Scéance G Flashcards
Décrire de manière générale les grandes étapes d’un SDS-PAGE
- Préparation de l’échantillon
- Préparation du gel
- Chargement de l’échantillon
- Migration des protéines
- Coloration du gel
- Analyse des résultats
Avantage de Laemmli?
Cette approche permet l’utilisation de larges volumes (dizaines de µL) d’échantillon.
Décrit shématiquement un système électrophorétique de type Laemmli
Le tampon où est dissous l’échantillon comprend plusieurs composantes avec des rôles spécifiques pendant l’électrophorèse. Nommes les et leur rôles (3)
Glycérol : visqueux et très dense facilite la sédimentation au fond du puits
Mercaptoéthanol : dénaturation protéique par réduction des ponts disulfures
Bleu de bromophénol : petite molécule colorée permet de suivre la progression de la migration
Quelles ions retrouve-t-on dans dans les gels et quelles sont leurs rôles?
Chlorure : ion leader plus petit (présence dans gels)
Glycine : ion retardataire plus gros (sensible au pH, présence dans tampon électrode pH 8.3)
*Tris ( contre ion ) chargé positivement à une faible mobilité et aura peu d’influence
Ces quoi l’Isotachophorèse
Technique d’électrophorèse où les ions (ou molécules chargées) migrent en formant des zones distinctes à vitesse constante
Comment fonctionne l’Isotachophorèse
L’isotachophorèse aligne les molécules en bandes nettes grâce à des tampons de mobilités ioniques différentes qui forcent une migration uniforme à vitesse constante.
Un électrolyte de tête (Leader) : Avec une haute mobilité ionique. (Cl-)
Un électrolyte de queue (Trailer) : Avec une faible mobilité ionique Ions (glycinate)
3 méthodes de détections des bandes protéines post-éléctrophoreses
Détection avec des colorants organiques :
- Coomassie Brilliant Blue R250
Détection avec des sondes fluorescentes :
- Sondes de type SPYRO
Détection par liaison d’un métal :
- Coloration à l’argent par
réduction du métal
Méthode Coomassie
En conditions acidiques ( acide acétique), le colorant lie les chaînes latérales basiques des protéines
(His , Lys, Arg)
Le nombre de molécules de Coomassie liées est proportionnel au nombre de résidus basiques.
Génère un coloration bleue
(max absorbance à 595 nm)
Méthode SYPRO
Utilisation de sondes fluorescentes
Procédure de coloration simple
Quantification linéaire sur 3 ordres de grandeur
Compatibilité avec la spectrométrie de masse
Coloration à l’argent
Méthode colorimétrique la plus sensible
Les ions argent présents dans le réactif se lient aux groupements COOH ( Asp , Glu), imidazole (His), sulfhydryles (Cys) et amines (Lys)
Certains protocoles avec cette approche peuvent détecter jusqu’à 0,5 ng de protéine.
Incompatible avec le spectre de masse
Décrire le calcul du PM d’une protéine inconnue
Tracer une courbe étalon
Mesurer la migration de la protéine inconnue
Interpoler le PM