autour de 280nm
  • méthode non spécifique
  • essai colorimétrique (essai de Bradford)
  • contient un produit qui, en réagissant avec les protéines, donne une
    couleur mauve à la solution -> l’intensité de la couleur est proportionnelle à la concentration de protéine en solution
  • méthode non spécifique
  • essai enzymatique
  • pratique si la protéine à purifier est une enzyme
  • détection de la protéine sur gel SDS-PAGE (avec un colorant)
  • permet de déterminer le degré de pureté de la protéine
  • détection de la protéine avec un anticorps (essai ELISA ou immunoblot) - très spécifique

bcm 21 (7 decks)

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