Scéance G Flashcards

1
Q

Décrire de manière générale les grandes étapes d’un SDS-PAGE

A
  1. Préparation de l’échantillon
  2. Préparation du gel
  3. Chargement de l’échantillon
  4. Migration des protéines
  5. Coloration du gel
  6. Analyse des résultats
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2
Q

Avantage de Laemmli?

A

Cette approche permet l’utilisation de larges volumes (dizaines de µL) d’échantillon.

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3
Q

Décrit shématiquement un système électrophorétique de type Laemmli

A
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4
Q

Le tampon où est dissous l’échantillon comprend plusieurs composantes avec des rôles spécifiques pendant l’électrophorèse. Nommes les et leur rôles (3)

A

Glycérol : visqueux et très dense facilite la sédimentation au fond du puits

Mercaptoéthanol : dénaturation protéique par réduction des ponts disulfures

Bleu de bromophénol : petite molécule colorée permet de suivre la progression de la migration

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5
Q

Quelles ions retrouve-t-on dans dans les gels et quelles sont leurs rôles?

A

Chlorure : ion leader plus petit (présence dans gels)

Glycine : ion retardataire plus gros (sensible au pH, présence dans tampon électrode pH 8.3)

*Tris ( contre ion ) chargé positivement à une faible mobilité et aura peu d’influence

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6
Q

Ces quoi l’Isotachophorèse

A

Technique d’électrophorèse où les ions (ou molécules chargées) migrent en formant des zones distinctes à vitesse constante

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7
Q

Comment fonctionne l’Isotachophorèse

A

L’isotachophorèse aligne les molécules en bandes nettes grâce à des tampons de mobilités ioniques différentes qui forcent une migration uniforme à vitesse constante.

Un électrolyte de tête (Leader) : Avec une haute mobilité ionique. (Cl-)

Un électrolyte de queue (Trailer) : Avec une faible mobilité ionique Ions (glycinate)

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8
Q

3 méthodes de détections des bandes protéines post-éléctrophoreses

A

Détection avec des colorants organiques :
- Coomassie Brilliant Blue R250

Détection avec des sondes fluorescentes :
- Sondes de type SPYRO

Détection par liaison d’un métal :
- Coloration à l’argent par
réduction du métal

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9
Q

Méthode Coomassie

A

En conditions acidiques ( acide acétique), le colorant lie les chaînes latérales basiques des protéines
(His , Lys, Arg)

Le nombre de molécules de Coomassie liées est proportionnel au nombre de résidus basiques.

Génère un coloration bleue
(max absorbance à 595 nm)

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10
Q

Méthode SYPRO

A

Utilisation de sondes fluorescentes

Procédure de coloration simple

Quantification linéaire sur 3 ordres de grandeur

Compatibilité avec la spectrométrie de masse

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11
Q

Coloration à l’argent

A

Méthode colorimétrique la plus sensible

Les ions argent présents dans le réactif se lient aux groupements COOH ( Asp , Glu), imidazole (His), sulfhydryles (Cys) et amines (Lys)

Certains protocoles avec cette approche peuvent détecter jusqu’à 0,5 ng de protéine.

Incompatible avec le spectre de masse

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12
Q

Décrire le calcul du PM d’une protéine inconnue

A

Tracer une courbe étalon
Mesurer la migration de la protéine inconnue
Interpoler le PM

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