Secuenciación. Sanger. Filogenética Flashcards
¿Qué es secuenciación?
Proceso en el que se determina la secuencia de nucleótidos de fragmento de ADN
¿Qué es la secuenciación de Sanger y proceso?
Método por terminación de cadena
- Enzima de ADN polimerasa
- Cebador
- 4 nucleótidos de ADN
- Versiones didesoxi = terminadores de cadena
a. Marca secuenciación
¿Cuál es la diferencia entre desoxi y didesoxi?
Los nucleótidos didesoxi no tienen grupo hidroxilo en carbono 3´del anillo de azúcar
En nucleótido normal, grupo hidroxilo 3´actúa como “gancho” que permite que nuevo nucleótido se añada
En nucleótido didesoxi no existe ese gancho, lo que termina la cadena en ese nucleótido
¿Cuál es el fundamento de la secuenciación Sanger?
Un primer hibrida con secuencia desconocida y de ahí se hace la lectura/secuenciación
Se basa en el principio de polimerasa de replicar cadena molde
¿Cuál es el método de la secuenciación Sanger?
Muestra + cebador + ADN polimerasa + nucleótidos + nucleótido didesoxi
Se repite varios ciclos
¿Cuál es la técnica de electroforesis capilar?
- Ya no usa nucleótidos radiactivos
- Se añaden marcadores fluorescentes a los didesoxi (c/u de un color dif)
- No todos los fragmentos se marcan con los terminadores de cadena
+ La incorporación de nucleótidos didesoxi es al azar en c/reacción de polimerización particular - Cuando reacción termina, los fragmentos se hacen pasar x medio de tubo largo y delgado que contiene matriz de cel en proceso llamado — electroforesis capilar en gel
- Los fragmentos cortos se mueven rápido x los poros del gel, los + largos van + lento
- C/fragmento cruza la “línea de meta” al final del tubo, un láser lo ilumina y permite detección del pigmento asociado
- El fragmento + pequeño (que termina justo 1 nucleótido después del cebador) es el primero que cruza la línea de meta, seguido x el próximo fragmento + peque (q termina justo 2 nucleótidos después del cebador) y así sucesivamente
- Así, se reconstruye nucleótido x nucleótido la secuencia del fragmento de ADN original a partir de los colores de los pigmentos registrados uno tras otro por el detector
- Los datos registrados x el detector consisten en serie de picos en intensidad de florescencia, como se muestra en cromatograma
- La secuencia del ADN se lee a partir de picos en cromatograma
Nuevas técnicas de secuenciación
PCR para amplificar fragmentos, esta elimina errores
- Amplificación masiva y repetitiva
¿Qué es filogenia?
Estudio de evoluciones
¿Qué es filogenética?
Parte molecular de la evolución
¿Cuál es la aplicación de la filogenética en medicina?
En epidemiología principalmente
Conocer dónde se originó la enfermedad, primeras personas infectadas, variantes genéticas de la enfermedad
¿Qué es un nodón?
Ancestro en común
¿Qué es una rama?
Diversificación que surge del ancestro en común
¿Qué se busca/estudia en la filogenética en virus?
Enzima que hace la replicación — retrotranscriptasa
Diferencias entre resistencia primaria y secundaria (en antivirales)
- Primaria
Virus de px que no han sido tratados previamente, lo que implica que infección se ha adquirido a partir de cepas de VIH resistentes - Secundaria
Aparecen en población viral de px como consecuencia de presión selectiva ejercida por la exposición a fármacos antirretrovirales
¿Cómo es la técnica de pruebas fenotípicas para la detección de resistencias a antivirales?
Consisten en sistema de replicación in vitro que enfrenta al virus con diferentes concentraciones de fármacos antirretrovirales
El grado de inhibición del crecimiento se establece x comparación con cepa de referencia
