Semaine 4: Mécanisme de la transcription Flashcards
Quelles facettes de la transcription peuvent être régulées?
1- Quels gènes transcrire
2- Niveau de transcription
Combien d’ARN pol les procaryotes ont-ils?
1
Combien d’ARN pol les eucaryotes ont-ils?
3 (I, II, III)
ARN pol I transcrit…
Les gènes codant pour le grand précurseur des ARN ribosomaux (ARNr)
ARN pol II transcrit…
La plupart des gènes codant pour des protéines
ARN pol III transcrit…
- Les ARNt
- Les petits ARN nucléaires
- L’ARNr 5S
L’enzyme minimale bactérienne comprend…
- 2 copies de la sous-unité alpha (a’ et a’’)
- 1 copie de chaque beta (B et B’)
- 1 copie de omega (w)
L’ARN pol II contient…
- RPB1
- RPB2
- RPB3
- RPB6
- RPB11
Sous-unités homologues entre eucaryote et pol II
- B et B’ avec RPB1 et RPB2
- a’ et a’’ avec RPB3 et RPB11
- w avec RPB6
Quelles sous-unités forment la pince?
B et B’ ou RPB1 et RPB2
Où le site actif est-il situé sur ARNpol?
À la base de la pince
3 étapes de la transcription
- Initiation
- Élongation
- Terminaison
Étapes de l’initiation
- Complexe fermé
- Complexe ouvert
- Détache du promoteur
Initiation: Complexe fermé
- Liaison de ARN pol
- ADN double brin
- Étape réversible
Initiation: Complexe ouvert
- ARN pol liée
- ADN simple brin
- Apparition de la bulle de transcription sur 14pb
- Étape irréversible
Initiation: Détache de ARN pol
- Transcription 5’ -> 3’
- Un seul des deux brins de la chaîne = matrice
- 10 premiers nucléotides
- Synthèse abortive (inefficace)
- Après les 10, libération de ARN pol
Le site actif de ARN pol contient-il des ions métalliques comme ADN pol?
Oui, mais seulement 1 MG2+ au lieu de 2. Le deuxième est introduit avec le nucléotide entrant et sort avec le pyrophosphate
Quelles sont les fonctions de l’ARN pol lors de la transcription?
- Ouvre la double hélice en aval
- Referme la double hélice en amont
- Dissocie l’ARN en croissance de la matrice
- Corrige les erreurs potentielles
Comment s’appelle le complexe promoteur-polymérase lors de l’initiation?
Complexe de transcription initial
Qu’est-ce qui transforme l’enzyme minimal de ARN pol en holoenzyme de l’ARN polymérase chez lez bactéries?
L’addition d’un facteur d’initiation sigma
Quel facteur d’initiation sigma est prédominant chez E. coli?
70
Les promoteurs reconnus par pol contenant sigma 70 partagent…
2 séquences conservées de 6 nucléotides séparées par environ 17 pb
Comment se nomment les éléments reconnus plus ou moins spécifiquement pas sigma 70 chez E. coli?
Éléments -10 et -35
Que signifie un promoteur fort chez E.coli?
Les promoteurs dont la séquence se rapproche le plus du consensus, donc ceux dont la transcription sera la plus efficace.
Qu’est-ce que l’élément UP?
Un élément contenu par les promoteurs plus puissants, en amont de l’élément -35, qui augmente la stabilité de pol en offrant un contact supplémentaire avec ADN
Qu’est-ce que les promoteurs ne possédant pas de région -35 ont à la place?
Une région -10 allongée
Quel élément découvert récemment se trouve en aval de -10? Quelle est sa fonction?
Élément discriminateur, qui ajouterait lui aussi de la stabilité à pol et de la force au promoteur
Quelles sont les différentes régions de sigma 70?
1, 2, 3, 4
Quelles régions de sigma 70 reconnaissent -10 et -35?
2 et 4
Quelle est la structure de la région 4?
2 hélices formant motif hélice-coude-hélice
Quel sont les rôle des hélices de la région 4 de sigma 70?
- La première s’insère dans le grand sillon et interagit directement avec les bases de l’élément -35
- la deuxième se place en travers et au-dessus du grand sillon et établit des contacts avec le squelette de l’ADN
Élément -10 est reconnu par…
Hélice alpha de la région 2
Élément -10 allongé est reconnu par…
Hélice alpha de la région 3
Élément discriminateur est reconnu par…
Région 1.2
Élément UP est reconnu par…
Domaine C-terminal de la sous-unité alpha = alphaCTD
À quoi est lié alphaCTD?
AlphaNTD (domaine N-terminal de alpha)
À quel niveau de position sur ADN se forme la bulle de transcription?
-11 à +3
Comment s’appelle la transition de complexe fermé à ouvert ?
Isomérisation
L’isomérisation nécessite-t-elle de l’ATP pour holoenzymes bactériennes (sigma70)?
Non
V ou F: Isomérisation est réversible
Faux
Quels sont les canaux de ARNpol?
1- Canal d'arrivée des NTPs (invisible) 2- Canal de sortie de ARN 3- Canal NT (sortie du brin sens) 4- Canal T (sortie du brin matrice) 5- Canal aval (entrée ADN bicaténaire)
Quels sont les 2 changements structuraux importants observés durant isomérisation?
1- Mâchoires se referment sur ADN en aval
2- Domaine N-terminal de sigma (1.1) se déplace de l’entrée du canal aval vers l’extérieur pour libérer l’entrée
ARN pol débute la plupart des transcrits par un…
A
Quelle partie de l’holoenzyme serait particulièrement impliquée dans les ineractions avec le 1er et/ou 2er NTP dans la synthèse abortive?
Le linker sigma 3/4 (lien entre sous-unités 3 et 4 de sigma) chargé négativement
Quels sont les 3 modèles proposés pour le déplacement du site actif le long de la matrice?
1- Excursion transitoire
2- Inchworming
3- Compression
Quel modèle de déplacement du site actif est valide?
Le modèle compression, car il n’y a pas de déplacement de ARNpol.
Quelle serait la raison pour la synthèse abortive?
- Linker 3/4 = chargé négativement = mime ADN
- Bloque le canal de sortie ARN donc crée accumulation d’ADN dans enzyme durant complexe ouvert
- Lorsque la compression est trop forte (fin de la synthèse abortive), sigma serait expulsé du coeur de l’enzyme et pol éjecté du promoteur
- Synthèse abortive mène donc à l’accumulation d’énergie via compression d’ADN pour la libération de pol pour l’élongation
2 fonctions correctrices de ARN pol
1- Correction pyrophospholytique
2- Correction hydrolytique
Correction pyrophospholytique
Enlèvement du nucléotide incorrect par incorporation d’un PPi
Correction hydrolytique
Enzyme recule d’un ou plusieurs nucléotides et clive une section contenant l’erreur
Facteurs Gre
Stimulent:
- Correction hydrolytique
- Élongation
Protéines Nus
- Se joignent à pol pendant élongation
- Stimulent élongation et terminaison
Enzyme qui enlève la polymérase et recrute les enzymes de réparation
TRCF (transcription-repair coupling factor)
Comment la TRCF agit-elle?
- Elle voyage le long de l’ADN en amont de pol grâce à énergie de ATP et rencontre pol bloquée, puis la pousse vers l’avant
- Reprise de la traduction ou dissociation de pol
- TRCF recrute enzymes de réparation
Quels enzymes de réparation sont recrutés par TRCF?
Endonucléase Uvr[A]BC
2 types de terminateurs bactériens
1- Rho-dépendant
2- Rho-indépendant
Qu’est-ce qu’un terminateur rho-dépendant?
Élément d’ARN appelé site rut (rho-utilization) qui requiert l’action de la protéine rho
Qu’est-ce qu’une protéine rho?
Homohexamère en forme d’anneau qui se fixe à l’ARN simple brin dès qu’il émerge de ARNpol
Quelle énergie rho utilise-t-elle pour induire la terminaison?
ATP
À quoi rho se lie-t-il sur ARN?
Site rut
Si ARNpol va plus rapidement que rho, comment rho rattrappe-t-elle ARNpol?
ARNpol fait une pause au “rho-sensitive pause site” (RSPS) situé 100 nucléotides en aval de rut
Quels sont les 3 modèles d’action de rho lors de son arrivée à pol?
1- Pousserait pol en avant
2- Arracherait pol de ARN
3- Induirait changement de conformation de pol
Qu’est-ce que le site rut?
Une séquence d’environ 70 nucléotides riche en C qui ne forme pas de structure secondaire et qui est reconnu spécifiquement par rho
Autre nom de terminateur rho-indépendant
Terminateur intrinsèque
Deux éléments nécessaires aux terminateurs intrinsèques
1- Courte séquence répétée et inversée
2- Série d’environ 8 paires de bases A:T (ADN)
Quelle structure prend forme si une séquence répétée et inversée est transcrite? Pourquoi cela rend-il le terminateur intrinsèque efficace seulement dans ARN et non ADN?
La séquence simple-brin répétée et inversée se replie sur elle-même pour former une structure en tige-boucle (épingle à cheveux). Cela ne fonctionne pas sur ADN car double brin!
Comment l’épingle à cheveux pourrait-elle induire la terminaison?
1- Pousser ARNpol vers l’avant
2- Extirper le transcrit de la polymérase
3- Induire un changement de conformation de pol
À quoi servent les 8 paires A:T suivant la séquence répétée et inversée dans le terminateur intrinsèque?
Transcrit, un a une paire A-U très facile à dissocier (moins stable que A-T)
Sous quel acronyme sont regroupés les équivalents du facteur d’initiation sigma procaryote chez les eucaryotes?
FGT (facteurs généraux de transcription)
De quels facteurs supplémentaires, en plus des FGT, la cellule eucaryote a-t-elle besoin?
1- Protéines régulatrices
2- Médiateur
3- Enzyme de modification de la chromatine
De quoi est constitué le promoteur minimal eucaryote de pol II?
40 à 60 nucléotides en amont ou en aval du site d’initiation
- BRE (élément reconnu par TFIIB)
- Boîte TATA
- Inr (élément initiateur)
- Éléments d’aval du promoteur (DPE, DCE, MTE)
Si un promoteur contient une boît TATA, il ne contiendra pas de…
DPE
Souvent, un promoteur contenant TATA contient aussi…
DCE
Inr peut être combiné à…
TATA ou DPE, jamais les 2
Pour une transcription in vivo, en plus du promoteur eucaryote minimal, on a besoin de séquences […]. Que sont-elles?
Séquences régulatrices:
- Éléments proximaux du promoteur
- UAS (séquences activatrices en amont)
- Enhancers
- Silencers, éléments frontières et isolateurs
De quoi est constitué le complexe de préinitiation (PIC)?
Pol II + FGT liés au promoteur
À quel niveau sur le promoteur débute la mis en place du PIC?
La boîte TATA
Par quel facteur de transcription est reconnue la boîte TATA? Quelle sous-unité de ce facteur est responsable de lier la boîte TATA?
TFIID via sa protéine TBP (TATA-binding protein)
Comment sont appelés les autres sous-unités de TFIID?
TAFs (TBP-associated factors)
Que reconnaissent les TAFs?
D’autres éléments du promoteur minimal (DPE, DCE, Inr)
Quelle est la conséquence de la liaison de TBP à TATA?
Pronfonde déformation de TATA qui devient une plate-forme pour d’autres facteurs de transcription et pol II
Dans quel ordre les facteurs de transcription suivants se lient-ils au complexe TBP-TATA?
- TFIIA
- TFIIB
- TFIIF + Pol II
- TFIIE
- TFIIH
Quel facteur a une activité hélicase ATP-dépendante et sépare les 2 brins d’ADN?
TFIIH
Quelles sont les 2 étapes de la libération du promoteur eucaryote?
1- Hydrolyse de ATP
2- Phosphorylation de queue CTD (Pol II)
2 étapes nécessitent hydrolyse d’ATP dans l’initiation de la transcription eucaryote. Lesquelles?
1- Fusion de ADN par TFIIH
2- Phosphorylation de queue CTD
Que contient la queue CTD?
Série de répétitions (52 chez l’homme) de l’heptamère tyr-ser-pro-thr-ser-pro-ser qui seront phosphorylés pour mener à l’élongation
Quelle structure la TBP utilise-t-elle pour reconnaître quel sillon de la boîte TATA?
Feuillet beta qui reconnaît le petit sillon
Comment la spécificité de TBP pour TATA est-elle assurée?
TBP reconnaît la facilité avec laquelle TATA se déforme. Grâce à ses 2 résidus phe qui s’intercalent entre les paires de bases aux extrémités de TATA, TBP élargit le petit sillon presque jusqu’à plat et plie l’ADN d’environ 80 degrés.
Quels TAFs qui stabilisent l’ADN ont des similitudes structurales avec les histones et se lient à des éléments d’ADN du promoteur?
TAF42 et TAF62
Avec quoi TFIIA interagit-il?
TBP/TFIID et pas l’ADN!!
Quelles sont les fonctions de TFIIA?
1- Élimine interaction entre réprésseurs et TBP qui l’empêcherait de former PIC
2- Agit comme coactivateur
Quells gènes encodent TFIIA?
- TFIIA alpha/beta (TOA1)
- TFIIA gamma (TOA2)
Avec quoi TFIIB fait-il contact?
- ADN
- TBP
- Pol II
TFIIB a des interactions base-spécifique avec..
- grand sillon en amont (sur BRE)
- petit sillon en aval de TATA
Où est-ce que TFIIB fait contact avec pol II?
Dans le canal de sortie de ARN et dans le site actif
Quelles sont les 2 sous-unités de TFIIF chez l’homme?
RAP74 et RAP30
Rôle de TFIIE
Recrutement et régulation de TFIIH
Rôle de TFIIH
Contrôle la transition de initiation à élongation
Quel TF est le plus gros? Combien de sous-unités?
TFIIH avec 10 sous-unités
Quelles sont les 2 activités catalytiques de TFIIH?
ATPase et kinase
Dans quels procédés TFIIH est-il impliqué en plus de la transition initiation-élongation?
- Fusion du promoteur et détachement de celui-ci
- Réparation ADN par excision de nucléotide
Qu’est-ce qui justifie le besoin d’un médiateur?
ADN matrice in vivo est empaquetée sous forme de chromatine, ce qui complique la liaison au promoteur de Pol et ses facteurs de transcription
Quel est le rôle des activateurs? Où se lient-ils à l’ADN?
Ils aident au recrutement de la polymérase et se lient en amont du promoteur
Comment le médiateur facilite-t-il l’initiation?
En régulant l’activité CTD kinase de TFIIH (donc régule la phosphorylation de CTD)
Combien de sous-unités composent le médiateur?
20
Quelle sous-unité importante du médiateur est indispensable pour la transcription de presque tous les gènes Pol II in vivo?
Srb4/Med17
En quoi le médiateur est-il organisé? Qu’est-ce que cela représente?
En modules, qui représentent chacun un groupe de sous-unités
Pourquoi existe-t-il plusieurs combinaison de modules pour composer un médiateur?
Car ça dépend de quel gène on veut transcrire
Quels facteurs remplacent les facteurs d’initiation lors de l’élongation?
TFIIS et hSTP5
Où sont recrutées les enzymes de maturation de l’ARN eucaryote?
Au niveau de la queue CTD
Quelle kinase joue un rôle important dans l’élongation? Quel est son rôle?
Kinase p-TEFb
- Phosphoryle Ser en position 2 de CTD, ce qui corrèle avec l’élongation
- Phosphoryle et active TAT-SF1, un facteur d’élongation
Quelle famille de molécules est une classe de facteurs d’élongation? Comment agissent-ils?
Famille ELL
- Lie pol II et supprime ses arrêts temporaires, ce qui améliore processivité de pol II
Quel TF d’initiation joue également un rôle dans l’élongation?
TFIIF
Quel TF stimule l’élongation seulement et n’a aucun effet sur l’initiation?
TFIIS
Rôle de TFIIS
- Comme ELL, TFIIS réduit les temps de pause de pol
- Stimule activité RNase de pol II (correction)
Quelle forme de correction TFIIS promeut-il?
Hydrolyse limitée de l’ARN
Quel facteur facilite la transcription au niveau des nucléosomes?
FACT
De quelles sous-unités est composé FACT? À quoi se lie chaque sous-unité?
- Spt16 = Lie un dimère H2A/H2B
- SSRP1 = Lie le tétramère H3-H4
Comment fonctionne un FACT?
Devant pol, FACT enlève un dimère H2A/H2B via Spt16, ce qui permet à pol de passer. Ensuite, FACT remet le dimère en place, ce qui reforme le nucléosome initial.
Quelles modifications l’ARN doit-il subir avant d’être exporté hors du noyau?
- Formation de la coiffe 5’
- Épissage
- Formation de la queue poly-A 3’ (polyadéylation)
Quel facteur d’élongation mène à l’ajout de la coiffe 5’ via la phosphorylation de quel résidu Ser?
hSPT5 contribue au recrutement de l’enzyme qui phosphoryle Ser5
Quel facteur d’élongation recrute les composantes de la machinerie d’épissage via la phosphorylation de quel Ser?
TAT-SF1 via la phosphorylation de Ser2
Quelles sont les conséquences d’un Ser5 phosphorylé?
- Libération du promoteur (élongation débute)
- Ajout coiffe 5’
Quelles sont les conséquences d’un Ser2 phosphorylé?
- Élongation se poursuit
- Épissage débute
Pourquoi la liaison d’une guanine méthylée è l’extrémité 5’ est-elle particulière?
Car c’est une liaison 5’-5’ impliquant 3 phosphates
3 étapes de l’ajout de la coiffe et enzymes catalysant chaque étape
1- Retrait d’un phosphate de 5’ (ARN triphosphatase)
2- Ajout de GMP (guanylyltransférase)
3- Méthylation de GMP (méthyltransférase)
Rôles de la coiffe
1- Protège ARNm des RNases (dégradation)
2- Exporte ARNm dans cytoplasme
3- Recrute les ribosomes (traduction)
Quel événement stimule l’ajout de la queue poly-A?
Lorsque pol II atteint la fin d’un gène, elle rencontre séquence AAUAAA qui stimule le transfert des enzymes de polyadénylation sur ARN
4 événements suivant la liaison des enzymes de polyadénylation à l’ARN
1- Clivage de ARNm
2- Ajout d’environ 200 A sur 3’
3- Dégradation ARN suivant
4- Terminaison de la transcription
Quels complexes protéiques sont transportés par pol II (CTD) alors qu’elle approche la fin d’un gène? Quels sont leurs rôles?
- CPSF = Clive ARN en aval du signal AAUAAA et recrute poly-A-polymérase
- CstF = Stimule le clivage ARN par CPSF puis s’en va
Rôle de poly-A-polymérase
- Ajoute les A 3’
- Recrute les PABP
Quels sont les 2 modèles de terminaison eucaryote proposés?
- Torpille
- Allostérique
Quelles protéines sont impliquées dans le modèle torpille? Quel est leur rôle?
- Rat1 (souris) ou Xrn2 (humain)
RNases qui remontent l’ARN restant et terminent sans contact (Rat1) ou poussent pol/arrachent ARN (Rat1/Xrn2) - Rtt103
Recrute Rat1/Xrn2
Comment fonctionne le modèle allostérique?
La terminaison dépendrait d’une modification structurale de pol suite à la liaison des protéines CPSF et CstF (clivage) suffisante pour déloger pol de l’ADN matrice.
Le promoteur Pol I est constitué de…
- Promoteur central autour du site d’initiation
- UCE (upstream control element) environ 100 à 150 pb en amont
2 facteurs requis pour initiation de pol I
- SL1: TBP + 3TAFs qui se fixent au promoteur central et ont besoin de UBF pour liaison
- UBF: Lie UCE et amène ainsi SL1 = recrute pol I et stimule initiation
Promoteurs pol III sont situés…
En aval du site d’initiation
Quelles boîtes peuvent contenir les promoteurs pol III?
- A et B séparés par court élément (ARNt)
- A et C (ARNr 5S)
- TATA
Quels TFs sont utilisés par pol III?
TFIIIB et TFIIIC: ARNt
TFIIIB, TFIIIC, TFIIIA: ARNr 5S
Rôles des TF de pol III
TFIIIC: Se lie au promoteur et attire TFIIIB
TFIIIB: Se lie à ADN en amont et recrute pol III
Quel TF pol III inclus TBP?
TFIIIB
