Séances 3 et 4 : ELISA Flashcards
Que veulent dire les lettres de ELISA?
Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay
Sur quoi est basé l’ELISA?
Essai basé sur la liaison Ag-Ac dans lequel une des molécules est fixée à un support solide (phase solide) et dont la détection repose sur l’activité d’une enzyme
Que permet l’ELISA?
Détecter ou doser des substances biologiques principalement de nature protéique
Pourquoi l’ELISA est l’essai le plus largement utilisé?
À la fois sensible et spécifique et simple à réaliser
Quels sont les 2 grands types d’ELISA?
Indirect et direct
Quelle est la différence entre l’ELISA direct et indirect?
Direct : Ac immobilisé à la phase solide
Indirect : Ag immobilisé
À quoi sert l’ELISA de type indirect?
Détecter l’Ac correspond à l’Ag immobilisé sur la phase solide
Si un Ac peut être immobilisé sans que sa reconnaissance à l’Ag ne soit affectée, quel type d’ELISA peut être mis au point pour détecter la présence de l’Ag?
ELISA de type Sandwich
Quel type d’essai est utilisé pour détecter les Ac anti-VIH présents dans un sérum?
ELIA de type indirect
Quel type d’essai est utilisé pour détecter des cytokines lors d’une réponse immunitaire?
ELISA de type sandwich
Qu’est-ce qui permet le fait qu’on peut détecter une substance biologique?
Le fait qu’une enzyme peut être couplée à un Ac sans affecter l’activité de chacun : enzyme catalyse la formation d’un produit qui peut être facilement détecté et dosé
Comment peut-on nommer l’anticorps couplé à l’enzyme?
Ac de détection ou Ac secondaire
Qu’est-ce que l’Ac secondaire reconnaît?
Ac à doser (Ac primaire) ou Ag directement
Comment peut-on mesurer le produit coloré formé par la réaction?
Par spectrophotométrie
Pourquoi dit-on que l’essai est quantitatif?
Puisque l’intensité de la coloration observée est proportionnelle à la quantité d’Ac (ou Ag) présente.
Pourquoi l’ELISA serait-il difficile, voire impossible sans immobilisation?
Car chaque composante est ajoutée une après l’autre et cela est suivi de plusieurs lavages (un à chaque composante ajoutée) afin de se débarrasser des molécules non liées.
Sans immobilisation, les composantes qu’on veut mesurer seraient simplement lavées
Quels sont les matériaux les plus populaires comme phases solides?
Billes, disques, éprouvettes, microplaques en polystyrène ou en polyvinyle
Quels facteurs sont importants pour optimiser la liaison à la plaque?
Type de tampon
Quantité d’Ag
Température
Durée du traitement
Comment contre-t-on le problème que les Ac ont tendance à s’attacher de façon non spécifique au plastique ou aux substances qui y sont fixées?
Saturer la plaque d’une protéine qui n’est pas impliquée dans la réaction Ac-Ag (étape de blocage)
Quelle protéines utilise-t-on généralement pour le blocage?
Gélatine de poisson, caséine ou BSA
Pourquoi la BSA ne peut pas être utilisée comme protéine de blocage dans l’essai que nous avons fait en laboratoire? (question stupide!)
Car nous analysons des Ac anti-BSA (la BSA est utilisée comme protéine pour capter les Ac)
Qu’est-ce qui est important de faire entre chaque ajout de réactif?
Retirer complètement l’excès d’un réactif avant d’en ajouter un autre
Comment contre-t-on les liaisons faibles non spécifiques?
En mettant un détergent (Tween-20) dans la solution de lavage et en mettant la protéine inerte ayant servi au blocage ainsi que le détergent dans pratiquement toutes les solutions utilisées
Quelles sont les enzymes les plus souvent couplées aux Ac de détection?
Peroxydase, phosphatase alcaline et la bêta-galactosidase
Quelles sont les caractéristiques idéales pour l’enzyme couplée et son substrat?
Enzyme : stable et très active
Substrat : stable, peu dispendieux et non toxique
Quelles seront les caractéristiques du produit formé?
Soluble et de couleur intense
Quels sont les critères permettant de déterminer l’enzyme à utiliser pour l’essai?
Niveau de sensibilité souhaité
Rapidité de réaction
Quelle enzyme et quel substrat ont été utilisés dans l’essai effectué au laboratoire?
Peroxydase et substrat tétraméthyl benzidine (TMB)
Comment dilue-t-on les Ac à doser et comment calcule-t-on habituellement la valeur du titre?
Dilués en série doublante ou décimale
Titre calculé à partir de la courbe standard d’un Ac connu
Si le titre ne peut pas être calculé selon une courbe standard, comment le calcule-t-on?
En trouvant la dilution ultime donnant encore une absorbance supérieure au seuil de positivité
Comment calcule-t-on le seuil de positivité dans notre essai?
Positif si : A450 avec Ag - A450 sans Ag > 0,2
Comment se nomme la courbe formée par la méthode graphique?
Courbe sigmoidale
Quelles sont les trois zones de la courbe formée par la méthode graphique?
Zone de dilutions linéaires de l’Ac
Zone d’excès d’Ac
Zone d’excès d’Ag
Quelle zone est utilisée pour la détermination du titre par la méthode graphique?
Zone de dilutions linéaires
Comment détermine-t-on le titre par la méthode graphique?
Seuil de positivité déterminé par le point de rencontre entre la prolongation de la portion linéaire et la courbe du témoin sans Ag : titre = dilution ultime donnant encore une absorbance supérieure au seuil de positivité (titre = inverse de la dilution qui précède le point de rencontre)
Quels sont les deux antisérums testés dans l’essai effectué au laboratoire?
Antisérum de lapin prélevé suite à une immunisation avec le BSA
Extrait d’IgY (Ac purifiés à partir du jaune d’oeuf d’une poule également immunisée avec le BSA)
Quels sont les 3 témoins à effectuer pour l’essai?
Sans Ag
Sans Ac primaire
Sans Ac primaire et secondaire
Que doit-on ajouter à la solution de blocage lorsque le blocage dure plus de 24h?
Azoture de sodium (NaN3) (toxique!!!)
