Etapas Del Dx Molecular Flashcards
¿Qué es el diagnóstico molecular?
Aplicación de técnicas de biología molecular detectando y cuantificando secuencias genéticas específicas
Identificación de biomarcadores — mejores pruebas dx y tx
Etapas del diagnóstico molecular
Etapa preanalíica
Etapa analítica
Etapa postanalítica
¿En qué consiste la etapa preanalítica?
Solicitud de análisis
Rotulación adecuada de la muestra
Instrumentos que causen menor número de lesiones
Extracción ADN - 3 ml sangre - proceso
Selección muestra = pruebas de diagnóstico molecular
Las pruebas de diagnóstico molecular se clasifican en:
- Estructura genómica (detección de ADN): mutaciones y polimorfismos, muestra de sangre (leucocitos de sangre periférica)
- Expresión génica (detección de ARNm): espacial y temporal, muestra de zona específica
- Detección de genomas extraños (genomas de virus y bacterias): técnica PCR establece la patología, muestra de sangre periférica
¿Cuáles son las características de la expresión génica espacial y temporal?
- Espacial: según la cél y función a explorar
Ej. Insulina - cél beta pancreática exclusiva - Temporal: según estado metabólico del px
Ej. niño, adulto mayor, enfermo o sano
¿En qué consiste la etapa analítica?
Determina, mide y describe la presencia o ausencia de sustancias
Procesamiento de muestra
Posibilidad de resultados incorrectos
Controles positivo y negativo
¿En qué consiste la etapa post-analítica?
Evaluación e informe
Resuelve
¿Cuáles son las diferencias entre el dx tradicional y el molecular?
Tradicional
- Basado en antecedentes y clínica
- Fallo en tx
- Ineficiencia = + tiempo perdido
- Infección: dificultades por tiempos de crecimiento, condición cultivo y obtención muestra
- Cáncer: mayor índice de falsos positivos, uso de pruebas no útiles
Molecular
- Probabilidad de recurrencia real
- Minimiza errores, tx personalizado y atinado
- Detección múltiple + eficiencia = + tiempo ahorrado
- Infección: tx de elección + sensible y específico y + rápido
- Cáncer: mayor sensibilidad y especificidad, tx adecuado
Tratamiento con dx molecular
Sensibilidad 70-99%
Especificidad 86-100%
- Diseño de cebadores
- Cantidad ADN polimerasa
- Cantidad y calidad ADN
Diferencia entre falsos positivos y negativos
Positivos: combinación de muestras, combinación de fármacos
Negativos: acción ADNasas o ARNasas, hidrolizan enlaces, muestra ya no es suficiente o está alterada
¿A qué se refiere y cómo se aplica la validación en las pruebas?
Proceso que establece especificaciones concretas de un test
- Validación analítica: exactitud con la que test identifica mutaciones o genotipo de interés, incluye sensibilidad y especificidad
- Validación clínica: capacidad de test de especificar o predecir presencia o ausencia de enf
¿Qué son las pruebas primarias y cuáles son?
Aquellas que requieren de otro proceso para visualizar el resultado
Fijación del complemento
Inmunofluorescencia
Pruebas inmunoenzimáticas - ELISA
Western Blot
Radioinmunoensayo
Inmunocromatografía
¿Qué son las pruebas secundarias y cuáles son?
Son…
Pruebas de precipitación
Pruebas de aglutinación
¿Por qué el complemento = hemólisis?
Si complemento no se una a Ag (porque no está presente en muestra) va a quedar libre, por lo que se fija al eritrocito. Complemento hemoliza a los eritrocitos
¿Qué permite saber si se dió la unión del ac al Ag en Western Blot?
La radiactividad elevada
Se detecta usando marcador radiactivo o químico
¿Cómo se reportan los resultados de una ELISA?
Por medio de diluciones y color
Si color permanece dspués de muchas diluciones — “mucho Ag/mucho ac”
También se puede cuantificar x medio de espectrofotómetro y graficar curva con resultados de diluciones
Diferencia entre ELISA directa, indirecta y sándwich
Directo: rápido y simple, ac primario marcado con enzima se une directamente al ag, permitiendo detección y/o cuantificación
Indirecto: en dos pasos, amplifica señal obtenida, se usan 2 ac, primario y secundario, y el segundo se va conjugado a una enzima
Sándwich: ag queda inmovilizado entre 2 ac, 1 de captura y otro de detección (pares de ac), que se unirán a 2 epítopos diferentes de 1 mismo ag
¿Cuál de los tipos de ELISA es más específico? Y, ¿por qué?
ELISA sándwich porque tiene + ac dirigidos específicamente a objetivo y le da + especificidad a la prueba
Modificaciones postraduccionales que pueden hacerse con Western Blot
Acetilación
Fosforilación
Citrulinación
Por ac específicos
Pasos del Western Blot
- Se hace electroforesis donde se separan todas las proteínas según su peso
- Se hace transferencia de gel a membrana + firme
- Incubación y bloqueo
- Se añade ac primario
- Lavado, donde se eliminan ac que no se unieron
- Se añade ac secundario, específico para el ac primario
a. Este cuenta con enzima - Lavado
- Detección de proteína de interés x medio de señal quimioluminiscente
a. Se añade sustrato que reacciona con enzima del ac secundario
¿Qué es serología?
Estudio de ac en suero sanguíneo
¿Qué son las pruebas serológicas?
Analizan componente sérico de sangre que incluye ac contra componentes específicos de patógenos (Ag)
¿Cómo se clasifican las pruebas serológicas?
Según lo que investigan
- Directas: buscan Ag
- Indirectas: buscan ac
Según procedimiento
- Primarias: reacción no visible
- Secundarias: reacción es visible
¿Qué es un antígeno (Ag)?
Molécula de procedencia exógena o endógena que resulta “extraña” al organismo
Unido por ac o receptor de célula
¿Qué es un anticuerpo (ac)?
Proteína producida por linfocitos B en respuesta a antígeno
¿Qué es un epítopo o determinante antigénico?
Sitio o porción inmunodominante de un Ag, a través del cual se une con ac o con receptor de linfocito T
¿Qué es la reacción Ag-Ac?
Reacción inmune producida cuando ac reconocen a Ag
Formación complejo Ag-Ac
