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Enzymologie > Section 1 : Protéases à Sérine > Flashcards

Section 1 : Protéases à Sérine Flashcards

1
Q

Qu’est-ce qu’une enzyme? 4)

A

Catalyseur biologique (généralement protéine parfois ARN)

-accelere rx chim en diminuant E etat transition
-pas detruit ou altere durant rx
-fct peut dependre de cofacteur

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2
Q

Fonctions peptidases (4)

A

-digestion
-clivage précurseurs hormonaux
-clivage précurseurs viraux
-dégradation protéines cell.
(Rôle rég processus physio)

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3
Q

Quelles réactions catalysent les protéases?

A

Hydrolyse du lien peptidique et du lien ester

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4
Q

Endopeptidase vs exopeptidase

A

Endo=coupe à l’intérieur de la chaîne (dégradation/hydrolyse partielle)

Exo= coupe aux extrêmités des chaînes (dégradation complète)

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5
Q

Familles de protéases et exemples? (Seulement ceux qu’on a vus) (4)

A

Ser I : trypsine, chymptrypsine, élastase
Ser II: subtilisine
Cys: papaïne, cathépsine B
Metallo I: carboxypeptidase A

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6
Q

Site actif VS site de spécificité?

A

Site actif: région de la catalyse (poche, creux)

Site de spécif: résidus de l’enzyme reconnaissant le substrat permettant sa liaison

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7
Q

Définition de sous-site (3)

A

-Domaines 3D de l’enzyme intéragissant avec un aa du polypeptide (chaîne lat).

-Pas une série continue d’aa mais résidus non adjacents de la séq de l’enzyme.

-les aa représentés par P et enzyme par S. Numerotés en 1’ 2’ 3’ en N-term et 1 2 3 en C-term

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8
Q

Quel est le cheminement utilisé pour trouver le mécanisme d’action de protéases à sérine? (3 étapes générales)

A

1) présence d’intérmédiaire acyl-enzyme
-mécanisme à 3 étapes
-phase rapide/phase lente
-implication de Ser

2) implication de His (nucléophile)

3) existence de triade catalytique (ser, his et asp), LBHB

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9
Q

Explique en grandes lignes le mécanisme à 3 étapes de l’hydrolyse du PNPA par la chymotrypsine

A

1) formation E-PNPA

2) formation intermédiaire acyl-E
(Phase rapide, P1 = paranitrophénolate relaché)

3) dissociation E et acétate
(Phase lente, P2=acétate relaché)

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10
Q

Que permet l’extrapolation à t=0 des courbes de l’état stationnaire?

A

Permet de définir la concentration initiale de l’enzyme active.

Ex: 0.63 mol de p nitrophenolate / 1 mol E. (explications: soit 63% enzymes actives soit k acyl pas bcp > k deacyl

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11
Q

C’est quoi l’état stationnaire pour la réaction du PNPA avec la chymo?

A

Hydrolyse de l’intermédiaire acyl-enzyme
(Production + lente des produits libérés = vitesse limitante)

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12
Q

Kcat, KM, kcat/km ?

A

Kcat: vitesse de renouvellement (s^-1)
-nb de molec de S transformé en P par unité de temps et par site actif, qd E saturée en S

Km: concentration de S à v=1/2 vmax (mol/L)
-km =pas kd
-km = kd slm si k-1»k2 (km = k2)

Kcat/Km: constante de spécificité
-indicateur d’efficacité cat.

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13
Q

Vrai ou faux? L’acyl forme une liaison covalente avec l’enzyme.

A

Vrai

Pr former intermediaire acyl enzyme.

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14
Q

Différence du mécanisme de l’hydrolyse ester vs amide par la chymotryipsine?

A

Ester: phase rapide (formation acyl-enzyme), puis lente

Amide: phase lente (formation acyl-eznyme), puis rapide

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15
Q

Qu’a permis la DFP de trouver par rapport à l’enzyme acétylée?

A

Trouver quelle ser était liée à l’acétyl
(Liaison covalente competitive et irreversible à la ser active).

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16
Q

C’est quoi la DFP?

A

Inhibiteur irreversible d’une esterase a acetylcholine

Accumulation acetylcholine = mortel

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17
Q

Utilisation de la TPCK

A

Inhibiteur irreversible comprtitif de la chymotrypsine ds site de specificite.
His attaque nucleophile TPCK liaison covalente.

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18
Q

Triade catalytique chymotrypsine

A

Ser: responsable de l’attaque nuc
His: A/B général
Asp: stabilise le bon tautomère de l’His et le maintient dans la bonne position et augmente caractère nuc de Ser

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19
Q

C’est quoi un LBHB? C’est quoi son rôle dans la triade cat?

A

Low barrier hydrogen bond.

Stabilise etat de transition abaisse energie dactivation en augmentant basicite de His et augmentant sa reactivite pour deprotoner Ser.

20
Q

Qu’est ce qui se passe si on remplace l’Asp par l’Asn dans le site actif de la chymotripsine? (4)

A

-Asp chargée ( - ) Asn pas chargée
-Km pas affecté, Kcat diminué d’un facteur de 5000
-mutant Asp102Asn réagit 10 000 fois moins vite avec le DFP
-Donc Asp confère le caractère nucléophile à Ser

21
Q

Étape 1 du mécanisme du clivage du lien peptidique par chymotrypsine: Formation du complexe ES

A

Phenylalanine du substrat se fixe dans la poche hydrophobe (site de spécificité de chymo).

22
Q

Étape 2: Attaque nucléophile par Ser sur carbonyl du substrat

A

Ser attaque le carbonyl du substrat, le proton du substrat est transféré à l’His (catalyse basique).

Intermédiaire tétraédrique avec charge négative sur l’atome d’oxygène du substrat stabilisée par ponts hydrogènes dans la cavité oxyanionique.

23
Q

Étape 3: Bris du lien peptidique du substrat avec libération du produit amine

A

Le produit amine est expulsé grâce au H donné par l’His. On a un intermédiaire acyl-enzyme.

24
Q

Étape 4 et 5: Attaque de l’acyl-enzyme par une molécule d’eau

A

Molec d’eau réagit avec le carbonyl de l’Acyl-E et forme un nouveau internédiaire tetraédrique. L’histidine prend H de l’eau par catalyse basique.

25
Q

Étape 6: Conversion en produit

A

L’intermed tetra est converti en prod. Facilité par catalyse acide de l’his (his transfere son proton à Ser).

26
Q

Étape 7: Régénération de l’enzyme

A

Libération du deuxième produit (carboxylate) pour la regénération de l’enzyme libre.

27
Q

En quoi la réaction de la chymotrypsine avec le PNPA est une réaction ping-pong?

A

PNPA + E –> PNPA-E –> P1 + E* + H2O –> H2O-E* –> P2 + E

28
Q

C’est quoi un zymogène

A

précurseur protéique inactif d’une enzyme

29
Q

C’est quoi la trypsine

A

Activateur de tous les zymogènes pancréatiques

30
Q

Donne les caractéristiques du repliement 3D des protéases à sérine S1 (2)

A

-2 Domaines, poche du site actif en sandwich
-Ces domaines sont des tonneaux B antiparallèles perpendiculaires

31
Q

Comment est synthétisée la chymotrypsine?

A

chymotrypsinogène clivée par trypsine = chymotrypsine (auto-catalyse pr s’activer, 3 ss-u liées par ponts disulf)

32
Q

Où se situent les différences 3D de l’élastase, de la trypsine et de la chymotryspine?

A

Partie extérieure

33
Q

Conformation chymotrypsinogène vs chymotrypsine

A

Se ressemble bcp
Chgmts de conformation permettant formation du site de liaison du substrat (site de spécif) et poche oxyanion

34
Q

Composition de la poche de l’oxyanion de la chymo?

A

Gly et Ser

Stabilise l’oxyanion de l’intermédiaire tétraédrique

35
Q

Similarités et différences de la subtilisine et la chymotrypsine (2) ?

A

-Mécanisme catalytique = même (triade cat similaire)
-Structure 3D peu similaire

36
Q

C’est quoi l’évolution convergente et quelles enzymes est un exemple de cela?

A

L’évolution convergente est un phénomène par lequel des protéines non apparentées ont développé un mécanisme identique. Ces organismes ont trouvé la voie énergique minimale pour effectuer cette réaction.

Ex: Subtilisine (S2) et Chymotrypsine (S1)

37
Q

C’est quoi l’évolution divergente et quelles enzymes sont un exemple de cela?

A

L’évolution divergente est le phénomène par lequel des protéines dérivant du même ancêtre développent de différentes spécificités.

Élastase, chymo et trypsine = spécificité divergé.

38
Q

Quels sont les résidus préférés de la chymotrypsine, trypsine et élastase en P1 ?

A

Chymo: Phe, Trp, Tyr
Tryps: Lys, Arg
Élast: Ala, Gly
(sous-site S1, toutes des endopeptidases)

39
Q

Utilisation du paramètre kcat/km (2)

A

1-Évaluer stabilité état de transition (triade cat et poche oxyanion)

2-Évaluer spécificité enzyme (résidus poche spécificité)

40
Q

explique à quoi sert le MCA

A

c’est un substrat modèle détectable par les méthodes spectrométriques. fluoresce lorsque lien AA-MCA hydrolysé par les peptidases. On détermine kcat/km pour diff AA.

marche pas pr toutes les peptidases car site S1’ doit accomoder groupe AMC

41
Q

Fluorescence réduite et augmentée

A

Fluo réduite: transfert d’énergie d’excitation d’un donneur de flui à un accepteur qui réduit la flui. Transfert d’énergie et réduction de fluo dépend de la distance entre le donneur et l’accepteur.

Fluo augmentée: clivage lien peptidique augmente fluorescence. fluo proportionnel à qté de peptide hydrolysé.

42
Q

Utilisation de la mutagénèse dirigée (3)

A

1- comprendre mode d’action des enzymes
2-déterminer paramètres cinétiques kcat, km, kcat/km
3-études structure-fonction (modif propriétés)

43
Q

Quelle supposition devons-nous faire pour évaluer la stabilité du site actif (mutation triade ou poche oxyanion)?

A

La liaison du substrat à l’enzyme n’est pas affectée (le site de spécificité).

Alors ΔΔG≠ = ΔΔG0≠

44
Q

Quelle supposition devons-nous faire pour évaluer la spécificité de l’enzyme (mutation poche spécificité)?

A

La liaison du substrat ne dépend pas de la réaction chimique (stabilité du site actif).

Alors ΔΔG≠ = ΔΔGl

45
Q

À quel paramètre sont reliés ΔGs, ΔGcat, ΔG≠?

A

ΔGs: Ks = KD et peut être égal à Km SEULEMENT quand l’équilibre entre E+S et ES est rapide
ΔGcat: Kcat, vitesse réaction
ΔG≠: Kcat/Km, énergie d’activation ΔG0≠ , énergie de liaison ΔGl

46
Q

Vrai ou Faux on peut changer le site de spécificité d’une trypsine pour la transformer en chymotrypsine?

A

Vrai, cela ne devrait pas affecter la chimie de la réaction juste la spécificité.

47
Q

Qu’est ce qui se passe si on change l’Aspartate du site de spécificité de la trypsine pour une lysine? (3)

A

La lysine est inactive pour le substrats de la trypsine (Arg et Lys)

Par contre elle retient une faible activité chymotrypsine de la lysine (Hydrolyse Phe et Tyr)

Propriété unique de cliver leucine

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