Séances 5 et 6 : Analyse de lymphocytes par cytométrie de flux Flashcards
Quel est le nom anglais pour cytométrie de flux?
FACS (fluorescence activated cell sorter)
Selon quels paramètres le FACS peut-il discriminer les cellules d’une suspension?
Taille
Forme
Nombre
Certaines composantes cellulaires
Décrire très généralement le principe du FACS.
Principe repose sur la séparation des cellules dans un fluide et sur les modulations d’un rayon laser provoquées par les cellules qui le traverse une à une
Comment un flux continu de cellules séparées les unes des autres est-il créé?
Le fluide entraîne une suspension cellulaire à travers une buse, la réduisant en de très fines gouttelettes (ainsi le flux continu de cellules séparées est créé)
Où passent les gouttelettes ensuite?
Passent à travers un rayon laser qui est dévié proportionnellement à la taille et la forme des cellules
Si un marquage a été réalisé avant l’essai, qu’est-ce qui est produit et détecté?
Fluorescence
Doit-on utiliser un seul colorant fluorescent?
Non, on peut en utiliser plusieurs si l’appareil est muni des détecteurs appropriés
Décrire rapidement comment nous allons réaliser le FACS.
Ac monoclonaux conjugués à un colorant fluorescent lient spécifiquement des Ag de surface des cellules : «Étiquetage» permet ensuite l’identification des cellules à analyser par la détection de fluorescence
Comment extrait-on les cellules de la rate et du thymus à partir des tissus homogénéisés?
Cellules extraites par tamisage
Que fait-on avec les cellules avant de les analyser pour optimiser l’analyse au cytomètre de flux?
Dénombrer les cellules et ajuster leur concentration
Comment évalue-t-on la concentration de cellules extraites du thymus?
Grâce au protocole de décompte cellulaire
Quels marquages sont nécessaires pour la calibration du cytomètre de flux?
Marquages simples : Ac anti-CD4, Ac anti-CD8 et Ac anti-B220
Si on veut attendre plus que 24h avant l’analyse des cellules passées au tamis, qu’est-il recommandé de faire?
Fixer les cellules en les incubant dans une solution de paraformaldéhyde 4% avant de les suspendre dans le tampon FB
Quelle est la méthode habituelle pour la détermination du nombre de cellules en suspension?
Décompte avec l’hématimètre
Comment fonctionne l’hématimètre?
Hématimètre rempli d’une suspension cellulaire par capillarité. Coloration avec Trypan bleu : permet de mesurer la viabilité des cellules d’une suspension (cellules mortes deviennent bleues), visualiser plus facilement toutes les cellules
Quel est le modèle d’hématimètre le plus couramment utilisé?
AO-Spencer Bright-Line avec la chambre Neubauer modifiée
Combien de chambres principales contient l’hématimètre, combien de carrés de quelle dimension possèdent les chambres et quelle est la profondeur des carrés?
2 chambres principales
9 grands carrés de 1 mm2 de surface par 0,1 mm de profondeur
Combien de ml de la suspension contient chaque grand carré?
1 * 10^-4 ml (donc nb de cellules dans un grand carré = nb de cellules dans 1 * 10^-4 ml –> si on multiplie par 10^4, ça donne le nb de cellules dans 1 ml*** tenir en compte le facteur de dilution résultant du mélange de cellules avec le colorant)
Quelle est l’équation générale qui permet de déterminer le nombre de cellules par ml avec la méthode de l’hématimètre?
Cellules / ml = Nombre de cellules comptées (16 petits carrés) * 10^4 *facteur de dilution
Entre combien et combien de cellules doit-on avoir dans notre suspension cellulaire pour que l’erreur statistique soit acceptable?
Entre 100 et 500
À combien de % correspond l’erreur théoriquement acceptable pour 100 cellules?
10%
À combien de % correspond l’erreur théoriquement acceptable pour 500 cellules?
5%
Combien de chiffres significatifs est-il justifié d’utiliser pour l’estimation de la viabilité avec un colorant comme le Trypan bleu?
2 chiffres significatifs et moins
Entre quel et quel pourcentage de viabilité peut-on espérer d’obtenir?
Entre 60 et 90%
Quelles sont les 3 sources d’erreurs principales possibles lors du décompte cellulaire à l’aide d’un hématimètre?
Remplissage inadéquat des cellules dans les chambres de l’hématimètre
Suspension cellulaire non homogène
Faible reproductivité
Comment peut-on s’assurer d’éviter d’avoir un remplissage inadéquat des cellules dans les chambres de l’hématimètre?
Remplir les chambres par action capillaire en un seul mouvement, sans surcharge
Éviter les bulles d’air
S’assurer que la pipette et l’hématimètre sont propres
Chambres nettoyées après chaque usage
Hématimètre doit être nettoyé à nouveau si la suspension ne se distribue pas rapidement et uniformément
Comment doit-on nettoyer l’hématimètre?
Avec de l’eau, puis avec de l’alcool 70%
Quel pourcentage de cellules que nous observons doivent être libres de tout contact cellulaire?
Plus de 90%
Que peut-on faire pour éviter d’avoir une suspension cellulaire non homogène?
Suspendre adéquatement l’échantillon
Réduire l’agrégation en préparant le suspension avec une solution saline dans Ca2+ si Mg2+, ou de l’acide citrique
Comment régler un problème de faible reproductibilité?
Adopter un système de convention personnel pour le décompte cellulaire
Standardiser la suspension, la concentration et le type de colorant ainsi que le temps de contact après l’addition du colorant
Combien de temps devrait durer le temps de contact après l’addition du colorant? Quel est le temps maximal?
Entre 5 et 10 min
Temps maximal : 15 min
Pourquoi ne faut-il pas trop remplir la chambre ou ne pas la remplir suffisamment?
Car cela entraîne un décompte cellulaire inexact puisque le volume effectif dans les carrés n’est pas le volume attendu
